Introduction
Hepatosellüler karsinom (HCC) dünya çapında beşinci en yaygın kanser ve önemli bir sağlık sorunu 1,2 yapma kansere bağlı ölümlerin üçüncü lider nedenidir. Transarteryal embolizasyon (TAE) ya da transarteryal kemoembolizasyon (TACE) içeren tümör rezeksiyonu veya bu bekleyen karaciğer nakli, lokal tedavi için uygun olmayan hastalar için standart palyatif bakım 3,4 olarak uygulanır. Çevreleyen karaciğer portal ven 5,6 onun kan kaynağının çoğunluğunu alırken bu tedaviler, tümörler hepatik arter kan akışının neredeyse sadece beslenen sayede karaciğerde ikili kan kaynağının benzersiz bir özellik istifade eder.
HCC için mevcut tedavilerin son derece sınırlı etkinliklerinin nedeniyle, onkolitik virüs umut verici bir alternatif terapötik maddeler olarak ortaya çıkmıştır. JX-594, son zamanlarda PEXa-VEC adını, bir timidin kinaz silinmiş aşı vektörü, granülosit-m ile silahlı olduğunuHCC 7 Faz II klinik deneme tamamladı acrophage koloni uyarıcı faktör (GM-CSF). Daha yakın bir zamanda, insan interferon-beta ifade eden bir yeniden birleştirici veziküler stomatit virüs vektörü (VSV), sorafenib dirençli HCC (NCT01628640) bir safha I klinik deneme girmiştir. onkolitik virüsler yakın hastalarda HCC için klinik uygulama için onay alma taşımak gibi, etkili bir uygulama yolu için ihtiyaç multifokal hastalık açıktır hedef. Sistemik teslim verimsiz tümör iletimi için büyük ölçüde etkisiz olmakla birlikte, tümör içi uygulamalar hastalığın ilerlemesine karşı duyarlı uninjectable mikroskobik lezyonlar bırakarak, enjekte edilen tümör tedavisinin etkinliğini sınırlayabilir.
Biz ortotopik HCC hedeflemek için lokoregional şekilde onkolitik virüs tedavisi yönetmek için sıçanlarda hepatik arter izole bir yöntem kurduk. Biz göstermiştir ki güvenli ve verimli olarak bu yönetim rota sonuçlarıBağışıklık yetkili sıçanlarda 8-10 anlamlı sağkalım uzaması sonucu, multifokal HCC nodüllerin transdüksiyonunu ettik. Burada, biz, erişme diseksiyon ve sıçanlarda hepatik artere enjekte yöntemi tarif etmektedir. Prosedürün bir şema, Şekil 1 'de gösterilmiştir (daha önce 9 yayınlanmıştır)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aşağıdaki adımlar kurumumuzun kuralları ve Bavyera, Almanya'nın yerel yönetimler çerçevesinde yapılmıştır. Yerel hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından dikte edildiği gibi bu protokolü üretmek için tüm girişimler, hayvanların insanca tedavi için yerel kurallarına bağlı kalınarak yapılmalıdır. Örneğin, birçok enstitü steril eldivenler kemirgen ameliyat sırasında giyilen gerektirir. Ayrıca, virüsler ile çalışma, kişisel ve çevre güvenliği için dikkat çekici, yerel yönetmeliklere göre yapılmalıdır. Bakım düzgün kontamine atık imha etmek ve (otoklav ve üreticinin talimatlarına göre uygun bir antiviral dezenfektanla temizleyerek, yani) aletleri ve çalışma alanı temizlemek için alınmalıdır.
Başlangıç Cerrahi öncesi 1. Hazırlıklar
- (Otoklav yoluyla, yani) cerrahi aletler sterilize.
- appropr virüs seyreltinkullanılan spesifik virüs toksisitesi ve sıçan soyunun duyarlılığına bağlı olarak değişecektir iate konsantrasyonu.
Not: bir erkek Buffalo sıçanlarda veziküler stomatit virüsü kullanılarak, örneğin,, genellikle bu modelde maksimum tolere edilen doz, 1 ml hacim içinde 10 7 PFU enjekte edilir.- 1 mi şırıngalarda (aseptik teknik kullanılarak) virüs önceden doldur ve şırınga ve iğne hava ortadan kaldırmak için dikkat edilerek, 30 G iğne ekleyin.
- gerekli tüm malzeme ve ekipman ile cerrahi alan hazırlayın ve dezenfekte etmek için etanol ile bölgeyi püskürtün. gazlı çubukları ve pamuk uçlu aplikatörler nemlendirilmesi steril tuzlu su çözeltisi (% 0.9 NaCl) ile küçük bir kap doldurun.
Sıçan 2. Hazırlık
- (Yerel hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından belirtildiği gibi) uygun doz 30 dakikada önce cerrahi prosedür başlamadan, bir analjezik uygulayın. Örneğin,metamizol yüksek bir doz (100-200 mg / kg) tatbik.
- Inhalasyon (izofluran) ya da enjekte edilebilir (örneğin, MMF şekilde bilinmektedir medetomidin bir karışımı (0.15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg) ve fentanil (0.005 mg / kg),) anestezi kullanılarak sıçan anestezisi. % 1-3 bir buharlaştırıcı vasıtasıyla isolflurane yönetmek ve normal solunumu ve kalp hızını devam ettirebilmek için gerektiği gibi ayarlayın.
- Devam etmeden önce, sıçan tamamen uyuşturulmuş ve ayak pedi kısma ve bir reaksiyon için gözlemleyerek ağrı hissediyorum mümkün olduğundan emin olun.
- anestezi sırasında kurumasını önlemek için bir veteriner göz merhemi sürün.
- sadece küçük bir veteriner saç kesme makinesi kullanarak genital üzerinde aşağı sternum karın alan tıraş. Cildi zarar vermeden yakın bir tıraş elde etmek için özen gösterin.
- inhalasyon anestezi ile, uygun bir büyüklükte burun konisi içine burun yerleştirirseniz, ön ve arka ayakların üzerinde bant kullanarak cerrahi yatağa sıçan düzeltmek ve. bir ısıtma yastığı yerleştirinSıçan altında vücut ısısını korumak için. antiseptik boya bir alkol çalkalama ve uygulama, ardından cerrahi sınıfa ait bir dezenfektan ile karın bölgesi, dezenfekte.
3. Laparotomi
- Böyle 15. olarak, küçük bir eğri neşter kullanılarak, doğrudan orta hat boyunca deri tabakası içinde küçük bir dikey bir kesi yapmak. xiphoid sürecine kadar kesi uzatın. Sonra, yavaşça bir neşter kesi yapmak için Adson forseps bir çift ile kaldırarak kas tabakası kesilirken, ve daha sonra cerrahi makas ile xiphoid sürecine kadar kesi uzatmak. karın boşluğu organları delmek veya xiphoid sürecin her iki tarafında küçük damarları zarar vermemeye özen gösterin.
- kas ve cilt yaymak ve tüm karın bölgesi ortaya çıkarmak için karın karşısında retractor yerleştirin.
- Steril serum fizyolojik ile iki 7.5 x 7.5 cm 2 gazlı bezlerden ıslatın ve cerrahi üst kısmında birini yayıldıŞekil 2A'da gösterildiği gibi, açma ve alt kısmında bir.
Karaciğer Arter 4. İzolasyonu
- yavaşça karın boşluğundan dışarı bağırsak ve çekum kaldırın ve alt gazlı bez üzerine koyun, steril serum fizyolojik ile nemlendirilmiş iki nemli pamuk aplikatör bezlerden kullanarak. nemli organları tutmak için ve yolumdan onları tutmak için üzerine gazlı bez katlayın.
- İki nemlendirilmiş pamuk aplikatör bezlerden kullanarak, yavaşça bu aşamada görünümünde en baskın lob olacak sol lateral karaciğer lobu, yukarı kaldırın. lob tamamen yukarı doğru çevrilmiş ve daha önce yerleştirilen gazlı bez üstünde dinlenmeye sağlayan, lobun alt lifli zarından kesilmiş yaylı makas küçük bir çifti kullanılarak, yukarı lob çevirin ve. yerinde tutmak için lob üzerinde gazlı bez bez katlayın.
- Şimdi görünümünde en ön lob sonraki lobun (anterior kaudat) ile devam edin. thbir mikroskop ve ince forseps e yardım, bırakın ve serbestçe yukarı çevrilmiş izin için lobu çevreleyen ince bir zar teşrih. sol lateral lob ile birlikte gazlı bez bez altına lob yerleştirin.
- artık görünür olacak arka kaudat lobu, gözlemleyin. tamamen arka kaudat lobun incelemek ve yukarı ve gazlı bez içinde birlikte önceden yerleştirilen karaciğer lobları ile çevirmek için adımı yineleyin 4.3.
- Sadece kaudat lobun orijinal konumuna altında, şimdi görünür ve kolayca güçlü nabız tarafından tanınan olacaktır hepatik arter, bulmak. anatomik sağ arter ardından, görünümünden gastroduodenal ve uygun karaciğer arterleri engellemeyecek kalın zar malzeme gözlemlemek. Ince forseps kullanarak, bu malzemeyi yukarı kaldırın ve yavaşça bu alanda herhangi bir küçük damarları önlemek için özen, onu gözyaşı. meydana gelebilecek herhangi bir kanamayı durdurmak için pamuklu aplikatör bezlerden kullanın.
- a bulunmembranlar düzgün disseke zaman bir mikroskop yardımıyla açıkça görünür olacak rterial dalları.
- Iki güzel, atravmatik forseps kullanarak, dikkatli bir hepatik arter, gastroduodenal arter ve onlar çevreleyen zarların (Şekil 2B) kurtulmuş şekilde uygun hepatik arter teşrih.
Enjeksiyon için Arter 5. Hazırlık
- Gastroduodenal arter altında bir 7-0 Prolen sütür geçirin ve sadece çatallanma (uygun yerleştirme için bakınız Şekil 1) Yukarıdaki, uzak ucunda kalıcı bir bitişik harfleri bağlamak için mikro iğne tutucu kullanın. Ucunda kalan dikiş materyali yaklaşık 2 inç izin ve Şekil 2C olarak, öğretilen arteri çekmek için bir iğne tutucu ile kelepçe.
- Geçici olarak kan akımını (Şekil 2C) engellemek için ortak hepatik arter üzerinde küçük bir kelepçe yerleştirin.
Not: Bu impİğne arterden çıkarıldıktan sonra ortant büyük kanamanın önlenmesi için. Bundan başka, kan akışı bloke yavaş virüs yönetim ve daha transdüksiyon verimliliği sağlar.- Önemli: Kan akışı durur o zaman miktarını sınırlamak için hızlı bir şekilde çalışın - hepatik arter sıkma 5 dakika içinde arterin enjeksiyon ve müteakip ligasyonu gerçekleştirin.
- Mümkünse, gastroduodenal arter keskin odak ve doğru 30 G iğne eklemek için yeterince büyük görünen, öyle ki diseksiyon mikroskobu büyütme artırır. gastroduodenal arterin lümenine enjeksiyon şırınga ucunu yerleştirin ve pistonu itmek yavaş yavaş.
Not: İğnenin Uygun yerleşim doğru hepatik arter yoluyla ve karaciğere doğru doğrudan akan enjekte çözüm neden olacaktır.- transdüksiyon verimliliği maksimize etmek çok yavaş enjeksiyon yapın.
<li> tüm enjeksiyon hacmi tatbik edildikten sonra, yavaş yavaş arterden iğne geri.
Not: enjeksiyon yerinde kanama olmamalıdır. meydana gelir kanama durumunda, bu kelepçe düzgün yerleştirilmiş değildir ve hızlı bir şekilde ayarlanması gerektiğini belirtir.
6. Kapanış
- gastroduodenal arter altında ikinci bir 7-0 Prolen sütür geçirin ve enjeksiyon yerinde üzerinde ikinci bir kalıcı bitişik harfleri kravat.
- hepatik arterden kelepçeyi çıkarın. karaciğere doğru düzgün hepatik arter yoluyla kan akışını onaylamak restore edilmiştir.
- bitişik harfler gevşek uçları kesilir.
- karın boşluğuna bağırsak ve karaciğer dönmeden önce hiçbir kanama olmadığından emin olun. ek orijinal yönü döndürülür dikkat edin.
- kavisli bir iğne ile 4-0 vikril dikiş materyali kullanarak ayrı katmanlar halinde kas ve cilt dikin. Yeri continuous sütür yaklaşık 1 mm aralıklı ve sıkı çekin.
- dikiş aşamasında, bir analjesik örneğin buprenorfin gibi (0.05 mg / kg) tatbik.
- anestezi sıçan çıkarın. izofluran kullanılmış ise, sıçan birkaç dakika içinde bilincini kazanmak gerekir. MMF enjekte edilebilir bir anestezi gibi kullanılmış ise, anestezinin ters olan, atipamezol (0.75 mg / kg), flumazenil (0.2 mg / kg), ve nalokson (9.12 mg / kg) deri altından enjeksiyonu ile antagonize ve hayvanlar 20 dakika içinde bilincini kazanmak için izin verir. İlk wakening aşamasında kızılötesi ısınma lambası ile sıcak sıçan tutun.
- sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın.
- Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.
- sıkıntı patolojik belirtileri postoperatif sıçan Monitör ve devamıanaljezikler ile yerel hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından gerektiği gibi. Örneğin, buprenorfin / 0.05 mg uygulanan her 12 saat kg olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
tecrübesi ile, (arter başarıyla disseke ve enjekte ve hayvan ameliyatı hayatta olduğu anlamına gelir) neredeyse% 100 başarı oranı elde edilebilir. Ancak, (vb tümör yükü derecesi, altta yatan karaciğer fonksiyon) ameliyat öncesinde sıçan sağlık durumu açıkça cerrahi müdahale sonucu bir rol oynayacaktır. Cerrahi müdahalenin ardından, fareler, tek başına tampon bile virüs olmadan enjekte edilmiştir, Geçici kilo kaybı ve karaciğer enzimlerinin hafif, geçici yükselme yaşamaya beklenebilir.
Daha önce göstermiştir ki onkolitik vesiküler stomatit virüsü (VSV) ya da ortotopik, multifokal HCC modeli 8,9 etkili tümör iletimi ve tümör spesifik virüs replikasyonu, Newcastle hastalığı virüsü (NDV) sonuçları, trans-hepatik arter yönetim. İki virüs kendi tümör içine kinetik farklı olsa daÇevre karaciğer virüsün bir kanıt göstermemiştir virüs replikasyonu, LacZ haberci geni için pozitif enzimatik boyama ile kanıtlandığı gibi maksimum virüs replikasyonu, virüs yayılması çok sayıda odaklar ilgili zaman noktalarında, özel HCC nodülleri olan gözlenebilir çoğaltma (daha önce veri 8,9 geçme Şekil 3 ve 4). Ayrıca, rastgele seçilen VSV ile tedavi tümör nodüllerinin morfometrik analizi tümör transdüksiyon verimliliği tümör boyutu (Şekil 3) ile ilişkili olmadığını göstermiştir.
Ayrıca, hepatik arter boyunca terapötik ajanları vermek için yeteneği de TACE alternatif olarak bir embolizasyon madde ile tedavi birleştirme imkanı sunar. Biz göstermiştir ki bir 1'de onkolitik VSV karıştırılarak: Bir parçalanabilir nişasta mikro (DSM) embolizasyon ajan ile 1 oranında ve süspansiyon thr beslerkenhepatik arter ough, biz taşıyan multifokal HCC 11 nodüller sıçanlarda masif tümör nekroz ve çok anlamlı sağkalım uzaması elde edebiliriz. normal karaciğer dokusunun perfüzyon üzerinde minimal bir etkiye sahip iken bir gadolinyum kontrast kullanarak dinamik kontrastlı manyetik rezonans görüntüleme (DCE-MRI) tarafından gösterildiği gibi DSM Trans-hepatik arter yönetimi, tümör nodüllerinin neredeyse tam embolizasyon sonuçlandı madde (Şekil 5, daha önce verileri 11 yayınlanmıştır).
Şekil 1. hepatik arter infüzyon prosedürünün şematik. Hepatik damarlar (hepatik arter, uygun hepatik arter ve gastroduodenal arter) bir mikroskop yardımıyla disseke edilir. gastroduodenal arter ligasyonu ve hepatik arterin zamansal blok sonra,PBS veya VSV vektörü 1 ml uygun bir hepatik arter boyunca gastroduodenal arter yoluyla uygulanır. Enjeksiyondan sonra, gastroduodenal arterin yakın Alanı kanamayı önlemek için bağlanır, hepatik arter bloğu salınır ve hepatik kan akışına tekrardan doğrulanır. Bu rakam daha önce 9 yayımlandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil hepatik arter infüzyon prosedürünün 2. Fotoğraf. Bir laparotomize sıçan karın duvarı retraktörü ve gazlı bezlerden (A) yerleştirilmesini göstermektedir. karaciğer lobu, hepatik arter (belirlenen CHA) ve gastroduodenal arter (belirlenen GA) tespit edilir ve dis dışarı kaldırdıktan sonrasected (B). Gastroduodenal arterin distal ucunu bağlanarak sonra, hepatik arter geçici (C) sıkıştırılır. Gastroduodenal arter artık enjeksiyon için hazırdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Multifokal HSK taşıyan sıçanlarda Şekil 3. İletimi ve hepatik arter uygulamadan sonra VSV tümör seçici çoğaltma. Hayvanların takımları (n = 3 / zaman noktası) gün 1 sonrası virüs 30 dakika ve (B) (A) kurban edildi infüzyon ve dondurulmuş karaciğer kesitleri β-gal ekspresyonu için boyandı. Temsilci bölümler düşük (solda) ve daha yüksek büyütme (sağda) gösterilmektedir. Oklar tümör lezyonları ve HEPA arasındaki sınırları gösterirtik parankim. Tümör boyutu ve transdüksiyon verimliliği arasındaki (C) ilişki. HCC içeren karaciğer bölümleri toplam tümör ve X-gal pozitif alanlar ölçmek için morfometrik analizi ile analiz edilmiştir. Bu rakam daha önce 9 yayımlandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. NDV / F3aa (L289A) karaciğer kanserini de tümöre özel virüs replikasyonu tedavi sonuçları (HCC) tohumlu zeytin fareler. Multifokal ortotopik HCC nodülleri nolu erkek Buffalo sıçanları rNDV / F3aa (L289A) (50 10 8 TCID) ile muamele edildi hepatik arteryal infüzyon yoluyla ve söz konusu zaman öldürüldü tedavi sonrası işaret (n = 3). Tümör içeren karaciğer parçalarında tabi tutulmuşturß-gal lekeleme. Temsilci bölümler 5X (genel bakış) ve 20X (tümör ve karaciğer bölümlerinin büyütme) büyütmede gösterilmiştir. Virüs titrleri, karaciğer ve tümör lizat TCID50 analizleri ile kantifiye edildi ve ± SD ortalaması olarak ifade edilmiştir. NDV, Newcastle hastalığı virüsü; TCID50,% 50 doku kültürü enfeksiyon dozu. Bu Şekil orijinal formu 8 modifiye edilmiş, unutmayın. Bu rakam daha önce 8 yayımlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Nonembolized veya DSM ile hepatik arter embolizasyon 30 dakika sonra ya embolize HCC. McA-RH7777 tümör taşıyan sıçan, Şekil 5. Dinamik kontrastlı manyetik rezonans görüntüleme DCE-MRI ile görüntülendi. (<Güçlü> A) eksenel T1 tartılmış prekontrast (a, c) ve kontrast sonrası (B, D) Çıkan embolizasyon tümör modüllerinin (d) 'de kontrast eksikliğini göstermektedir. (B) Veri kantitatif tümör nodülü ve komşu normal karaciğer dokusunun ilgi eşit büyüklükte bölgelerde gri ölçekli sinyal yoğunlukları ölçerek analiz edildi. Bir temsilci veri seti gösterilir. Bu rakam daha önce 11 yayımlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary clippers | Aesculap | GT415 | Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Needles | Braun | 4656300 | 30 G x ½” |
| 1 ml syringes | Braun | 9161406V | Tuberculin syringe |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#15 | #15 blade |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | Sharp/blunt, for opening skin and muscle |
| Adson forcep | Fine Science Tools | 1101-12 | With teeth, for grasping skin and muscle |
| Alm retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery |
| Gauze swabs | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use |
| Cotton-tipped applicator swabs | Lohmann & Rauscher | 11970 | Sterile |
| Fine-tipped foreceps | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For delicate cutting |
| Micro-needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | For ligating gastroduodenal artery |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12005-15 | Tungsten carbide jaws |
| 7-0 Prolene sutures | Ethicon | 8648H | Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | V3040H | With curved needle attached |
| Infrared warming lamp | Beurer | IL11 | For maintaining body temperature post-operatively |
References
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study. Science. 274, 740-743 (1996).
- Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Bruix, J., Sala, M., Llovet, J. M. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127, 179-188 (2004).
- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
- Breedis, C., Young, G. The blood supply of neoplasms in the liver. Am J Pathol. 30, 969-977 (1954).
- Nakashima, T., Kojiro, M. Pathologic characteristics of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis. 6, 259-266 (1986).
- Heo, J., et al. Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer. Nat Med. 19, 329-336 (2013).
- Altomonte, J., Marozin, S., Schmid, R. M., Ebert, O. Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma. Mol Ther. 18, 275-284 (2010).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Kournioti, C., Tai, Y. S., Woo, S. L. Oncolysis of multifocal hepatocellular carcinoma in the rat liver by hepatic artery infusion of vesicular stomatitis virus. Mol Ther. 9, 368-376 (2004).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Woo, S. L. Eradication of advanced hepatocellular carcinoma in rats via repeated hepatic arterial infusions of recombinant VSV. Hepatology. 41, 196-203 (2005).
- Altomonte, J., et al. Synergistic antitumor effects of transarterial viroembolization for multifocal hepatocellular carcinoma in rats. Hepatology. 48, 1864-1873 (2008).
