Transarterial Administration av cancerläkemedel Virus för Lokalregionala behandlingar av Orthotopic HCC hos råttor

Introduction

Hepatocellulär cancer (HCC) är den femte vanligaste cancer i världen, och den tredje ledande orsaken till cancerrelaterad död, vilket gör det en betydande hälsoproblem ^1,2. För patienter som inte är berättigade till tumörresektion, eller som väntar på levertransplantation, lokoregional terapi involverar transarterial embolisering (TAE) eller transarterial chemoembolization (TACE) tillämpas som standard palliativ vård ^3,4. Dessa behandlingar utnyttja den unika funktionen av dubbel blodtillförsel i levern, varigenom tumörer matas nästan uteslutande genom lever arteriellt blodflöde, medan den omgivande lever får huvuddelen av sin blodtillförsel från portalvenen ^5,6.

På grund av de extremt begränsade effektivitet etablerade terapier för HCC har onkolytiska virus dykt upp som lovande alternativa läkemedel. JX-594, nyligen omdöpt Pexa-Vec, är en tymidinkinas-raderade vacciniavektorn, beväpnade med granulocyt-macrophage kolonistimulerande faktor (GM-CSF), som har slutfört fas II-studie för HCC ^7. På senare tid har en rekombinant vesikulär stomatit virusvektor (VSV) som uttrycker humant interferon-beta in i en fas I klinisk studie för sorafenib-refraktär HCC (NCT01628640). Som onkolytiska virus närma sig få godkännande för klinisk tillämpning för HCC patienter, behovet av en effektiv administreringssätt rikta multifokal sjukdom är uppenbar. Även systemisk leverans är i hög grad ineffektivt på grund av ineffektiv tumöromvandling kan intratumorala applikationer begränsa effekten av terapin till det injicerade tumören, vilket uninjectable mikroskopiska skador som är mottagliga för sjukdomsprogression.

Vi har etablerat ett förfarande för isolering leverartären hos råttor för att administrera onkolytiskt virus terapi i en lokoregional sätt att rikta orthotopic HCC. Vi har visat att detta administreringssätt resulterar i säker och effective transduktion av multifokala HCC knutor, vilket resulterar i signifikant överlevnads förlängning i immunkompetenta råttor ^8-10. Här beskriver vi hur man får tillgång, dissekera, och injektion i leverartären hos råttor. Ett system av förfarandet visas i figur 1 (tidigare publicerats ⁹⁾

Protocol

Obs: Följande steg har utförts i enlighet med riktlinjerna för vår institution och den lokala regeringen i Bayern, Tyskland. Alla försök att reproducera detta protokoll måste göras i anslutning med de lokala riktlinjer för human behandling av djur, som dikteras av lokala djuromsorg och användning kommittén. Till exempel, många institut kräver att sterila handskar bärs under gnagare kirurgi. Dessutom måste arbetet med virus utföras enligt lokala föreskrifter, tar hand om personlig och miljösäkerhet. Man måste vara försiktig för att kasta av förorenat avfall och rengöra instrument och arbetsyta (dvs genom autoklavering och rengöring med en lämplig antiviral desinfektionsmedel enligt tillverkarens anvisningar).

1. Förberedelser innan kirurgi

1. Sterilisera kirurgiska instrument (dvs genom autoklavering).
2. Späd viruset till approprIATE koncentration, som kommer att variera beroende på toxiciteten hos det specifika viruset som används och känsligheten hos råttstammen.
   Obs: Till exempel, när man använder vesikulärt stomatitvirus hos manliga Buffalo råttor, injicera vi vanligtvis 10 ⁷ pfu i en 1 ml volym, vilket är den högsta tolererade dosen i denna modell.
   1. Prefill viruset (med aseptisk teknik) i 1 ml sprutor, och fästa 30 G nålar, var noga med att eliminera luft från sprutan och nålen.
3. Förbered kirurgiska utrymmet med alla material och utrustning som krävs, och spraya med etanol för att desinficera. Fyll en liten behållare med steril saltlösning (0,9% NaCl) för att fukta gasväv svabbar och bomull spets applikatorer.

2. Beredning av råtta

1. Administrera ett analgetikum (såsom specificeras av den lokala djurvård och användning kommitté), vid den lämpliga dosen 30 minuter före början den kirurgiska proceduren. Till exempel,administrera en hög dos av metamizol (100-200 mg / kg).
2. Söva råttan med hjälp av inandning (isofluran) eller injicerbara (dvs en blandning av Medetomidin (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), och fentanyl (0,005 mg / kg), även känd som MMF) anestesi. Administrera isolflurane genom en förångare på 1-3% och justera vid behov för att upprätthålla normal andning och puls.
   1. Innan du fortsätter, se till att råttan är helt sövd och inte kan känna smärta genom att klämma foten pad och observera en reaktion.
   2. Applicera en veterinär ögonsalva att förhindra torrhet under narkos.
3. Raka buken från bröstbenet ner till precis ovanför könsorganen med användning av ett litet veterinära hårklippare. Var noga med att uppnå en nära rakning utan att skada huden.
4. Fixera råttan att den kirurgiska sängen med tejp på fram- och bakben, och, om att använda inhalationsanestesi, placera nosen in i en lämplig storlek noskon. Placera en värmedynaunder råttan att bibehålla kroppstemperaturen. Desinficera buken med hjälp av en kirurgisk kvalitet desinfektionsmedel, följt av en alkoholsköljning och applicering av ett antiseptiskt färg.

3. Laparotomi

1. Med användning av en liten krökt skalpell, såsom # 15, gör ett litet vertikalt snitt i skinnskiktet direkt längs mittlinjen. Förlänga incisionen upp till xyphoid processen. Därefter incisionsfilm muskellagret genom att försiktigt lyfta upp med ett par Adson pincett för att göra en skalpell snitt, och sedan förlänga incisionen upp till xyphoid process med kirurgisk sax. Se till att inte punktera de organ i bukhålan eller för att skada de små blodkärlen på vardera sidan av den xyphoid processen.
2. Placera en indragare över buken för att sprida muskler och hud och exponera hela buken.
3. Fukta två 7,5 x 7,5 cm ² gasbinda kompresser med steril fysiologisk saltlösning och sprida en över överdelen av det kirurgiskaöppning och en över bottnen, såsom visas i figur 2A.

4. Isolering av leverartären

1. Med hjälp av två fuktade bomullsappliceringspinnar fuktade med steril fysiologisk koksaltlösning, försiktigt lyfta tarmarna och blindtarmen ur bukhålan, och placera dem på lägre gasväv pinne. Vik gasväv över för att hålla organ fuktig och för att hålla dem ur vägen.
2. Med hjälp av två fuktade bomullsappliceringspinnar, försiktigt lyfta upp den vänstra sido levern lob, som kommer att vara den mest dominerande loben med tanke på detta stadium. Vänd på lob uppåt, och med hjälp av en liten par fjäder sax, skär genom den fibrösa membranet på undersidan av loben, så att loben att vara helt vänt uppåt och vila ovanpå den tidigare placerade gaskompress. Vik gasväv pinnen över loben att hålla den på plats.
3. Fortsätt med nästa lob (främre caudatus), som nu är den mest främre loben i sikte. med the hjälp av ett dissektionsmikroskop och fin pincett, dissekera den tunna membran som omger loben för att frigöra det och göra det möjligt att fritt vänt uppåt. Placera loben under gasväv pinnen tillsammans med den vänstra sido lob.
4. Observera bakre caudatus lob, som nu kommer att vara synlig. Upprepa steg 4,3 till helt dissekera den bakre caudatus lob och vända uppåt och inne i gasväv tillsammans med de tidigare placerade leverlober.
5. Precis under den ursprungliga positionen av caudatus lob, hitta den gemensamma leverartären, som nu kommer att vara synlig och lätt igen av sin starka pulsering. Efter artären till den anatomiska höger, observera tjocka membran material skymmer gastroduodenala och korrekt lever artärer från vyn. Med fin pincett, lyft upp detta material och försiktigt riva, var noga med att undvika små fartyg i detta område. Använd bomullsappliceringspinnar för att stoppa blödning som kan uppstå.
   1. Leta reda på enrterial grenar, som kommer att vara klart synligt med hjälp av ett dissektionsmikroskop när membranen är ordentligt dissekeras.
6. Med hjälp av två fina, atraumatisk pincett, noggrant dissekera den gemensamma leverartären, gastroduodenala artären, och korrekt leverartären så att de befrias från de omgivande membranen (Figur 2B).

5. Beredning av Artery för injektion

1. Passera en 7-0 Prolene sutur under gastroduodenala artären, och använda en mikro nål-innehavaren att knyta en permanent ligatur vid den bortre änden, strax ovanför bifurkationen (se figur 1 för korrekt placering). Låt ca 2 inches av suturmaterial kvar på ändarna, och klämma dem med en nål innehavaren att dra artären lärde som i figur 2C.
2. Placera en liten klämma på den gemensamma leverartären för att tillfälligt blockera blodflödet (figur 2C).
   Obs: Detta är important att förhindra massiv blödning gång nålen avlägsnas från artären. Dessutom kommer blockering av arteriellt blodflöde tillåter långsammare virus administration och bättre transduktionseffektiviteten.
   1. Viktigt: Arbeta snabbt för att begränsa mängden tid som blodflödet stoppas - utföra injektionen och efterföljande ligering av artären inom 5 min av fastklämning av gemensamma leverartären.
3. Om möjligt öka förstoringen på dissekeringsmikroskop, så att den gastroduodenala artären är i skarp fokus och visas tillräckligt stor för att noggrant sätta in 30 G-nål. Placera nålen i injektionssprutan in i lumen av den gastroduodenala artären och tryck långsamt på kolven.
   Obs: Korrekt placering av nålen kommer att resultera i den injicerade lösningen som strömmar direkt genom korrekt leverartären och mot levern.
   1. Utföra injektionen mycket långsamt för att maximera transduktionseffektiviteten.
<li> När väl hela injektionsvolym har administrerats, sakta dra in nålen från artären.
Obs: Det bör inte finnas någon blödning från injektionsstället. I det fall att blödning inträffar, betyder det att klämman inte är korrekt placerade och bör snabbt anpassas.

6. Utgående

1. Passera en andra 7-0 Prolene sutur under den gastroduodenala artären, och knyt en andra permanent ligatur över injektionsstället.
2. Ta bort klämman från den gemensamma leverartären. Kontrollera att blodflödet genom korrekt leverartären mot levern har återställts.
   1. Skär de lösa ändarna av ligaturerna.
3. Kontrollera att det inte finns någon blödning innan han återvände tarmen och levern till bukhålan. Var noga med att tillägget returneras i den ursprungliga orienteringen.
4. Sutur muskeln och huden i separata skikt med användning av 4-0 vicryl suturmaterial med en böjd nål. plats continuous suturer ungefär 1 mm från varandra och dra åt.
   1. Under suturefasen, administrera en smärtstillande såsom buprenorfin (0,05 mg / kg).
5. Ta råtta från anestesi. Om isofluran har använts, bör råttan återfår medvetandet inom några minuter. Om MMF har använts som en injicerbar anestesi, antagonisera den med en subkutan injektion av Atipamezol (0,75 mg / kg), Flumazenil (0,2 mg / kg), och Naloxon (9,12 mg / kg), vilket kommer att motverka effekterna av anestesi och att djuren kan återfå medvetandet inom 20 min. Håll råttor varma med en infraröd uppvärmning lampa under den inledande uppvaknande fasen.
   1. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
   2. Skicka inte tillbaka ett djur som har opererats för sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt.
6. Övervaka råttor postoperativt för patologiska tecken på stress, och följmed smärtstillande medel i enlighet med den lokala djurvård och användning kommittén. Till exempel, kan buprenorfin administreras vid 0,05 mg / kg var 12 h.

Representative Results

Med erfarenhet, kan en framgång nästan 100% (vilket betyder att artären lyckades dissekerades och injiceras och djuret överlevde kirurgi) uppnås. Dock kommer hälsostatus råtta före kirurgi (graden av tumörbörda, underliggande leverfunktionen, etc.) naturligtvis spela en roll i resultatet av det kirurgiska ingreppet. Efter operationen kan råttor förväntas uppleva övergående viktförlust och en liten, övergående förhöjning av leverenzymer, även om buffert ensam, utan virus, injicerades.

Vi har tidigare visat att translever arteriell administrering av onkolytiska vesikulärt stomatitvirus (VSV) eller Newcastlesjukevirus (NDV) resulterar i en effektiv tumöromvandling och tumörspecifika virusreplikation, i en orthotopic, multifokal HCC modell ^8,9. Även de två virusen skiljer sig i sina intratumorala kinetikav virusreplikation, vid respektive tidpunkter av maximal virusreplikation, många härdar av virusförökning, vilket framgår av positiv enzymatisk färgning för LacZ reportergenen, kunde observeras endast i HCC knutor, medan de omgivande lever visade inga tecken på virus replikation (fig 3 och 4, som tidigare publicerade data ^8,9). Dessutom, morfometrisk analys av slumpmässigt utvalda VSV-behandlade tumör noduler visade att tumör transduktionseffektiviteten inte korrelerar med tumörstorlek (figur 3).

Dessutom, förmågan att leverera terapeutiska medel genom den hepatiska artären erbjuder också möjligheten att kombinera behandlingen med ett embolisering medel som alternativ till TACE. Vi har visat att, genom att blanda onkolytiska VSV vid en 1: 1-förhållande med en nedbrytbar stärkelsemikrosfär (DSM) embolisering medel och infusion av suspensionen thrgrundlig leverartären, kan vi uppnå massiv tumörnekros och mycket signifikant överlevnads förlängning hos råttor som bär multifokal HCC noduli ^11. Trans-leverartär förvaltningen av DSM resulterade i en nästan fullständig embolisering av tumörnoduli, samtidigt som en minimal inverkan på perfusion av normal levervävnad, vilket framgår av dynamisk kontrastförstärkt magnetisk resonanstomografi (DCE-MRI) med en gadolinium kontrast medel (Figur 5, tidigare publicerade data ^11).

Figur 1. Schematisk representation av lever arteriell infusion förfarande. De lever fartyg (vanlig leverartären, korrekt leverartären, och gastroduodenal artär) dissekeras med hjälp av ett dissektionsmikroskop. Efter ligering av den gastroduodenala artären och tidsmässiga block av den gemensamma leverartären,1 ml PBS eller VSV vektorn administreras via den gastroduodenala artären genom korrekt leverartären. Efter injektion är den proximala platsen av den gastroduodenala artären ligeras för att förhindra blödning, är blocket av den gemensamma leverartären släpptes, och återupptagande av leverblodflödet är bekräftad. Denna siffra har tidigare publicerats ^9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Fotografier av den hepatiska arteriell infusion förfarande. En laparotomiserades råtta visar placeringen av bukväggen upprullare och gasväv kloak (A). Efter att ha lyft ut lever lober, den gemensamma leverartären (betecknad CHA) och gastroduodenala artären (betecknad GA) identifieras och dissected (B). Efter ligering av den distala änden av den gastroduodenala artären, är den gemensamma leverartären tillfälligt fastklämd (C). Den gastroduodenala artären är nu klar för injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Transduktion och tumörselektiv replikering av VSV efter hepatisk artär administrering i råttor med multifokal HCC. Uppsättningar av djur (n = 3 / tidpunkt) offrades (A) vid 30 min och (B) vid dag 1 efter virus infusion, och frysta leversektioner färgades för β-gal-uttryck. Representativa sektioner visas vid låga (till vänster) och högre förstoringar (höger). Pilar indikerar gränserna mellan tumör skador och HEPAtic parenkymet. (C) Förhållande mellan tumörstorlek och transduktionseffektiviteten. HCC-innehållande leversektioner analyserades genom morfometrisk analys för att kvantifiera totala tumör och X-gal-positiva områden. Denna siffra har tidigare publicerats ^9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. NDV / F3aa (L289A) behandlingsresultat i tumörspecifik virusreplikation i hepatocellulär cancer (HCC) -haltig råttor. Man Buffalo råttor med multifokala orthotopic HCC knölar behandlades med rNDV / F3aa (L289A) (10 ⁸ _TCID50) genom lever arteriell infusion, och dödades vid den angivna tidpunkter efter behandling (n = 3). Tumör-innehållande leversektioner underkastadestill p-gal-färgning. Representativa sektioner visas på 5X (översikt) och 20X (förstoring av tumör och leversnitt) förstoring. Virustitrar kvantifierades genom TCID ₅₀ analys av lever och tumör-lysat, och uttrycks som medelvärde ± SD. NDV, Newcastlesjuka-virus; TCID _50, 50% vävnadskultur infektiös dos. Observera denna figur har modifierats från sin ursprungliga form ^8. Denna siffra har tidigare publicerats ^8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Dynamisk kontrastförstärkt magnetisk resonanstomografi av emboliseras HCC. MCA-RH7777 tumörbärande råttor, antingen nonembolized eller 30 min efter leverartär embolisering med DSM, avbildades med DCE-MRI. (<strong> A) Axial T1-vägs prekon (a, c) och post (b, d) bilder visar brist på kontrast i emboliseras tumörnoduler (d). (B) Data analyserades kvantitativt genom mätning av grå skala signalnivåer i lika stora områden av intresse i tumörnoduli och intilliggande normal levervävnad. En representativ uppsättning data visas. Denna siffra har tidigare publicerats ^11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary clippers	Aesculap	GT415	Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
30 G Needles	Braun	4656300	30 G x ½”
1 ml syringes	Braun	9161406V	Tuberculin syringe
Disposable scalpel	Feather	2975#15	#15 blade
Standard surgical scissors	Fine Science Tools	14001-13	Sharp/blunt, for opening skin and muscle
Adson forcep	Fine Science Tools	1101-12	With teeth, for grasping skin and muscle
Alm retractor	Fine Science Tools	17008-07	With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery
Gauze swabs	Lohmann & Rauscher	18504	7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use
Cotton-tipped applicator swabs	Lohmann & Rauscher	11970	Sterile
Fine-tipped foreceps	Fine Science Tools	11063-07	0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09	For delicate cutting
Micro-needle holder	Fine Science Tools	12076-12	For ligating gastroduodenal artery
Needle holder	Fine Science Tools	12005-15	Tungsten carbide jaws
7-0 Prolene sutures	Ethicon	8648H	Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery
4-0 Vicryl sutures	Ethicon	V3040H	With curved needle attached
Infrared warming lamp	Beurer	IL11	For maintaining body temperature post-operatively