Introduction
肝細胞癌（HCC）は重大な健康問題1,2作り、世界中で5番目に普及している癌、および癌関連死因の第3位です。腫瘍切除の対象とならない患者、または肝移植を待っている人のために、動脈塞栓術（TAE）または肝動脈化学塞栓療法（TACE）を含む局所領域療法は、標準的な緩和ケア3,4として適用されます。周囲の肝臓は門脈5,6からの血液供給の大部分を受け取りながら、これらの治療法は、腫瘍は肝動脈血流によってほぼ独占的に供給され、それによって肝臓でのデュアル血液供給のユニークな機能を活用します。
HCCの確立された治療法の非常に限られた有効性のために、腫瘍溶解性ウイルスは、有望な代替治療薬として浮上しています。 JX-594、最近PEXA-VECの名前を変更し、顆粒球メートルで武装し、チミジンキナーゼ欠損ワクシニアベクターでありますHCC 7のための第II相臨床試験を完了したacrophageコロニー刺激因子（GM-CSF）、。さらに最近では、ヒトインターフェロンβを発現する組換え水疱性口内炎ウイルスベクター（VSV）は、ソラフェニブ難治性HCC（NCT01628640）のための第I相臨床試験に入りました。腫瘍溶解性ウイルスは患者におけるHCCの臨床応用のための承認を得るに近づくように、多焦点疾患を標的とするための効果的な投与経路の必要性は明らかです。全身送達が非効率的な腫瘍伝達にほとんど効果があるが、腫瘍内のアプリケーションは、疾患の進行の影響を受けやすいuninjectable顕微鏡的病変を残して、注入された腫瘍に対する治療の有効性を制限することができます。
私たちは、同所性HCCをターゲットとする局所領域の方法で腫瘍溶解性ウイルス療法を管理するために、ラットにおける肝動脈を単離する方法を確立しました。我々は実証されていること、安全かつeffectiでこの投与経路結果免疫適格ラット8-10で有意な生存の延長で、その結果、多焦点HCC結節の伝達をVEの。ここでは、アクセス解剖、およびラットにおける肝動脈内に注入する方法について説明します。手順のスキームを図1に示されている（以前は9日公開）
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Protocol
注：次の手順は、我々の施設やバイエルン、ドイツの地方政府のガイドラインに沿って行われてきました。地元の動物のケアと使用委員会によって決定されるように、このプロトコルを再現するすべての試みは、動物の人道的な扱いのために地元のガイドラインに遵守で行う必要があります。例えば、多くの機関は、滅菌手袋が齧歯類手術中に着用されている必要があります。また、ウイルスの仕事は、個人と環境の安全のために注意しながら、地域の規則に従って実行されなければなりません。ケアが適切に汚染された廃棄物を処分すると（オートクレーブ処理し、製造元の指示に従って適切な抗ウイルス消毒剤で洗浄することにより、すなわち ）楽器やワークスペースをきれいにするために注意しなければなりません。
手術を開始する前に1.準備
- （オートクレーブ処理によって、すなわち ）手術器具を滅菌します。
- approprにウイルスを希釈使用されている特定のウイルスの毒性およびラット株の感受性に応じて変化するであろうiate濃度、。
注：雄バッファローラットにおける水疱性口内炎ウイルスを使用する場合、例えば、我々は、典型的には、このモデルにおける最大許容用量は1 mlの容積中に10 7 PFUを注入します。- 1ミリリットル注射器に（無菌法を使用して）ウイルスを事前入力し、注射器や針から空気を排除するために注意しながら、30 Gの針を取り付けます。
- 必要なすべての材料および機器と手術用のスペースを用意し、消毒するためにエタノールでエリアをスプレー。ガーゼ綿棒や綿棒アプリケーターを加湿するための無菌食塩水（0.9％NaCl）で小さな容器を埋めます。
ラットの作製
- （地元の動物のケアと使用委員会によって指定されるように）適切な用量30分の前に外科手術を開始するには、鎮痛剤を投与します。例えば、メタミゾール（100-200ミリグラム/キログラム）の高用量を投与します。
- 吸入（イソフルラン）または注射（ すなわち、また、MMFとして知られているメデトミジンの混合物（0.15ミリグラム/キログラム）、ミダゾラム（2ミリグラム/キログラム）、およびフェンタニル（0.005ミリグラム/キログラム）、）麻酔を用いてラットを麻酔。百分の1から3で気化器を通してisolfluraneを管理し、正常な呼吸と心拍数を維持するために、必要に応じて調整。
- 先に進む前に、ラットは完全に鎮静させ、フットパッドをつまんし、反応のために観察することによって痛みを感じることができないされていることを確認してください。
- 麻酔中の乾燥を防ぐために獣医の眼軟膏を適用します。
- ほんの少しの獣医のバリカンを使用して、性器の上にダウンに胸骨から腹部を剃ります。肌を傷つけることなく、深剃りを実現するために注意してください。
- 前足と後肢にテープを使用して手術台にラットを固定し、かつ、吸入麻酔を使用している場合は、適切なサイズノーズコーンに鼻を置きます。加熱パッドを配置ラットの下に体温を維持します。防腐塗料のアルコールリンスやアプリケーションに続いて、外科的グレードの消毒剤を使用して腹部を、消毒。
3.開腹
- このような＃15のように、小さな湾曲したメスを用いて、直接正中線に沿って表皮層に小さな縦切開を行います。剣状突起までの切開部を拡張します。次に、静かにメス切開を行い、その後、手術用ハサミで剣状突起までの切開部を拡張するためにAdsonのピンセットで持ち上げて筋層を切開。腹腔の臓器を穿刺するか、剣状突起の両側に小さな血管を傷つけないように注意してください。
- 筋肉と皮膚を広げ、全体の腹部を露出させるために腹部全体に開創器を置きます。
- 滅菌生理食塩水で2 7.5×7.5 cm 2のガーゼ綿棒を湿らせ、手術の上部に1を広げます図2（a）に示すように 、開いて、一番下の1。
肝動脈の4.絶縁
- 滅菌生理食塩水で湿らせた2湿らせた綿棒綿棒を使用して、静かに腹腔から腸と盲腸を持ち上げ、下のガーゼ綿棒上に置きます。湿った臓器を維持するために、道のそれらを保持するために、ガーゼの上に折ります。
- 2湿らせた綿棒綿棒を使用して、静かにこの段階でのビューの中で最も優勢な葉になります左側肝葉を、持ち上げます。ローブが完全に上向きに反転し、以前に配置されたガーゼ綿棒の上に載ることができるように、葉の下側に繊維質膜を通ってカット春のはさみの小さなペアを使用して、上向きに葉を裏返し、と。所定の位置に保持するために、葉の上にガーゼ綿棒を折ります。
- 今ビューの中で最も前葉である、次のローブ（前方尾状）に進みます。 THと解剖顕微鏡で微細な鉗子の電子援助は、それを解放し、それが自由に上向きに反転されることを可能にするために、葉の周囲の薄い膜を分析します。左側葉と一緒にガーゼ綿棒の下葉を置きます。
- 今表示されます後部尾状葉を、確認します。完全に後方尾状葉を分析し、以前に配置された肝葉と一緒に上向きにし、ガーゼの内側にそれを反転するための手順を繰り返し4.3。
- ただ、尾状葉の元の位置の下に、今目に見える、簡単にその強い脈動によって認識される、総肝動脈を見つけます。解剖学的右の動脈に続いて、視界から胃十二指腸と固有肝動脈を曖昧に厚い膜状物質を観察します。細かい鉗子を使用して、この材料を持ち上げ、ゆっくりと、この領域内の任意の小血管を避けるように注意しながら、それを引き裂きます。発生する可能性の出血を止めるために綿棒綿棒を使用してください。
- Aの位置を確認します膜が適切に解剖されたときに解剖顕微鏡の助けを借りてはっきりと見えるようになりますrterial分岐します。
- 2罰金、非外傷性鉗子を使用して、慎重に総肝動脈、胃十二指腸動脈、彼らは周囲の膜（ 図2B）から解放されるように、適切な肝動脈を解剖。
注射用動脈の5準備
- 胃十二指腸動脈の下に7-0プロレン縫合糸を渡し、そしてちょうど分岐（適切な配置については、 図1を参照）の上に、先端部に永久結紮糸を結ぶために、マイクロニードルホルダーを使用します。両端に残った縫合材料の約2インチを許可し、 図2Cのように、教えられた動脈を引っ張って針ホルダでそれらをクランプします。
- 一時的に血流（ 図2C）をブロックするための一般的な肝動脈に小さなクランプを置きます。
注：これはインプです針が動脈から除去されると大量の出血を防止するためortant。また、動脈血流の遮断が遅いウイルス投与と優れた形質導入効率を可能にします。- 重要： - 一般的な肝動脈をクランプの5分以内に、動脈の注射およびその後の連結を行う血流が停止している時間の量を制限するために迅速に作業。
- 可能な場合は、胃十二指腸動脈が鮮明であり、正確に30 G針を挿入するのに十分な大き見えるように、解剖顕微鏡の倍率を上げます。胃十二指腸動脈の内腔に注射器の針を置き、ゆっくりプランジャーを押します。
注：針の適切な配置は、適切な肝動脈を通って肝臓に向かって直接流れる注入した溶液になります。- 形質導入効率を最大にするために非常にゆっくりと注入を行います。
<リー>は全注入量が投与された後、ゆっくりと動脈から針を後退させます。
注：注射部位からの出血があってはなりません。出血が発生した場合には、クランプが適切に配置されていないとすぐに調整されるべきであることを示しています。
6.閉会
- 胃十二指腸動脈の下に第7-0プロレン縫合糸を渡し、および注射部位の上に第二の永久結紮糸を結びます。
- 総肝動脈からクランプを取り外します。肝臓に向けた適切な肝動脈を通る血流が回復されたことを確認します。
- 合字の緩い端をカットします。
- 腹腔に腸や肝臓を返す前に出血がないことを確認してください。付録には、元の位置に戻されるように注意してください。
- 湾曲した針と4-0ビクリル縫合材料を使用して、別々の層に筋肉と皮膚を縫合。プレイスcontinuousの縫合糸は、約1ミリメートル離れて、しっかりと引き出します。
- 縫合フェーズでは、そのようなブプレノルフィン（0.05ミリグラム/キログラム）のように鎮痛剤を投与します。
- 麻酔からラットを削除します。イソフルランが使用されている場合は、ラットは、数分以内に意識を取り戻す必要があります。 MMFは、注射可能な麻酔として使用されている場合には、麻酔の効果を逆転される、アチパメゾール（0.75ミリグラム/ kg）を、フルマゼニル（0.2ミリグラム/ kg）で、およびナロキソン（9.12ミリグラム/ kg）を皮下注射とそれに拮抗そして動物は20分以内に意識を取り戻すことができます。初期の覚醒段階の間に赤外線加温ランプで暖かいラットを保管してください。
- それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。
- 完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
- 苦痛の病理学的徴候のために、手術後のラットを監視し、フォロー地元の動物のケアと使用委員会で必要とされる鎮痛剤とアップ。例えば、ブプレノルフィンは0.05ミリグラムで投与することができる/ 12時間ごとのkgです。
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Representative Results
経験と、（動脈が正常に解剖し、注入し、動物は手術を生き延びたことを意味する）はほぼ100％の成功率を達成することができます。ただし、（ など腫瘍負荷の程度、基礎となる肝機能、）手術前にラットの健康状態は明らかに外科的介入の結果に役割を果たします。手術後、ラットは緩衝液のみても、一過性の体重減少及び肝酵素のわずかな、一時的な上昇を経験することが期待できる、ウイルスなしで、注入しました。
我々は以前に同所性、多病巣性HCCモデル8,9において、効率的な腫瘍伝達および腫瘍特異的ウイルス複製における腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（VSV）、またはニューカッスル病ウイルス（NDV）結果のトランス肝動脈投与を実証しました。 2つのウイルスは、それらの腫瘍内動態が異なるが、周囲の肝臓は、ウイルスの証拠を示さなかったウイルス複製の、LacZレポーター遺伝子について陽性酵素染色によって証明されるように最大のウイルス複製、ウイルス増殖の多数の病巣の各時点で、排他的にHCC結節内で観察することができ複製（ 図3及び図4に示すように、以前に公表されたデータ8,9）。また、ランダムに選択されたVSV-処理した腫瘍結節の形態計測分析は、腫瘍の形質導入効率は、腫瘍の大きさ（ 図3）と相関しないことを実証しました。
また、肝動脈を通って治療薬を送達する能力はまた、TACEに代わるものとして塞栓剤による治療を組み合わせる可能性を提供しています。分解性デンプンマイクロスフェア（DSM）塞栓剤との1の比率とサスペンションTHRを注入：私たちは、1で腫瘍溶解性VSVを混合することによって、ということを実証しました肝動脈ウワーッ、我々は多焦点HCC 11結節を有するラットにおける大規模な腫瘍壊死と非常に有意な生存の延長を達成することができました。ガドリニウム造影を用いたダイナミック造影磁気共鳴画像（DCE-MRI）により示されるように、正常肝組織の灌流に最小の効果を有しながらDSMの経肝動脈投与は、腫瘍結節のほぼ完全な塞栓を生じエージェント（ 図5、以前に公表されたデータ11）。
肝動注手順の図1.模式図。肝船舶（総肝動脈、固有肝動脈、および胃十二指腸動脈）は、解剖顕微鏡の助けを借りて解剖されています。胃十二指腸動脈と総肝動脈の一時的なブロックの連結した後、PBSまたはVSVベクター1mlの適切な肝動脈を介して胃十二指腸動脈を介して投与されます。注射後、胃十二指腸動脈の近位の部位は、出血を防止するために連結される、一般的な肝動脈のブロックが解除され、肝臓の血流の再開を確認します。この図は、以前に9を公開されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図肝動注手順2.写真。開腹ラットは、腹壁リトラクタとガーゼスワブ（A）の配置を示しています。肝葉、総肝動脈（指定CHA）と胃十二指腸動脈（指定GA）が同定され、DISを持ち上げた後、sected（B）。胃十二指腸動脈の遠位端部を連結した後、総肝動脈を一時的に（C）にクランプされます。胃十二指腸動脈は今、注射の準備ができている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
多焦点HCCを有するラットにおける図3.伝達と肝動脈内投与後のVSVの腫瘍選択的複製。動物のセットは（N = 3 /時点）後1日目のウイルスで30分間および（B）に（A）に屠殺しました注入、および凍結した肝臓切片は、β-gal発現について染色しました。代表的な切片は、低（左）と高い倍率（右）に示されています。矢印は腫瘍病変とHEPA間の境界を示していますチック実質。 （C）腫瘍の大きさと伝達効率の関係。 HCCを含む肝臓切片は、全腫瘍およびX-gal陽性領域を定量するために形態計測分析によって分析しました。この図は、以前に9を公開されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. NDV / F3aa（L289A）肝細胞癌における腫瘍特異的ウイルス複製における処理結果（HCC）-bearingラット。多焦点同所性HCC結節をもつ男性バッファローラットはrNDV / F3aa（L289A）（50 10 8 TCID）で処理しました肝動脈注入によって、および示された時間で死滅は、後処理ポイント（N = 3）。腫瘍を有する肝臓切片を供しβ-ギャルする染色を。代表的な切片は、5X（概要）および20X（腫瘍および肝臓セクションの倍率）倍率で示されています。ウイルス力価は、肝臓や腫瘍溶解物のTCID 50解析によって定量化し、平均±SDとして表されています。 NDV、ニューカッスル病ウイルス; TCID 50、50％組織培養感染量。 （注）この図は、元の形式8から変更されています。この図は、以前に8を公開されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
nonembolizedまたはDSMと肝動脈塞栓後の30分のいずれかを図5塞栓HCCのダイナミック造影磁気共鳴画像。MCA-RH7777担癌ラットは、DCE-MRIで画像化しました。 （<強い> A）アキシャルT1-秤量precontrast（c）及びpostcontrast（B、D）の画像は、塞栓形成腫瘍結節の（d）のコントラストの欠如を示します。 （B）データを定量的に腫瘍結節の関心の同じサイズの領域と隣接する正常肝臓組織における階調信号強度を測定することによって分析しました。一つの代表的なデータセットが示されています。この図は、以前に11を公開されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary clippers | Aesculap | GT415 | Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Needles | Braun | 4656300 | 30 G x ½” |
| 1 ml syringes | Braun | 9161406V | Tuberculin syringe |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#15 | #15 blade |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | Sharp/blunt, for opening skin and muscle |
| Adson forcep | Fine Science Tools | 1101-12 | With teeth, for grasping skin and muscle |
| Alm retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery |
| Gauze swabs | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use |
| Cotton-tipped applicator swabs | Lohmann & Rauscher | 11970 | Sterile |
| Fine-tipped foreceps | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For delicate cutting |
| Micro-needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | For ligating gastroduodenal artery |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12005-15 | Tungsten carbide jaws |
| 7-0 Prolene sutures | Ethicon | 8648H | Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | V3040H | With curved needle attached |
| Infrared warming lamp | Beurer | IL11 | For maintaining body temperature post-operatively |
References
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- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
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