Introduction
Гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) является пятым самым распространенным раком во всем мире, и третьей ведущей причиной рака , связанных смерти, что делает его значительное беспокойство здоровья 1,2. Для пациентов , которые не имеют права на резекции опухоли, или лиц , ожидающих трансплантации печени, локорегионарной терапии с участием Трансартериальная эмболизации (TAE) или трансартериального Химиоэмболизация (ТАХЭ) применяются в качестве стандартной паллиативной помощи 3,4. Эти методы используют уникальную особенность двойного кровоснабжения в печени в результате чего опухоли кормили почти исключительно печеночным артериального кровотока, в то время как окружающие печень получает большую часть своих поставок крови из воротной вены 5,6.
Из-за крайне ограниченных эффективностей установленных методов лечения ГЦК, онколитические вирусы появились в качестве перспективных альтернативных терапевтических средств. JX-594, который недавно был переименован Pexa-VEC, является киназа удаленные коровьей вектор тимидина, вооруженный гранулоцитов-мacrophage колониестимулирующий фактор (GM-CSF), которая завершила фазу II клинических испытаний для ГЦК 7. Совсем недавно, рекомбинантный вирус везикулярного стоматита вектор (VSV) экспрессирующих человеческий интерферон-бета вступила в фазу I клинических испытаний для сорафениба-огнеупорный ГЦК (NCT01628640). Как онколитических вирусов двигаться ближе к получению одобрения для клинического применения при НСС у пациентов, необходимость эффективного способа введения целевой мультифокальной болезнь очевидна. В то время как системная доставка в значительной степени неэффективным из-за неэффективного трансдукции опухоли, внутриопухолевой приложения могут ограничить эффективность терапии нагнетаемого опухоли, оставляя uninjectable микроскопические повреждения, восприимчивых к прогрессирования заболевания.
Мы установили способ выделения печеночной артерии у крыс для введения онколитического вируса терапию в локорегионарной образом целевому ортотопическая HCC. Мы показали, что этот путь введения приводит к безопасным и effectiве трансдукции многоочаговых узелков ГЦК, что приводит к значительному увеличению продолжительности выживаемости у иммунокомпетентных крыс 8-10. Здесь мы опишем метод доступа, рассечения, и введение в печеночную артерию у крыс. Схема процедуры показана на рисунке 1 (ранее опубликована 9)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Следующие шаги были выполнены в соответствии с руководящими принципами нашего учреждения и местного самоуправления в Баварии, Германия. Все попытки воспроизвести этот протокол должен быть сделан при строгом соблюдении с местными руководящими принципами гуманного обращения с животными, как это диктуется местного ухода за животными и использование комитета. Например, многие институты требуют, чтобы стерильные перчатки изнашиваются во время операции на грызунах. Кроме того, работа с вирусами должны выполняться в соответствии с местными правилами, заботясь о личной и экологической безопасности. Необходимо соблюдать осторожность , чтобы правильно распоряжаться загрязненных отходов и для очистки инструментов и рабочее пространство (т.е. автоклавированием и очистки с помощью соответствующего противовирусного дезинфицирующего средства в соответствии с инструкциями завода - изготовителя).
1. Подготовка Прежде чем приступить к хирургии
- Стерилизовать хирургических инструментов (т.е. автоклавированием).
- Развести вирус к approprIate концентрация, которая будет варьироваться в зависимости от токсичности конкретного вируса используется и восприимчивость штамма крыс.
Примечание: Например, при использовании вируса везикулярного стоматита у самцов крыс Буффало, мы , как правило , вводят 10 7 КОЕ в объеме 1 мл, что максимальная допустимая доза в этой модели.- Предварительного заполнения вируса (с использованием асептической техники) в 1 мл шприцы, и прикрепить 30 G иглы, следя за тем, чтобы удалить воздух из шприца и иглы.
- Подготовьте хирургическое пространство со всеми материалами и оборудованием, необходимых, и распылите область с этанолом, чтобы продезинфицировать. Заполните небольшой сосуд с стерильным физиологическим раствором (0,9% NaCl) для увлажнения марлевые тампоны и ватным наконечником аппликаторы.
2. Подготовка крыс
- Администрирование обезболивающее (как указано местное по уходу за животными и использование комитета), в соответствующей дозе 30 мин до начала хирургической процедуры. Например,введение высокой дозы метамизол (100-200 мг / кг).
- Обезболить крысу с помощью ингаляции (изофлуран) или инъекционные (то есть смесь медетомидин (0,15 мг / кг), мидазолам (2 мг / кг), и фентанил (0,005 мг / кг), также известный как ММФ) наркозом. Администрирование isolflurane через испаритель на 1-3% и при необходимости отрегулировать для поддержания нормального дыхания и частоты сердечных сокращений.
- Прежде чем продолжить, убедитесь, что крыса полностью успокоены и не в состоянии чувствовать боль, зажимая ноги площадку и наблюдая за реакцией.
- Нанесите ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Бритье области живота от грудины до чуть выше половых органов с помощью небольшого ветеринарную машинки для стрижки волос. Позаботьтесь, чтобы достичь бритье, не повредив кожу.
- Зафиксировать крысу хирургической кровати с помощью липкой ленты на передних и задних конечностей, а также, при использовании ингаляционной анестезии, поместите морду в подходящего размера носовой конус. Поместите грелкупод крысу для поддержания температуры тела. Лечить брюшной области с использованием хирургического класса дезинфицирующее, с последующим промыванием спиртом и применением антисептического краски.
3. Лапаротомию
- С помощью небольшой изогнутый скальпель, например, # 15, сделать небольшой вертикальный разрез в скин-слое непосредственно вдоль средней линии. Расширьте надрез до мечевидный отросток. Затем надрезать мышечный слой, осторожно поднимая вверх с парой Adson щипцами, чтобы сделать скальпелем надрез, а затем продлить надрез до мечевидный отросток с хирургическими ножницами. Будьте осторожны, чтобы не проколоть органы брюшной полости или повредить мелкие сосуды по обе стороны от мечевидный отросток.
- Поместите втягивающим поперек живота, чтобы распространить мышцы и кожу и раскрыть всю область живота.
- Смочить два 7,5 х 7,5 см 2 марлевые тампоны со стерильным физиологическим раствором и распространять один в верхней части хирургическогооткрытие и один в нижней, как показано на рисунке 2А.
4. Выделение Артерии печени
- С помощью двух увлажненную ватную аппликатора тампоны, смоченные стерильным физиологическим раствором, осторожно поднимите кишечник и слепую кишку из брюшной полости, и поместите их на нижнюю марлевым тампоном. Сложите марлю над держать органы влажной и держать их из пути.
- С помощью двух смоченные хлопка аппликатора тампона, осторожно поднимите левую боковую лопасть печени, которая будет наиболее преобладающим лопасть с точки зрения на данном этапе. Флип мочку вверх, и, используя маленькую пару пружинных ножниц, разрезать через волокнистую мембрану на нижней стороне лопасти, что позволяет мочка быть полностью перевернуть вверх и отдохнуть на верхней части ранее размещенных марлевый тампон. Сложите марлевую тампон над лепестка, чтобы удерживать его на месте.
- Продолжить со следующей доли (передняя хвостатого), которая является в настоящее время наиболее передней доли в поле зрения. С ее помощь из рассекает микроскопа и тонким пинцетом, рассекают тонкую мембрану, окружающую лопасть для того, чтобы освободить его и дать ему возможность свободно перевернуть вверх. Поместите лопасть под марлевым тампоном вместе с левой боковой лопасти.
- Обратите внимание на заднюю хвостатого мочку, который теперь будет виден. Повторите шаг 4.3 полностью рассекают заднюю хвостатого мочку и перевернуть его вверх и внутрь марлю вместе с ранее размещенных долей печени.
- Просто под исходным положением хвостатой доли, найти общей печеночной артерии, которая теперь будет видна и легко узнается по сильной пульсацией. После артерию к анатомической справа, наблюдать толстый материал мембранную затемнение гастродуоденальной и соответствующие печеночные артерии от точки зрения. Использование тонких щипцов, поднимите этот материал и аккуратно разорвать ее, следя за тем, чтобы избежать каких-либо небольших судов в этом районе. Используйте хлопок аппликаторы тампонов, чтобы остановить любое кровотечение, которое может возникнуть.
- Найдите Arterial ветви, которые будут хорошо видны с помощью микроскопа рассекает когда мембраны правильно расчленены.
- С помощью двух тонких, атравматичные щипцов, тщательно препарировать общей печеночной артерии, гастродуоденальной артерии и надлежащего печеночной артерии таким образом, чтобы они освободились от окружающих мембран (рис 2В).
5. Подготовка артерию для инъекций
- Проходят 7-0 Prolene шов под гастродуоденальной артерии, а также использовать микро-иглы держатель , чтобы связать постоянную лигатуры на дальнем конце, как раз над бифуркацией (см рисунок 1 для правильного размещения). Разрешить около 2 дюймов шовного материала , остающиеся на концах, и зажим их с держателем иглы , чтобы вытащить артерию преподается, как показано на Рисунке 2С.
- Поместите небольшой зажим на общей печеночной артерии, временно блокировать кровоток (рис 2С).
Примечание: Это импortant, чтобы предотвратить массивное кровотечение, как только игла удаляется из артерии. Кроме того, закупорка артериального кровотока позволит более медленного введения вируса и лучшей эффективности трансдукции.- Важно: Работают быстро, чтобы ограничить количество времени, что кровоток останавливается - производить инъекцию и последующее лигирование артерии в течение 5 мин зажима общей печеночной артерии.
- Если это возможно, увеличить увеличение на рассекает микроскопом, таким образом, что гастродуоденальной артерии находится в резком фокусе, и оказывается достаточно большим, чтобы точно вставить 30г иглу. Поместите иглу шприца в просвет гастродуоденальной артерии и медленно толкать на поршень.
Примечание: Правильное размещение иглы приведет введенного раствора, протекающего непосредственно через соответствующую печеночной артерии и к печени.- Выполнение инъекции очень медленно, чтобы максимизировать эффективность трансдукции.
<литий> После того, как весь объем инъекции был введен, медленно втягивать иглу из артерии.
Примечание: Там не должно быть кровотечение из места инъекции. В случае, когда кровотечение имеет место, это указывает на то, что зажим не правильно установлен и должен быть быстро регулировать.
6. Закрытие
- Пропустите второй 7-0 Prolene шов под гастродуоденальной артерии, и связать вторую постоянную лигатуры выше места инъекции.
- Снимите зажим с общей печеночной артерии. Убедитесь, что поток крови через соответствующую печеночной артерии к печени была восстановлена.
- Отрежьте свободные концы лигатур.
- Убедитесь, что нет кровотечения перед возвращением кишечника и печени в брюшной полости. Позаботьтесь о том, что приложение возвращается в исходное положение.
- Шовный мышцы и кожу в отдельных слоях с использованием 4-0 викрил шовный материал с изогнутой иглой. Место continuouые швы примерно 1 мм друг от друга и вытянуть плотно.
- Во время фазы сшивающих, администрировать обезболивающее, такие как бупренорфин (0,05 мг / кг).
- Удалить крысу от наркоза. Если изофлуран была использована, крыса должна прийти в сознание в течение нескольких минут. Если ММФ был использован в качестве инъекционной анестезии, антагонизм его с подкожной инъекцией атипамезола (0,75 мг / кг) флумазенил (0,2 мг / кг) и налоксон (9,12 мг / кг), который будет полностью изменить эффекты анестезии и дают животным восстановить сознание в течение 20 мин. Держите крыс теплые с инфракрасной лампой потепления во время начальной фазы пробуждением.
- Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее.
- Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью не выздоровел.
- Монитор крыс после операции патологических признаков бедствия, и последующейс анальгетиков в соответствии с требованиями местного ухода за животными и использование комитета. Например, бупренорфин можно вводить в количестве 0,05 мг / кг каждые 12 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С опытом, с вероятностью успеха почти 100% (это означает, что артерии была успешно рассекали и вводили, и животное выжили операцию) может быть достигнута. Тем не менее, состояние здоровья крысы до операции (степень опухолевой, лежащей в основе функции печени и т.д.), очевидно , будет играть определенную роль в исходе хирургического вмешательства. После хирургического вмешательства крыс можно ожидать испытывать переходную потерю веса и незначительное, кратковременное повышение печеночных ферментов, даже если буфер один, без вируса, был введен.
Ранее мы показали , что транс-печеночной артерии введение онколитической вируса везикулярного стоматита (VSV) или вирус ньюкаслской болезни (NDV) приводит к эффективной трансдукции опухоли и репликации вируса опухолеспецифичного, в ортотопической, мультифокальной ГЦК модели 8,9. Хотя два вируса отличаются по их внутриопухолевых кинетикирепликации вируса, в соответствующих временных точках максимального репликации вируса, многочисленные очаги распространения вируса, что подтверждается положительным ферментативного окрашивания для гена-репортера LacZ, можно наблюдать исключительно в ГЦК узелки, а окружающие печенки не показали никаких признаков вируса репликация (рис 3 и 4, ранее опубликованных данных 8,9). Кроме того, морфометрическое анализ случайно выбранных VSV-обработанных опухолевых узелков показали , что эффективность трансдукции опухоли не коррелирует с размером опухоли (рисунок 3).
Кроме того, возможность доставки терапевтических агентов через печеночную артерию также дает возможность сочетать терапию с эмболизации агентом в качестве альтернативы ТАХЭ. Мы показали, что, при смешении онколитической VSV в соотношении 1: 1 с разлагаемые крахмала микросферы (DSM) эмболизация агент и вливание подвески THRтельное печеночную артерию, мы могли бы достичь массивную некроза опухоли и очень значительное удлинение выживаемости у крыс подшипников мультифокальной HCC узелки 11. Транс-печеночной артерии введение DSM привело к почти полному эмболизации опухолевых узлов, имея при этом минимальное воздействие на перфузию нормальной ткани печени, о чем свидетельствует динамическое контрастная магнитно-резонансной томографии (DCE-MRI) с использованием контраста гадолиния агент (рис 5, ранее опубликованных данных 11).
Рисунок 1. Схематическое изображение печеночной процедуры вливанием. Сосудов печени (общей печеночной артерии, собственно печеночной артерии и гастродуоденальной артерии) отсекают с помощью рассечения микроскопом. После лигирования гастродуоденальной артерии и временной блок общей печеночной артерии,1 мл PBS или VSV вектора вводят через гастродуоденальной артерии через соответствующую печеночной артерии. После инъекции, проксимальный участок гастродуоденальной артерии лигируют, чтобы предотвратить кровотечение, блок общей печеночной артерии высвобождается, и возобновлены печеночного кровотока подтверждается. Эта цифра была ранее опубликована 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Фотографии печеночной артерии процедуры инфузии. Лапаротомию крыса демонстрирует расположение брюшной стенки втягивающим и марлевыми тампонами (А). После подъема из долей печени, общей печеночной артерии (обозначенный СНА) и гастродуоденальной артерии (обозначенный GA) идентифицируются и диспересекаемое (В). После лигирования дистальный конец гастродуоденальной артерии, общей печеночной артерии временно зажимается (C). Гастродуоденальной артерии теперь готов к инъекции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. трансдукция и опухоль-селективных тиражирование VSV после введения печеночной артерии у крыс , несущих мультифокальной HCC. Наборы животных (n = 3 / момент времени) забивали (А) на 30 мин , и (B) в день 1 после вируса инфузионные, и замораживают печени срезы окрашивали для экспрессии β-гал. Типичные сечения показаны на низких (слева) и увеличениями (справа). Стрелки указывают границы между опухолевыми поражениями и HEPAкрестики паренхимы. (C) Взаимосвязь между размером опухоли и эффективностью трансдукции. HCC-содержащие участки печени анализировали с помощью морфометрического анализа для количественного определения общей опухоли и X-Gal-позитивный площади. Эта цифра была ранее опубликована 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. NDV / F3aa (L289A) лечение приводит к репликации вируса опухоли специфических в гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) водоносного крыс. Мужчина Баффало крысы , несущие мультифокальные Ортотопическая ГЦК узелки обрабатывали rNDV / F3aa (L289A) (10 8 TCID 50) печеночным вливанием, и убили в указанное время указывает после лечения (п = 3). Опухоль содержащих участки печени были подвергнутык бета-гал окрашивания. Типичные сечения показаны на 5X (обзор) и 20Х (увеличение опухоли печени и секций) увеличения. Титры вирусов были определены количественно с помощью TCID 50 анализа печени и опухоли лизата, и выражают в виде среднего значения ± SD. NDV, вирус болезни Ньюкасла; TCID 50, 50% тканевой культуры , инфекционная доза. Обратите внимание, что эта цифра была изменена с оригинальной формы 8. Эта цифра была ранее опубликована 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Динамическая контрастная магнитно - резонансная томография эмболизированных HCC. MCA-RH7777 крыс-опухоленосителей, либо nonembolized или через 30 мин после печеночной артериальной эмболизации с DSM, были обследованы с ДСЕ-МРТ. (<сильный> A) Осевые T1-взвешивают precontrast (а, с) и postcontrast (б, г) изображения показывают отсутствие контраста в эмболизированных опухолевых узелков (D). (B) Данные количественно анализировали путем измерения интенсивности полутоновых сигналов в виде одинаковых по размеру областей , представляющих интерес опухолевых узелков и прилегающей нормальной ткани печени. Один из представителей набор данных показан. Эта цифра была ранее опубликована 11. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary clippers | Aesculap | GT415 | Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Needles | Braun | 4656300 | 30 G x ½” |
| 1 ml syringes | Braun | 9161406V | Tuberculin syringe |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#15 | #15 blade |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | Sharp/blunt, for opening skin and muscle |
| Adson forcep | Fine Science Tools | 1101-12 | With teeth, for grasping skin and muscle |
| Alm retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery |
| Gauze swabs | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use |
| Cotton-tipped applicator swabs | Lohmann & Rauscher | 11970 | Sterile |
| Fine-tipped foreceps | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For delicate cutting |
| Micro-needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | For ligating gastroduodenal artery |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12005-15 | Tungsten carbide jaws |
| 7-0 Prolene sutures | Ethicon | 8648H | Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | V3040H | With curved needle attached |
| Infrared warming lamp | Beurer | IL11 | For maintaining body temperature post-operatively |
References
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Evidence-based health policy - lessons from the Global Burden of Disease Study. Science. 274, 740-743 (1996).
- Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Bruix, J., Sala, M., Llovet, J. M. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127, 179-188 (2004).
- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
- Breedis, C., Young, G. The blood supply of neoplasms in the liver. Am J Pathol. 30, 969-977 (1954).
- Nakashima, T., Kojiro, M. Pathologic characteristics of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis. 6, 259-266 (1986).
- Heo, J., et al. Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer. Nat Med. 19, 329-336 (2013).
- Altomonte, J., Marozin, S., Schmid, R. M., Ebert, O. Engineered newcastle disease virus as an improved oncolytic agent against hepatocellular carcinoma. Mol Ther. 18, 275-284 (2010).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Kournioti, C., Tai, Y. S., Woo, S. L. Oncolysis of multifocal hepatocellular carcinoma in the rat liver by hepatic artery infusion of vesicular stomatitis virus. Mol Ther. 9, 368-376 (2004).
- Shinozaki, K., Ebert, O., Woo, S. L. Eradication of advanced hepatocellular carcinoma in rats via repeated hepatic arterial infusions of recombinant VSV. Hepatology. 41, 196-203 (2005).
- Altomonte, J., et al. Synergistic antitumor effects of transarterial viroembolization for multifocal hepatocellular carcinoma in rats. Hepatology. 48, 1864-1873 (2008).
