Transarterial Administration af onkolytiske virus for Lokoregional Therapy af ortotopisk HCC i rotter

Introduction

Hepatocellulært carcinom (HCC) er den femte mest udbredte kræft på verdensplan, og den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald, gør det en væsentlig sundhedsproblem ^1,2. For patienter, der ikke er berettiget til tumor resektion, eller dem afventer levertransplantation, locoregional terapi involverer transarterial embolisering (TAE) eller transarterial chemoembolization (TACE) anvendes som standard palliativ pleje ^3,4. Disse behandlinger udnytte den unikke egenskab af dobbelt blodforsyning i leveren, hvor tumorer fodres næsten udelukkende af hepatisk arteriel blodgennemstrømning, mens den omgivende leveren modtager størstedelen af sin blodforsyning fra portalen vene ^5,6.

På grund af de ekstremt begrænsede effektiviteter af etablerede terapier for HCC har oncolytiske vira dukket op som lovende alternative terapeutiske midler. JX-594, for nylig omdøbt Pexa-Vec, er et thymidin kinase-slettet vaccinia vektor, bevæbnet med granulocyt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), som har afsluttet klinisk fase II studie med HCC ^7. For nylig er et rekombinant vesikulær stomatitis-virus vektor (VSV), der udtrykker humant interferon-beta ind i en fase I klinisk studie med sorafenib-refraktær HCC (NCT01628640). Som onkolytiske virus komme tættere på at opnå godkendelse til klinisk ansøgning om HCC patienter, behovet for en effektiv administration rute målrette multifokal sygdom er tydelig. Mens systemisk afgivelse er stort set ineffektive som følge af ineffektiv tumor transduktion, kunne intratumorale applikationer begrænse effektiviteten af ​​terapien til det injicerede tumor, efterlader uninjectable mikroskopiske læsioner modtagelige for sygdomsprogression.

Vi har etableret en fremgangsmåde til isolering af den hepatiske arterie i rotter at administrere onkolytiske virus terapi i en locoregional måde at målrette ortotopisk HCC. Vi har vist, at denne administration rute resulterer i sikker og effective transduktion af multifokale HCC knuder, hvilket resulterer i en betydelig overlevelse forlængelse i immunkompetente rotter ^8-10. Her beskriver vi den måde at få tilgang, dissekere, og injektion i den hepatiske arterie i rotter. En plan for fremgangsmåden er vist i figur 1 (tidligere offentliggjorte ⁹⁾

Protocol

Bemærk: Der er ikke udført Følgende trin i overensstemmelse med retningslinjerne i vores institution og den lokale regering Bayern, Tyskland. Alle forsøg på at genskabe denne protokol skal ske i tilslutning til de lokale retningslinjer for human behandling af dyr, som dikteret af lokale dyr pleje og brug udvalg. For eksempel er mange institutter kræver, at sterile handsker bæres under gnaver kirurgi. Desuden skal arbejdet med virus udføres i henhold til lokale bestemmelser, der tager sig for personlig og miljøsikkerhed. Der skal udvises forsigtighed for korrekt bortskaffelse af forurenet affald og at rengøre instrumenter og arbejdsområde (dvs. ved autoklavering og rengøring med en passende antiviral desinfektionsmiddel i henhold til producentens anvisninger).

1. Forberedelser før du begynder Kirurgi

1. Sterilisere kirurgiske instrumenter (dvs. ved autoklavering).
2. Fortynd viruset til approprIATE koncentration, som vil variere afhængigt af toksiciteten af ​​den specifikke virus, der anvendes og modtagelighed af rotte-stammen.
   Bemærk: For eksempel, når du bruger vesikulær stomatitis-virus hos mandlige Buffalo rotter vi typisk injicere 10 ⁷ pfu i en 1 ml volumen, hvilket er den maksimalt tolererede dosis i denne model.
   1. Udfyld forud virus (ved hjælp af aseptisk teknik) i 1 ml sprøjter, og vedhæft 30 G nåle, idet man fjerne luft fra sprøjten og kanylen.
3. Forbered kirurgiske plads med alle materialer og udstyr, der kræves, og spray området med ethanol desinficere. Fyld en lille beholder med steril saltvandsopløsning (0,9% NaCl) til befugtning gaze podninger og bomuld spids applikatorer.

2. Forberedelse af Rat

1. Administrere en smertestillende (som angivet af lokale dyr pleje og brug udvalg), på et passende dosis 30 minutter før begynder den kirurgiske procedure. For eksempel,administrere en høj dosis af metamizol (100-200 mg / kg).
2. Bedøver rotten under anvendelse inhalation (isofluran) eller injicerbar (dvs. en blanding af medetomidin (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), og fentanyl (0,005 mg / kg), også kendt som MMF) anæstesi. Indgiv isolflurane gennem en fordamper på 1-3% og juster om nødvendigt at opretholde en normal respiration og puls.
   1. Før du fortsætter, skal du sikre, at rotten er fuldt bedøvet og ude af stand til at føle smerte ved at klemme foden pad og observere for en reaktion.
   2. Påfør en veterinær øje salve for at forhindre tørhed under anæstesi.
3. Barber maveregionen fra brystbenet ned til lige over kønsdelene ved hjælp af en lille veterinær hårklipper. Vær omhyggelig med at opnå en tæt barbering uden at skade huden.
4. Fastgør rotte til den kirurgiske sengen ved hjælp af tape på for- og bagben, og, hvis du bruger indånding anæstesi, placere snuden ind i en passende størrelse næse kegle. Placer en varmepudenedenunder rotte til at opretholde legemstemperatur. Desinficere abdominale område med en kirurgisk kvalitet desinfektionsmiddel, efterfulgt af en alkohol skylning og anvendelse af et antiseptisk maling.

3. Laparotomi

1. Ved hjælp af en lille buet skalpel, såsom # 15, gøre en lille lodret snit i huden lag direkte langs midterlinien. Forlæng snittet op til Xyphoid proces. Dernæst incise musklen lag ved forsigtigt at løfte op med et par Adson pincet til at gøre en skalpel indsnit, og så udvide snittet op til xyphoid proces med kirurgiske sakse. Pas på ikke at punktere de organer i bughulen eller at beskadige de små skibe på hver side af den Xyphoid proces.
2. Placer en retraktor hen over maven at sprede muskel og skind og eksponere hele abdominale område.
3. Fugt to 7,5 x 7,5 cm ² gaze podninger med sterilt fysiologisk saltvand og sprede én på tværs af toppen af den kirurgiskeåbning og én på tværs af bunden, som vist i figur 2A.

4. Isolering af den hepatiske arterie

1. Brug to fugtede bomuld applikator svaberprøver fugtet med sterilt fysiologisk saltvand, forsigtigt løfte tarmene og coecum ud af bughulen, og placere dem på den nederste gaze vatpind. Fold gaze på at holde organerne fugtig og at holde dem ude af vejen.
2. Brug to fugtede bomuld applikator podninger, forsigtigt løfte den venstre laterale lever lap, som vil være den mest fremherskende lap i betragtning på dette tidspunkt. Flip lap opad, og ved hjælp af en lille par fjeder saks, skære igennem den fibrøse membran på undersiden af ​​lap, tillader lap at være fuldstændig vendt opad og hvile oven på det tidligere placeret gaze. Fold gaze over lap at holde det på plads.
3. Fortsæt med næste lap (den forreste spiegelske), som nu er den mest forreste lap i betragtning. med the hjælp af et dissektionsmikroskop og fine tænger, dissekere den tynde membran, der omgiver den lap for at frigive den og lade den frit vendt opad. Placer lap under gaze vatpind sammen med den venstre laterale lap.
4. Observere den posteriore spiegelske lap, som nu vil være synlige. Gentag trin 4.3 til helt dissekere den bageste spiegelske lap og vend det opad og inde i gaze sammen med de tidligere placeret lever lapper.
5. Lige under den oprindelige position af spiegelske lap, finde den fælles hepatiske arterie, som nu vil være synlige og let genkendes af sin stærke pulsering. Efter arterien til den anatomiske højre, observere tykke membranøs materiale tilsløre de gastroduodenale og ordentlige hepatiske arterier fra visning. Ved hjælp af fine pincet, løfte dette materiale og forsigtigt rive det, idet man undgå små fartøjer på dette område. Brug bomuld applikator svaberprøver at stoppe blødning, som kan forekomme.
   1. Find enrterial grene, som vil være klart synlige ved hjælp af et dissektionsmikroskop når membranerne er korrekt dissekeret.
6. Brug af to fine, atraumatisk pincet, forsigtigt dissekere den fælles hepatiske arterie, gastroduodenal arterie, og den rette hepatiske arterie, således at de er befriet fra de omgivende membraner (figur 2B).

5. Forberedelse af arterien til injektion

1. Passere en 7-0 prolene sutur under den gastroduodenale arterie, og brug en mikronål-indehaveren at binde en permanent ligatur ved den distale ende, lige over forgreningen (se figur 1 for korrekt placering). Tager cirka 2 inches af suturmateriale resterende på enderne, og klemme dem med en nåleholder til at trække arterien undervises, som i figur 2C.
2. Placer en lille klemme om den fælles hepatiske arterie midlertidigt at blokere blodgennemstrømning (figur 2C).
   Bemærk: Dette er important at forhindre massiv blødning, når nålen fjernes fra arterien. Endvidere vil blokering af arterielle blodgennemstrømning tillade langsommere virus administration og bedre transduktionseffektivitet.
   1. Vigtigt: Arbejde hurtigt at begrænse mængden af ​​tid, at blodgennemstrømningen er stoppet - udføre injektionen og efterfølgende ligering af arterien inden for 5 min at fastspænde den fælles hepatiske arterie.
3. Hvis det er muligt, øge forstørrelsen på dissektionsmikroskop, således at den gastroduodenale arterie er i skarp fokus og synes stor nok til præcist indsætte 30 G nål. Placer nålen i injektionssprøjten i lumen i den gastroduodenale arterie og tryk langsomt på stemplet.
   Bemærk: Korrekt placering af nålen vil resultere i den injicerede opløsning strømmer direkte gennem ordentlig hepatiske arterie og mod leveren.
   1. Udfør injektionen meget langsomt at maksimere transduktionseffektivitet.
<li> Når der er administreret hele injektion volumen, langsomt trække nålen fra arterien.
Bemærk: Der bør ikke være nogen blødning fra injektionsstedet. I tilfælde af at blødning sker, betyder det, at klemmen ikke er korrekt placeret og bør hurtigt justeres.

6. Lukning

1. Pass en anden 7-0 prolene sutur under gastroduodenale arterie, og binde en anden permanent ligatur over injektionsstedet.
2. Fjern klemmen fra den fælles hepatiske arterie. Bekræft, at blodstrømmen gennem den rette hepatisk arterie mod leveren er blevet genoprettet.
   1. Skær de løse ender af ligaturer.
3. Bekræfter, at der ikke er nogen blødning inden returnering tarmene og leveren til bughulen. Pas på, at tillægget returneres i sin oprindelige retning.
4. Sutur musklen og huden i separate lag ved hjælp 4-0 Vicryl suturmateriale med en buet nål. Place continuous suturer ca. 1 mm, og bortset trække stramt.
   1. Under sutur fase, administrere et analgetikum såsom buprenorphin (0,05 mg / kg).
5. Fjern rotte fra anæstesi. Hvis der er anvendt isofluran, bør rotten kommer til bevidsthed inden for flere minutter. Hvis MMF har været anvendt som et injicerbart anæstesi, antagonisere den med en subkutan injektion af atipamezol (0,75 mg / kg), Flumazenil (0,2 mg / kg), og Naloxon (9,12 mg / kg), som vil vende virkningerne af anæstesi og at dyrene kommer til bevidsthed inden for 20 min. Hold rotter varme med en infrarød opvarmning lampe i den indledende wakening fase.
   1. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
   2. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
6. Overvåg rotter postoperativt for patologiske tegn på lidelse, og opfølgningop med analgetika som krævet af den lokale dyrepleje og anvendelse udvalg. For eksempel kan buprenorphin indgives ved 0,05 mg / kg hver 12. time.

Representative Results

Med erfaring, kan der opnås en næsten 100% succesrate (hvilket betyder, at arterien med succes blev dissekeret og injiceres, og dyret overlevede kirurgi). Dog vil sundhedsstatus før kirurgi (grad af tumor byrde, underliggende leverfunktion, etc.) rotten naturligvis spille en rolle i resultatet af den kirurgiske indgreb. Efter kirurgi, kan forventes rotter at opleve forbigående vægttab og en let, forbigående forhøjelse af leverenzymer, selv om buffer alene uden virus blev injiceret.

Vi har tidligere vist, at trans-hepatisk arteriel administration af onkolytisk vesikulær stomatitis-virus (VSV) eller Newcastle disease-virus (NDV) resulterer i en effektiv tumor transduktion og tumor-specifikke virusreplikation, i en ortotopisk, multifokal HCC model ^8,9. Selv om de to vira afviger i deres intratumorale kinetikaf virusreplikation, ved de respektive tidspunkter af maksimal virusreplikation, talrige foci af virusformering, som vist ved positiv enzymatisk farvning for LacZ reporter genet, kunne observeres udelukkende inden HCC knuder, mens de omgivende leverne udviste ingen tegn på virus replikation (figur 3 og 4, tidligere offentliggjorte data ^8,9). Derudover morfometrisk analyse af tilfældigt udvalgte VSV-behandlede tumorknuder viste, at tumor transduktionseffektivitet ikke korrelerer med tumorstørrelse (figur 3).

Endvidere evnen til at levere terapeutiske midler gennem den hepatiske arterie giver også mulighed for at kombinere behandling med et embolisering middel som et alternativ til TACE. Vi har vist, at ved blanding onkolytisk VSV ved et 1: 1 forhold med en nedbrydelig stivelse mikrosfære (DSM) embolisering middel og infusion suspensionen thrdybdegående den hepatiske arterie, kunne vi opnå massiv tumor nekrose og meget væsentlig overlevelse forlængelse hos rotter bærer multifokal HCC knuder ^11. Trans-hepatisk arteriel administration af DSM resulterede i en næsten komplet embolisering af tumor knuder, og samtidig have en minimal indvirkning på perfusion af normale levervæv, som det fremgik af dynamisk kontrast-forstærket magnetisk resonans (DCE-MRI) ved hjælp af en gadolinium kontrast agent (figur 5, tidligere offentliggjorte data ^11).

Figur 1. Skematisk repræsentation af hepatisk arteriel infusion procedure. Leverens fartøjer (fælles hepatiske arterie, ordentlig hepatiske arterie, og gastroduodenal arterie) dissekeres ved hjælp af et dissektionsmikroskop. Efter ligering af den gastroduodenale arterie og tidsmæssige blok af den fælles hepatiske arterie,1 ml PBS eller VSV vektor administreres via den gastroduodenale arterie ved korrekt hepatiske arterie. Efter injektion er den proksimale side af den gastroduodenale arterie ligeret til forebyggelse af blødning, er blokken af ​​den fælles hepatiske arterie frigivet, og genoptagelsen af ​​hepatisk blodstrøm bekræftes. Dette tal er tidligere blevet offentliggjort ^ni. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Fotografier af hepatisk arteriel infusion procedure. En laparotomiseret rotte viser placeringen af bugvæggen retraktoren og gaze podninger (A). Efter at løfte de hepatiske lapper, den fælles hepatisk arterie (betegnet CHA) og gastroduodenal arterie (betegnet GA) er identificeret og dissected (B). Efter ligering den distale ende af den gastroduodenale arterie, er den fælles hepatiske arterie midlertidigt fastspændt (C). Den gastroduodenale arterie er nu klar til injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Transduktion og tumor-selektiv replikation af VSV efter hepatiske arterie i rotter bærer multifokal HCC. Sæt af dyr (n = 3 / tidspunkt) blev aflivet (A) ved 30 min og (B) på dag 1 efter virus infusions- og frosset lever snit blev farvet for β-gal-ekspression. Repræsentative snit er vist ved lave (venstre) og højere forstørrelser (højre). Pile angiver grænserne mellem tumor læsioner og HEPAtic parenkym. (C) Forbindelser mellem tumorstørrelse og transduktionseffektivitet. HCC-indeholdende leversnit blev analyseret ved morfometrisk analyse til beregning total tumor og X-gal-positive områder. Dette tal er tidligere blevet offentliggjort ^ni. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. NDV / F3aa (L289A) behandlingsresultater i tumor-specifikke virusreplikation i hepatocellulært carcinom (HCC) -fyldt rotter. Mand Buffalo rotter bærer multifokale ortotopisk HCC knuder blev behandlet med rNDV / F3aa (L289A) (10 ⁸ TCID ₅₀₎ ved hepatisk arteriel infusion, og dræbt på det angivne tidspunkt peger efterbehandling (n = 3). Tumor-holdige leversnit blev udsattil p-gal-farvning. Repræsentative snit er vist ved 5X (oversigt) og 20X (forstørrelse af tumor og lever sektioner) forstørrelse. Virustitere blev kvantificeret ved _{TCID50-analyse} af lever og tumor lysat, og er udtrykt som middelværdi ± SD. NDV, Newcastle disease-virus; _TCID50, 50% vævskultur infektiøs dosis. Bemærk, denne figur er blevet ændret fra sin oprindelige form ^8. Dette tal er tidligere blevet udgivet ^8. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Dynamisk kontrast-forstærket magnetisk resonans af emboliserede HCC. MCA-RH7777 tumor-bærende rotter, enten nonembolized eller 30 min efter hepatisk arteriel embolisering med DSM, blev afbildet med DCE-MRI. (<strong> A) Axial T1-vejet prækontrastforstærket (a, c) og postkontrastforstærket (b, d) billeder viser mangel på kontrast i emboliseres tumorknuder (d). (B) Data blev analyseret kvantitativt ved at måle grå-skala signalintensiteter i lige størrelse områder af interesse tumor knuder og tilstødende normale levervæv. Et repræsentativt datasæt er vist. Dette tal har tidligere været offentliggjort ^11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary clippers	Aesculap	GT415	Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
30 G Needles	Braun	4656300	30 G x ½”
1 ml syringes	Braun	9161406V	Tuberculin syringe
Disposable scalpel	Feather	2975#15	#15 blade
Standard surgical scissors	Fine Science Tools	14001-13	Sharp/blunt, for opening skin and muscle
Adson forcep	Fine Science Tools	1101-12	With teeth, for grasping skin and muscle
Alm retractor	Fine Science Tools	17008-07	With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery
Gauze swabs	Lohmann & Rauscher	18504	7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use
Cotton-tipped applicator swabs	Lohmann & Rauscher	11970	Sterile
Fine-tipped foreceps	Fine Science Tools	11063-07	0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09	For delicate cutting
Micro-needle holder	Fine Science Tools	12076-12	For ligating gastroduodenal artery
Needle holder	Fine Science Tools	12005-15	Tungsten carbide jaws
7-0 Prolene sutures	Ethicon	8648H	Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery
4-0 Vicryl sutures	Ethicon	V3040H	With curved needle attached
Infrared warming lamp	Beurer	IL11	For maintaining body temperature post-operatively