Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).
“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.
"Centromeres" प्रतिष्ठित आनुवंशिकी में दबा दिया meiotic पुनर्संयोजन के क्षेत्रों के रूप में परिभाषित किया गया और बाद में mitotic गुणसूत्रों के प्राथमिक कसना है, जो बँटवारा दौरान सटीक गुणसूत्र अलगाव में एक आवश्यक भूमिका निभाता है के रूप में मान्यता दी। "गुणसूत्रबिंदुओं" बहुपरती संरचनाओं कि centromeres की सतह पर सूक्ष्मनलिकाएं करने के लिए बाध्य, के रूप में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पता चला है के रूप में वर्णित किया गया; "गुणसूत्रबिंदुओं" बाद में macromolecular जटिल है कि mitotic गुणसूत्रों के गुणसूत्रबिंदु पर localizes के रूप में परिभाषित किया गया। रीढ़ के बीच centromeric डीएनए दृश्यों का एक नाटकीय विचलन के बावजूद, kinetochore संरचना और संरचना अत्यधिक संरक्षित कर रहे हैं। धुरी सूक्ष्मनलिकाएं और kinetochore के बीच एक गतिशील बातचीत बँटवारा दौरान गुणसूत्रों के वफादार अलगाव के लिए आवश्यक है, और aneuploidy और इस तरह के कैंसर के लिए गुणसूत्रबिंदु-kinetochore समारोह नेतृत्व में दोष है।
सबसे eukaryotes में गुणसूत्रबिंदुकोई परिभाषित डीएनए अनुक्रम है, लेकिन दोहराए alphoid 171-बीपी α-उपग्रह डीएनए से मिलकर डीएनए की बड़ी सरणियों (.3-5 एमबी) से बना है। नवोदित खमीर में छोड़कर, गुणसूत्रबिंदु पहचान डीएनए अनुक्रम से नहीं बल्कि एक विशेष nucleosome कि हिस्टोन H3 संस्करण CenH3 शामिल की मौजूदगी से हासिल की है (गुणसूत्रबिंदु एक प्रोटीन [CENP-ए] मानव में)। 5 CENP-ए nucleosomes को स्थानीय बनाना स्तनधारी गुणसूत्रबिंदुओं 7 और 171-बी पी α-उपग्रह डीएनए के लिए बाँध के भीतरी थाली। सक्रिय centromeres आवश्यकता CENP-ए-युक्त nucleosomes एक विधान गुणसूत्रबिंदु जुड़े नेटवर्क (CCAN) और kinetochore प्रोटीन की भर्ती करने के लिए प्रत्यक्ष, जो एक साथ धुरी जांच की चौकी के माध्यम से mitotic धुरा और बाद में चक्र प्रगति के गुणसूत्रों की कुर्की विनियमित।
ऊपर साक्ष्य के आलोक में, CENP-ए गुणसूत्रबिंदु 8 की epigenetic मार्क किए जाने का प्रस्ताव किया गया है; हालांकि, इस प्रक्रिया है जिसके द्वारा CENP-ए मैं शामिल हैNto centromeric डीएनए और कारकों इस समावेश के लिए जिम्मेदार अभी तक अच्छी तरह से होती नहीं किया गया है। एक छोटी-गुणसूत्रबिंदु को निशाना डोमेन (CATD) हिस्टोन में रहता है CENP-ए का क्षेत्र गुना, और CATD साथ H3 की इसी क्षेत्र के प्रतिस्थापन गुणसूत्रबिंदु के लिए सीधी H3 करने के लिए पर्याप्त है। 9 कई अध्ययनों बाद translational के लिए कार्यात्मक भूमिका का सुझाव दिया संशोधन CENP-ए 12-16 की (PTM); हालांकि, centromeres पर भर्ती में CENP-ए का इन PTMs के आणविक तंत्र अभी तक स्पष्ट नहीं किया गया है। हम पहले से सूचित किया है कि CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase गतिविधि CENP-ए K124 ubiquitylation और centromeres को CENP-ए का स्थानीयकरण के लिए आवश्यक है। 17
खोज और kinetochore प्रोटीन के लक्षण वर्णन गुणसूत्र अलगाव के बारे में नई जानकारी के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। 18 अधिक 100 से kinetochore घटकों विभिन्न दृष्टिकोणों से कशेरुकी कोशिकाओं में पहचान की गई है। 19,20 के तहत एकप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में। कैसे गुणसूत्रबिंदुओं इकट्ठा और समारोह भी कोशिकाओं के भीतर प्रत्येक गुणसूत्रबिंदु-kinetochore प्रोटीन और प्रोटीन, प्रोटीन नेटवर्क के सेलुलर कार्यों के लक्षण वर्णन से आता है के खड़े 19 प्रत्यक्ष दृश्य और उन्नत इमेजिंग तरीकों गुणसूत्रबिंदु-kinetochore घटकों की उल्लेखनीय संकल्प प्रदान और अनुमति centromeres और गुणसूत्रबिंदुओं के विशिष्ट आणविक घटकों के प्रत्यक्ष अवलोकन। इसके अलावा, अप्रत्यक्ष immunofluorescent के तरीकों (आईआईएफ) विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग धुंधला इन टिप्पणियों के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, IIF प्रोटोकॉल, कुछ विशिष्ट गुणसूत्रबिंदु-kinetochore प्रोटीन के विस्तार में चर्चा की समस्याओं के बारे में कई रिपोर्टों के बावजूद। 1-4 इस प्रकार, विकासशील और रिपोर्टिंग IIF धुंधला हो जाना और एक मात्रात्मक IIF परख के तरीकों विशेष रूप से प्रत्येक गुणसूत्रबिंदु-kinetochore प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। IIF धुंधला में, एक ब्याज की प्रोटीन के नुकसान से बचने के लिए धुंधला प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना चाहिए यासेल के बाकी। हालांकि, कभी कभी निर्धारण प्रतिजनी साइटों को नष्ट कर देता है, और विभिन्न एंटीबॉडी प्रतिजन संयोजन एक लगानेवाला के साथ खराब काम करते हैं, लेकिन बहुत अच्छी तरह से एक, 21 और लगानेवाला के विकल्प के साथ बड़े पैमाने पर ब्याज की प्रोटीन (ओं) पर निर्भर करता है। इसलिए, विभिन्न तरीकों लगानेवाला गुणसूत्रबिंदु-kinetochore प्रोटीन के IIF धुंधला में महत्वपूर्ण हैं।
अप्रत्यक्ष immunofluorescent (आईआईएफ) धुंधला हो जाना और CENP-ए और फ्लैग टैग बहिर्जात CENP-ए प्रोटीन, और मानव कोशिकाओं में इन प्रोटीनों की quantitation सहित अंतर्जात गुणसूत्रबिंदु-kinetochore प्रोटीन, के स्थानीयकरण संबोधित करने के लिए एक परख के यहां अनुकूलित तरीके विकसित किया गया है। इन विधियों अन्य प्रजातियों में गुणसूत्रबिंदु-kinetochore प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है।
हाल के वर्षों में कई अध्ययनों गुणसूत्रबिंदु-kinetochore जीव विज्ञान में तय की कोशिकाओं के लिए अलग मात्रात्मक माइक्रोस्कोपी assays विकसित किया है। 42 प्रगति अक्सर प्रोटीन के गुणसूत्रबिंदु विशेष या kinetochore विशे?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम एनआईएच अनुदान GM68418 द्वारा समर्थित किया गया।
Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | transfection reagent I |
Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | transfection reagent II |
Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use |
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well polystyrene plate |
Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining) |
Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol for mitotic cell analysis |
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 for mitotic cell analysis |
BSA (bovine serum albumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blocking reagent |
Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergent for permeabilization |
Paraformaldehyde | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixation reagant |
DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-CENP-B antibody | abcam | ab25734 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-centromere antibody (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | BD | 612142 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-I antibody | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
Anti-KNL1 antibody | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | GeneTex | GTX110735 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Ska1 antibody | abcam | ab46826 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CUL4A antibody | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
Anti-RBX1 antibody | Cell Signaling | 4397 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB) |
Anti-GAPDH antibody | Chemicon | MAB374 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Skim milk |
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | motorized fluorescence microscope | |
HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X oil immersion lens |
HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X oil immersion lens |
Leica EL6000 compact light source | Leica | External compact light source for fluorescent excitation | |
ORCA-R2 Digital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | digital CCD camera |
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS) |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF membrane for transferring |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Rabbit DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | Infrared imaging system for immunoblot detection | |
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemiluminescence imager for immunoblot detection | |
Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | Software D | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |