溶瘤病毒疗法正在被开发作为治疗肝细胞癌（HCC）的新型治疗方法。本文介绍了一种通过肝动脉给予溶瘤病毒进行HCC局部区域治疗的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
肝细胞癌（HCC）是一种治疗选择有限且预后较差的疾病。近年来，溶瘤病毒疗法已被证明是抗击恶性肿瘤的潜在有力工具。由于肝脏具有独特的双重血液供应，可对原位肝肿瘤进行局部治疗，这些肿瘤主要由动脉血流供血。我们此前已证明，通过肝动脉递送溶瘤病毒可安全高效地转导多灶性HCC病灶，显著延长免疫功能健全大鼠的生存期。该操作方式与临床上对许多HCC患者实施的标准姑息治疗——经动脉栓塞术——高度相似。在大鼠中通过肝动脉给予肿瘤治疗的能力，为评估正在研发的新型病毒载体提供了一个高度复杂的临床前模型。本文详细描述了用于输注溶瘤病毒载体以治疗原位HCC的肝动脉显微解剖操作步骤。
引言
肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因，因此构成了重大的健康问题1,2。对于不符合肿瘤切除条件或正在等待肝移植的患者，通常采用经动脉栓塞（TAE）或经动脉化疗栓塞（TACE）等局部区域治疗作为标准姑息治疗手段3,4。这些疗法利用了肝脏独特的双重血液供应特征：肿瘤几乎完全由肝动脉供血，而周围正常肝组织的血液供应则主要来自门静脉5,6。
由于目前治疗肝细胞癌（HCC）的现有疗法疗效极为有限，溶瘤病毒已成为颇具前景的替代治疗手段。JX-594（最近更名为Pexa-Vec）是一种胸苷激酶缺失的痘苗病毒载体，携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因，已完成了针对HCC的II期临床试验7。最近，一种表达人干扰素-β的重组水疱性口炎病毒载体（VSV）已进入针对索拉非尼耐药性HCC的I期临床试验（NCT01628640）。随着溶瘤病毒逐渐接近获得用于HCC患者临床应用的批准，迫切需要一种有效的给药途径以靶向多灶性病灶。尽管全身给药由于肿瘤转导效率低下而效果甚微，但瘤内注射可能使治疗效果局限于被注射的肿瘤，导致无法注射的微小病灶仍易发生疾病进展。
我们已建立一种在大鼠中分离肝动脉的方法，用于以局部区域性方式递送溶瘤病毒治疗原位肝细胞癌（HCC）。我们已证明，该给药途径可安全有效地转导多灶性HCC结节，显著延长免....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：以下步骤均依照本机构及德国巴伐利亚州当地政府的相关规定执行。任何尝试重复本方案的操作，均须遵守当地动物护理与使用委员会所规定的有关动物人道待遇的本地指南。例如，许多研究机构要求在进行啮齿类动物手术时佩戴无菌手套。 此外，病毒相关操作必须遵循当地法规，注意个人和环境安全。需妥善处理被污染的废弃物，并对仪器和工作区域进行清洁。即， 通过高压灭菌并根据制造商说明使用适当的抗病毒消毒剂进行清洁。
1. 手术开始前的准备工作
- 灭菌手术器械（即， 通过高压灭菌。
- 将病毒稀释至适当浓度，该浓度将根据所用病毒的特异性毒性和大鼠品系的易感性而有所不同。
注意：例如，在雄性水牛鼠中使用水疱性口炎病毒时，我们通常注射107 pfu，即该模型可耐受的最大剂量。- 使用无菌技术预填充病毒 在1 ml注射器中装入，并连接30 G针头，注意排除注射器和针头中的空气。
- 在手术区域准备好所需的所有材料和设备，并用乙醇喷洒消毒。取一小容器盛装无菌生理盐水（0.9% NaCl），用于润湿纱布和棉签。
2. 大鼠的准备
- 在开始手术程序前30分钟，按照当地动物护理与使用委员会规定，给予适当剂量的镇痛剂。例如，给予高....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
随着经验的积累，成功率几乎可达100%（即成功分离并注射动脉，且动物术后存活）。然而，大鼠术前的健康状况（肿瘤负荷程度、基础肝功能） 等等。) 显然会影响手术干预的结果。术后大鼠可能会出现短暂的体重下降以及肝酶轻度、短暂性升高，即使注射的仅为缓冲液而未含病毒。
我们此前已证明，在原位多灶性肝细胞癌（HCC）模型中，经肝动脉途径给予溶瘤型水疱性口炎病毒（VSV）或新城疫病毒（NDV）可实现高效的肿瘤转导及肿瘤特异性病毒复制8,9。尽管这两种病毒在瘤内复制动力学上存在差异，但在各自病毒复制达到峰值的时间点，仅在HCC结节内可观察到大量病毒传播灶，表现为LacZ报告基因的阳性酶染信号，而周围正常肝组织未见病毒复制迹象（图3 和 图4，先前发表的数据8,9）。此外，对随机选取的VSV治疗组肿瘤结节进行形态计量学分析表明，肿瘤转导效率.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
尽管直接瘤内注射无疑是实现单个肿瘤结节高效转导的最简单方法，但肝动脉灌注是靶向多灶性、原位肝细胞癌（HCC）的理想给药途径。该方法在使用溶瘤病毒治疗免疫功能健全大鼠的HCC时，已被证实安全且有效。此外，由于HCC患者通常接受经动脉化疗栓塞治疗，因此本文所述方法可直接转化为临床应用。
在临床前啮齿类动物模型中，经肝动脉递送肿瘤治疗药物的一个明显缺点是该操作具有侵入性，且需要较长的时间，包括手术过程本身以及术后对大鼠的护理。研究人员若希望掌握这一技术，必须投入大量时间进行练习，以达到操作熟练，从而获得可重复的实验结果和较高的存活率。此外，由于肝动脉直径极小，迄今为止尚无在小鼠中实施肝动脉输注的报道。这是一个遗憾，因为肝细胞癌（HCC）的遗传学模型主要是在小鼠中构建的，因此我们目前只能在大鼠的移植性或化学诱导性HCC模型中测试经肝动脉给药的治疗方法。而化学诱导HCC本身常伴随普遍的肝毒性，出于安全性考虑，这可能使大鼠无法符合接受此类治疗干预的实验入选标准。
与侵入性的剖腹手术途径进行肝动脉病毒递送相比，理论上可行的方法是通过股动脉插.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国波恩的德国研究基金会（DFG Sonderforschungsbereich 824）资助，项目编号为SFB 824子项目C6和C7。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 兽用剪毛器 | Aesculap | GT415 | 小巧、无线设计的修剪器，适用于清除手术区域的毛发 |
| 体视显微镜 | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G 针头 | Braun | 4656300 | 30 G x ½” |
| 1 ml 注射器 | Braun | 9161406V | 结核菌素注射器 |
| 一次性手术刀 | Feather | 2975#15 | #15 刀片 |
| 标准外科剪刀 | Fine Science Tools | 14001-13 | 尖头/钝头，用于切开皮肤和肌肉 |
| 艾德森齿镊 | Fine Science Tools | 1101-12 | 带齿，用于夹持皮肤和肌肉 |
| 阿尔姆拉钩 | Fine Science Tools | 17008-07 | 带钝齿，用于术中撑开腹腔 |
| 纱布拭子 | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 cm × 7.5 cm，使用前应高压灭菌 |
| 棉签拭子 | Lohmann & Rauscher | 11970 | 无菌 |
| 细尖镊子 | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 mm，弯头，用于解剖肝动脉 |
| 万纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 91500-09 | 用于精细切割 |
| 显微持针器 | Fine Science Tools | 12076-12 | 用于结扎胃十二指肠动脉 |
| 持针器 | Fine Science Tools | 12005-15 | 碳化钨咬合面 |
| 7-0 Prolene 缝线 | Ethicon | 8648H | 带弯针的聚丙烯缝线，用于结扎胃十二指肠动脉 |
| 4-0 Vicryl 缝线 | Ethicon | V3040H | 附带弯针 |
| 红外保温灯 | Beurer | IL11 | 用于术后维持体温 |
参考文献
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study. Science. 274, 740-743 (1996).
- Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 94, 153-156 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
