Transarterial Verwaltung von onkolytischen Viren für lokoregionale von Orthotopische HCC bei Ratten

Introduction

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die fünfthäufigste Krebsart weltweit und die dritthäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Tod, es ist eine erhebliche Gesundheitsgefahr ^1,2 zu machen. Für Patienten , die nicht für eine Tumorresektion sind, oder solche Erwartung einer Lebertransplantation, lokoregionaler Therapie mit transarterielle Embolisation (TAE) oder transarterial Chemoembolisation (TACE) als Standard Palliativmedizin ^3,4 angewendet. Diese Therapien nutzen die einzigartige Funktion der doppelten Blutversorgung in der Leber , wodurch Tumoren fast ausschließlich durch hepatische arterielle Blutfluss zugeführt werden, während das umgebende Leber mit der Mehrheit seiner Blutversorgung aus der Pfortader ^5,6 erhält.

Aufgrund der extrem begrenzten Wirksamkeiten von etablierten Therapien für HCC haben onkolytischen Viren als vielversprechende Alternative Therapeutika hervorgegangen. JX-594, vor kurzem Pexa-Vec umbenannt, ist ein Thymidinkinase-deleted Vacciniavektor, bewaffnet mit Granulozyten-macrophage - Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), die Phase - II - Studie für HCC ⁷ abgeschlossen hat. In jüngerer Zeit hat ein rekombinantes vesikuläre Stomatitis-Virus-Vektor (VSV) humanes Interferon-beta Expression einer klinischen Phase-I-Studie für Sorafenib-refraktären HCC (NCT01628640) eingetragen. Als onkolytischen Viren bewegen näher Zulassung für die klinische Anwendung für HCC bei Patienten zu erhalten, wird die Notwendigkeit für eine effiziente Verwaltung Route Ziel multifokale Krankheit ist offensichtlich. Während die systemische Verabreichung durch ineffiziente Tumorübertragung weitgehend wirkungslos ist, intratumorale Anwendungen könnte die Wirksamkeit der Therapie auf das injizierte Tumor begrenzen, uninjectable mikroskopische Läsionen anfällig für Krankheitsprogression zu verlassen.

Wir haben ein Verfahren zur Isolierung der Leberarterie bei Ratten etabliert onkolytischen Virus-Therapie in einer Art und Weise verabreichen locoregional orthotope HCC abzuzielen. Wir haben gezeigt, dass diese Art der Anwendung führt zu sicheren und effective Transduktion von multifokalen HCC Knötchen, was zu einer signifikanten Überlebensverlängerung bei immunkompetenten Ratten ^8-10. Hier beschreiben wir das Verfahren des Zugreifens, Sezieren, und Einspritzen in die Leberarterie bei Ratten. Ein Schema des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt (vorher ⁹ veröffentlicht)

Protocol

Hinweis: Die folgenden Schritte wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien unserer Institution und der lokalen Regierung von Bayern, Deutschland durchgeführt. Alle Versuche, dieses Protokoll zu reproduzieren müssen mit den lokalen Richtlinien für die humane Behandlung von Tieren in die Einhaltung gemacht werden, wie es von den örtlichen Tierpflege und Verwendung Ausschuss diktiert. Zum Beispiel benötigen viele Institute, dass sterile Handschuhe während Nagetier Operation getragen werden. Darüber hinaus arbeiten mit Viren müssen entsprechend den örtlichen Vorschriften durchgeführt werden, für die persönliche und Umweltsicherheit zu kümmern. Es muss richtig gemacht werden , um kontaminierter Abfälle entsorgen und Instrumente zu reinigen und Arbeitsplatz (dh durch Autoklavieren und Reinigung mit einem geeigneten antivirale Desinfektionsmittel nach den Anweisungen des Herstellers).

1. Vorbereitungen Vor Beginn der Chirurgie

1. Sterilisieren chirurgischer Instrumente (dh durch Autoklavieren).
2. Verdünne das Virus an die appropriate Konzentration, die in Abhängigkeit von der Toxizität des spezifischen Virus verwendet wird und die Anfälligkeit des Rattenstamm variieren.
   Hinweis: Wenn beispielsweise bei männlichen Ratten Buffalo vesikulären Stomatitis - Virus verwenden, wir injizieren typischerweise 10 ⁷ pfu in einem 1 ml Volumen, was die tolerierte Höchstdosis in diesem Modell ist.
   1. PREFILL das Virus (unter aseptischen Bedingungen) in 1 ml Spritzen und befestigen 30 G Nadeln, wobei darauf geachtet Luft aus der Spritze und Nadel zu beseitigen.
3. Bereiten Sie den OP-Raum mit allen Materialien und Ausrüstung erforderlich, und sprühen Sie den Bereich mit Ethanol zu desinfizieren. Füllen Sie eine kleine Behälter mit steriler Kochsalzlösung (0,9% NaCl) zum Befeuchten Tupfer und Wattestäbchen.

2. Herstellung der Ratte

1. Verwalten Sie eine analgetische (wie von der örtlichen Tierpflege und Verwendung Ausschuss angegeben) auf der geeigneten Dosis 30 Minuten vor dem chirurgischen Eingriff zu beginnen. Beispielsweise,verabreichen eine hohe Dosis von Metamizol (100-200 mg / kg).
2. Anästhesieren die Ratte unter Verwendung von Inhalations (Isofluran) oder injizierbare (dh eine Mischung von Medetomidin (0,15 mg / kg), Midazolam (2 mg / kg) und Fentanyl (0,005 mg / kg), auch als MMF bekannt) Anästhesie. Verwalte isolflurane durch einen Verdampfer bei 1-3% und bei Bedarf nachjustieren normale Atmung und Herzfrequenz zu halten.
   1. Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Ratte vollständig sediert und nicht in der Lage, Schmerz zu empfinden, indem der Fuß-Pad Kneifen und für eine Reaktion zu beobachten.
   2. Tragen Sie eine Veterinäraugensalbe zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Rasieren Sie den Bauchbereich vom Brustbein bis auf knapp über den Genitalien eine kleine veterinärHaarSchneider verwenden. Achten Sie darauf, eine gründliche Rasur zu erreichen, ohne die Haut zu verletzen.
4. Befestigen Sie die Ratte auf die chirurgische Bett mit Klebeband an der Vorder- und Hinterbeine, und, wenn Inhalationsanästhesie verwenden, legen Sie die Schnauze in einem angemessen dimensionierten Bugnase. Legen Sie ein Heizkissenunterhalb des Rattenkörpertemperatur zu halten. Desinfizieren Sie den Bauchbereich ein chirurgischer Qualität Desinfektionsmittel, gefolgt von einem Alkohol spülen und Anwendung eines antiseptisch Farbe verwendet wird.

3. Laparotomie

1. Mit einem kleinen gekrümmten Skalpells, wie # 15, stellen eine kleine vertikale Inzision in der Hautschicht unmittelbar entlang der Mittellinie. Erweitern Sie den Schnitt bis zum Xyphoid Prozess. Als nächstes einzuschneiden Schicht den Muskel vorsichtig mit einem Paar von Adson Pinzette Anheben eines Skalpells Einschnitt zu machen, und dann den Schnitt verlängern mit chirurgische Scheren der Xyphoid Prozess. Achten Sie darauf, nicht die Organe der Bauchhöhle zu durchstechen oder die kleinen Schiffe, die auf beiden Seiten des Xyphoid Prozess zu beschädigen.
2. Legen Sie einen Aufroller über den Bauch, den Muskel und Haut verteilen und die gesamte Bauchbereich aus.
3. Befeuchten Sie zwei 7,5 x 7,5 cm ² Mullkompressen mit steriler physiologischer Kochsalzlösung und verbreiten eine über der Spitze des chirurgischenÖffnen und einem über den Boden, wie in 2A gezeigt.

4. Isolierung der Leberarterie

1. Die Verwendung von zwei angefeuchteten Wattetupfer, befeuchtet mit steriler physiologischer Kochsalzlösung, heben vorsichtig den Darm und Blinddarm aus der Bauchhöhle, und legen Sie sie auf dem unteren Mulltupfer. Falten Sie die Gaze über die Organe feucht zu halten und sie aus dem Weg zu halten.
2. Die Verwendung von zwei angefeuchteten Wattetupfer, heben Sie vorsichtig den linken seitlichen Leberlappen auf, die in dieser Phase die vorherrschende Keule in Sicht sein. Klappen Sie den Lappen nach oben, und ein kleines Paar Feder Schere, schneiden durch die Fasermembran auf der Unterseite des Flügels, so dass der Lappen vollständig nach oben geklappt werden und ruhen auf der Oberseite des zuvor platzierten Mulltupfer. Falten Sie die Gaze Tupfer über den Lappen es an Ort und Stelle zu halten.
3. Fahren Sie mit dem Lappen (der vordere caudatus), die jetzt die Vorderlappen in Sicht ist. Mit The Hilfe eines Binokular und feinen Pinzette, sezieren die dünne Membran, die die Lappen umgibt, um sie zu lösen und lassen Sie es frei nach oben gekippt werden. Platzieren Sie den Lappen unter dem Mulltupfer zusammen mit der linken Seitenlappen.
4. Beachten Sie die hinteren Lobus caudatus, die jetzt sichtbar. Wiederholen Sie Schritt 4.3 vollständig zu den hinteren Lobus caudatus sezieren und drehen Sie sie nach oben und in der Gaze zusammen mit den zuvor platzierten Leberlappen.
5. Direkt unter der ursprünglichen Position des Lobus caudatus, finden die gemeinsame Leberarterie, die nun sichtbar und leicht durch seine starke Pulsation erkannt. Im Anschluss an die Arterie an der anatomischen rechts, beobachten die dicke Membranmaterial die gastro und richtige Leberarterien aus Sicht verdunkeln. Mit einer feinen Pinzette, heben Sie dieses Material auf und es sanft reißen, dabei alle kleinen Gefäße in diesem Bereich zu vermeiden. Verwenden Sie Wattetupfer eine Blutung zu stoppen, die auftreten könnten.
   1. Suchen Sie die arterial Zweige, die mit Hilfe eines Binokular deutlich sichtbar sein wird, wenn die Membrane richtig präpariert werden.
6. Mit zwei feinen, atraumatische Pinzetten, sezieren vorsichtig die gemeinsame Leberarterie, A. gastroduodenalis, und die richtige Leberarterie , so dass sie von den umgebenden Membranen (2B) befreit werden.

5. Herstellung der Arterie für Injektions

1. Übergeben Sie eine 7-0 Prolene Naht unter der gastro - Arterie, und verwenden Sie eine Mikro-Nadelhalter eine permanente Ligatur am distalen Ende zu binden, gerade oberhalb der Bifurkation (Abbildung 1 für die richtige Platzierung zu sehen). Erlauben etwa 2 Zoll des Nahtmaterials an den Enden verbleibt, und klemmen sie mit einem Nadelhalter die Arterie gelehrt, wie in 2C zu ziehen.
2. Legen Sie eine kleine Klammer über die gemeinsame Leberarterie , um vorübergehend den Blutfluss (2C) blockieren.
   Hinweis: Dies ist important zu verhindern massive Blutungen, sobald die Nadel aus der Arterie entfernt wird. Darüber hinaus ist die Blockierung der arteriellen Durchblutung wird langsamer Virusgabe und eine bessere Transduktionswirksamkeit ermöglichen.
   1. Wichtig: Arbeiten Sie schnell die Höhe der Zeit zu begrenzen, dass der Blutfluss gestoppt wird - führen die Injektion und anschließende Ligation der Arterie innerhalb von 5 Minuten von der gemeinsamen Leberarterie zu klemmen.
3. Wenn möglich, erhöhen Sie die Vergrößerung auf dem Binokular, so dass die gastroduodenalen Arterie scharf ist und scheint groß genug, um genau die 30 G-Nadel einzufügen. Legen Sie die Nadel der Injektionsspritze in das Lumen des gastro-Arterie und schieben sich langsam auf den Kolben.
   Anmerkung: Die richtige Platzierung der Nadel in der injizierten Lösung führen direkt durch die A. hepatica propria fließt und in Richtung der Leber.
   1. Führen Sie die Injektion sehr langsam Transduktionseffizienz zu maximieren.
<li> Sobald die gesamte Injektionsvolumen verabreicht wurde, langsam die Nadel aus der Arterie zurückgezogen wird.
Hinweis: Es darf keine Blutung aus der Injektionsstelle sein. Im Falle, dass tritt Blutungen, zeigt es an, dass die Klemme nicht richtig platziert ist und schnell angepasst werden sollten.

6. Schluss

1. Übergeben Sie eine zweite 7-0 Prolene Naht unter der gastro-Arterie und eine zweite permanente Ligatur oberhalb der Injektionsstelle zu binden.
2. Entfernen Sie die Klammer von der gemeinsamen Leberarterie. Bestätigen Sie, dass der Blutfluss durch die richtige Leberarterie zur Leber wurde wiederhergestellt.
   1. Schneiden Sie die losen Enden der Ligatur.
3. Bestätigen, dass es keine Blutung ist, bevor die Därme und die Leber in die Bauchhöhle zurückkehrt. Achten Sie darauf, dass der Anhang in der ursprünglichen Ausrichtung zurückgeführt wird.
4. Nähen Sie den Muskel und Haut in unterschiedlichen Schichten mit 4-0 Vicryl Nahtmaterial mit einer gebogenen Nadel. Platz Dauer-s Nähte etwa 1 mm auseinander und ziehen Sie fest.
   1. Während des Nähens Phase verabreichen ein Analgetikum wie Buprenorphin (0,05 mg / kg).
5. Entfernen Ratte aus der Narkose. Wenn Isofluran verwendet worden ist, sollte die Ratte Bewußtsein innerhalb von einigen Minuten wieder. Wenn MMF hat als injizierbare Anästhesie verwendet, antagonisieren sie mit einer subkutanen Injektion von Atipamezol (0,75 mg / kg), Flumazenil (0,2 mg / kg) und Naloxon (9,12 mg / kg), die die Wirkungen der Anästhesie umkehrt und lassen Sie die Tiere das Bewusstsein innerhalb von 20 Minuten wieder zu erlangen. Halten Sie Ratten warm mit einer Infrarot-Wärmelampe während der anfänglichen Phase wakening.
   1. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat.
   2. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt.
6. Monitor-Ratten postoperativ für pathologische Anzeichen von Leiden und Folgemit Analgetika vom lokalen Tierpflege und Verwendung Ausschuss nach Bedarf. Beispielsweise kann Buprenorphin 0,05 mg / kg alle 12 Stunden verabreicht werden.

Representative Results

Mit Erfahrung, eine fast 100% Erfolgsrate (was bedeutet, dass die Arterie wurde erfolgreich präpariert und injiziert und das Tier überlebt Operation) erreicht werden. Allerdings ist der Gesundheitszustand der Ratte vor der Operation (Grad der Tumorlast, zugrunde liegenden Leberfunktion, etc.) wird offensichtlich eine Rolle für das Ergebnis des chirurgischen Eingriffs zu spielen. Nach der Operation können Ratten zu erwarten vorübergehende Gewichtsverlust zu erleben und eine leichte, vorübergehende Erhöhung der Leberenzyme, auch wenn Puffer allein, ohne Virus, injiziert wurde.

Wir haben bereits gezeigt , dass trans-hepatische arterielle Verabreichung von onkolytischen vesikulären Stomatitis - Virus (VSV) oder Newcastle Disease Virus (NDV) führt zu einer effizienten Tumorübertragung und tumorspezifischen Virusreplikation in orthotop, multifokale HCC - Modell ^8,9. Obwohl die beiden Viren unterscheiden sich in ihrer Kinetik intratumoraleder Virusreplikation kann zu den jeweiligen Zeitpunkten der maximalen Virusreplikation, wie zahlreiche Foci von Virusausbreitung, werden ausschließlich innerhalb HCC Knötchen durch positive enzymatische Färbung nachgewiesen, für die LacZ-Reportergen, beobachtet, während die umgebenden Lebern keine Anzeichen von Virus zeigten Replikation (Abbildung 3 und 4, die zuvor veröffentlichten Daten ^8,9). Zusätzlich morphometrische Analyse von zufällig ausgewählten VSV-behandelten Tumorknötchen gezeigt , dass Tumor Transduktionseffizienz nicht mit Tumorgröße (Abbildung 3) korreliert.

Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, therapeutische Mittel durch die Leberarterie zu liefern auch die Möglichkeit, die Therapie mit einer Embolisation Mittel als Alternative zu TACE zu kombinieren. Wir haben gezeigt, dass durch 1 bei einem onkolytischen VSV Mischen: mit einem abbaubaren Stärke Mikrokügelchen (DSM) Embolisation Mittel und Infundieren der Suspension thr 1-Verhältnisough die Leberarterie, konnten wir massiven Tumor - Nekrose und sehr signifikanten Überlebensverlängerung bei Ratten Lager multifokale HCC Knötchen ¹¹ erreichen. Trans-hepatische arterielle Verabreichung der DSM führte zu einer nahezu vollständigen Embolisation von Tumorknoten, während eine minimale Wirkung auf die Perfusion von normalem Lebergewebe aufweist, wie durch dynamische kontrastverstärkten Magnetresonanztomographie (DCE-MRI) unter Verwendung eines Gadolinium-Kontrast zeigten Mittel (5, zuvor veröffentlichten Daten ^11).

Abbildung 1. Schematische Darstellung der arteriellen Infusion Verfahren. Die Lebergefäße (gemeinsame Leberarterie, richtige Leberarterie und A. gastroduodenalis) werden mit Hilfe eines Binokular seziert. Nach dem Abbinden der gastroduodenalen Arterie und zeitlichen Block der gemeinsamen Leberarterie,1 ml PBS oder VSV-Vektor werden über die gastroduodenalen Arterie durch die richtige Leberarterie verabreicht. Nach der Injektion wird der proximale Ort der gastroduodenalen Arterie ligiert Blutung zu verhindern, wird der Block der A. hepatica communis gelöst und die Wiederaufnahme der Leberdurchblutung wird bestätigt. Diese Zahl wurde bisher ⁹ veröffentlicht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Die Fotos des arteriellen Infusion Verfahren. Eine laparotomisiert Ratte zeigt die Platzierung der Bauchdecke Aufroller und Mullkompressen (A). Nach dem Anheben der Leberlappen aus, die gemeinsame Leberarterie (bezeichnet als CHA) und gastro-Arterie (bezeichnet als GA) identifiziert und disWindparkbetrieb (B). Nachdem das distale Ende der gastroduodenalen Arterie Ligatur ist die gemeinsame Leberarterie eingespannt vorübergehend (C). Die gastro - Arterie ist nun bereit für die Injektion. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Transduction und tumorselektive Replikation von VSV nach Leberarterie Verabreichung bei Ratten multifokale HCC tragen. Sets von Tieren (n = 3 / Zeitpunkt) wurden (A) geopfert bei 30 min und (B) am Tag 1 post-Virus Infusion und gefrorenen Leberschnitte wurden für β-gal-Expression gefärbt. Repräsentative Abschnitte werden bei niedrigen (links) und höheren Vergrößerungen (rechts) gezeigt. Die Pfeile zeigen die Grenzen zwischen Tumorläsionen und Hepatic Parenchym. (C) Zusammenhang zwischen Tumorgröße und Transduktionseffizienz. HCC-haltigen Leberschnitten wurden durch morphometrische Analyse analysiert, um insgesamt Tumor und X-gal-positiven Flächen zu quantifizieren. Diese Zahl wurde bisher ⁹ veröffentlicht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. NDV / F3aa (L289A) Behandlungsergebnisse in tumorspezifischen Virusreplikation in hepatozellulären Karzinoms (HCC) -haltigen Ratten. Male Buffalo - Ratten multifokale orthotope HCC Knötchen Lager wurden mit rNDV / F3aa (L289A) (10 ⁸ TCID ₅₀₎ behandelt durch hepatische arterielle Infusion, und zum angegebenen Zeitpunkt getötet Punkten nach der Behandlung (n = 3). Tumor haltigen Leberschnitte wurden ausgesetztzu & beta; gal-Färbung. Repräsentative Abschnitte sind in 5X (Übersicht) und 20x (Vergrößerung des Tumors und Leberschnitten) Vergrößerung gezeigt. Virustiter wurden durch TCID ₅₀ Analyse von Leber und Tumor - Lysat quantifiziert und sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. NDV, Newcastle-Disease-Virus; TCID _50, 50% Gewebekultur infektiöse Dosis. Beachten Sie , dass diese Figur aus seiner ursprünglichen Form ⁸ modifiziert wurde. Diese Zahl wurde bereits ⁸ veröffentlicht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Dynamische kontrastmittelverstärkte Magnetresonanz - Bildgebung von embolisierten HCC. McA-RH7777 tumortragenden Ratten entweder nonembolized oder 30 Minuten nach der arteriellen Embolisation mit DSM wurden mit DCE-MRI abgebildet. (<strong> A) Axial T1 gewogen Präkontrast (a, c) und nach Kontrast (b, d) Bilder zeigen Mangel an Kontrast in embolisiert Tumorknoten (d). (B) Die Daten wurden durch Messung Graustufensignalintensitäten in gleich große Bereiche von Interesse von Tumorknoten und angrenzenden normalen Lebergewebe quantitativ analysiert. Ein Vertreter Datensatz wird angezeigt. Diese Zahl wurde bisher ¹¹ veröffentlicht. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary clippers	Aesculap	GT415	Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
30 G Needles	Braun	4656300	30 G x ½”
1 ml syringes	Braun	9161406V	Tuberculin syringe
Disposable scalpel	Feather	2975#15	#15 blade
Standard surgical scissors	Fine Science Tools	14001-13	Sharp/blunt, for opening skin and muscle
Adson forcep	Fine Science Tools	1101-12	With teeth, for grasping skin and muscle
Alm retractor	Fine Science Tools	17008-07	With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery
Gauze swabs	Lohmann & Rauscher	18504	7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use
Cotton-tipped applicator swabs	Lohmann & Rauscher	11970	Sterile
Fine-tipped foreceps	Fine Science Tools	11063-07	0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09	For delicate cutting
Micro-needle holder	Fine Science Tools	12076-12	For ligating gastroduodenal artery
Needle holder	Fine Science Tools	12005-15	Tungsten carbide jaws
7-0 Prolene sutures	Ethicon	8648H	Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery
4-0 Vicryl sutures	Ethicon	V3040H	With curved needle attached
Infrared warming lamp	Beurer	IL11	For maintaining body temperature post-operatively