Transarterial Toediening van Oncolytic Virussen voor Locoregionale Therapie van Orthotope HCC in Ratten

Introduction

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de vijfde meest voorkomende kanker in de wereld, en de derde belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde dood, waardoor het een belangrijke gezondheids-zorg ^1,2. Voor patiënten die niet in aanmerking komen voor resectie van de tumor, of die in afwachting van een levertransplantatie, locoregionale therapie waarbij transarterial embolisatie (TAE) of transarterial chemoembolization (TACE) worden toegepast als standaard palliatieve zorg ^3,4. Deze therapieën gebruik maken van de unieke eigenschap van de dubbele bloedtoevoer in de lever, waarbij tumoren bijna uitsluitend worden gevoed door de lever arteriële bloedstroom, terwijl de omringende lever het merendeel van de bloedtoevoer van de poortader ^5,6 krijgt.

Vanwege de extreem beperkte efficacies gevestigde therapieën voor HCC hebben oncolytische virussen ontwikkeld tot veelbelovende alternatieve therapeutica. JX-594, onlangs omgedoopt tot Pexa-Vec, is een thymidine-kinase verwijderd vaccinia vector, gewapend met granulocyt-macrophage-koloniestimulerende factor (GM-CSF), welke fase II klinische proef voor HCC ⁷ heeft voltooid. Meer recent is een recombinant vesiculair stomatitis virus vector (VSV) die humaan interferon-bèta een fase I klinische proef aangegeven voor sorafenib-refractaire HCC (NCT01628640). Als oncolytische virussen dichter op de goedkeuring voor klinische toepassing voor HCC patiënten bewegen, de noodzaak van een effectieve toedieningsroute targeten multifocale ziekte is evident. Terwijl systemische toediening nauwelijks worden door inefficiënte tumor transductie kan intratumorale toepassingen de werkzaamheid van de therapie om de geïnjecteerde tumor beperkt, waardoor uninjectable microscopische lesies vatbaar voor ziekteprogressie.

We hebben een wijze om de hepatische slagader bij ratten oncolytische virus therapie mogelijk in een locoregionale wijze orthotopische HCC streefdoel. We hebben aangetoond dat deze toedieningsweg resulteert in veilige en effective transductie van multifocale HCC knobbeltjes, wat resulteert in aanzienlijke overleving verlenging in immuuncompetente ratten ^8-10. Hier beschrijven we de methode hebben, ontleden en injecteren in de leverslagader bij ratten. Een schema van de procedure is weergegeven in figuur 1 (eerder gepubliceerd ⁹⁾

Protocol

Let op: De volgende stappen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van onze instelling en de lokale overheid van Beieren, Duitsland. Alle pogingen om dit protocol te reproduceren dient te geschieden in naleving met de lokale richtlijnen voor de humane behandeling van dieren, zoals gedicteerd door lokale dierlijke zorg en het gebruik commissie. Bijvoorbeeld, veel instituten vereisen dat steriele handschoenen worden gedragen tijdens knaagdier chirurgie. Bovendien moet het werk met virussen worden uitgevoerd in overeenstemming met de plaatselijke regelgeving, zorg voor persoonlijke en milieuveiligheid. Zorg moet worden genomen om goed te ontdoen van verontreinigd afval en instrumenten en werkruimte schoon te maken (dat wil zeggen, autoclaaf en reiniging met een geschikt antiviraal ontsmettingsmiddel volgens de instructies van de fabrikant).

1. Voorbereidingen Voordat u aan Surgery

1. Steriliseren chirurgische instrumenten (dat wil zeggen, in de autoclaaf).
2. Verdun het virus aan de KREDIETENiate concentratie die varieert afhankelijk van de toxiciteit van het specifieke virus wordt gebruikt en de gevoeligheid van de rat stam.
   Opmerking: Bijvoorbeeld, bij gebruik van vesiculaire stomatitis bij mannelijke Buffalo ratten, we meestal injecteren 10 ⁷ pfu in een volume van 1 ml, dat is de maximaal getolereerde dosis in dat model.
   1. Prefill het virus (met behulp van aseptische techniek) in 1 ml injectiespuiten, en bevestig 30 G naalden, zorg ervoor dat de lucht uit de spuit en naald.
3. Bereid de chirurgische ruimte met alle materialen en apparatuur die nodig is, en spuit het gebied met ethanol te desinfecteren. Vul een klein bakje met steriele zoutoplossing (0,9% NaCl) voor het bevochtigen van gaas swabs en wattenstaafje applicators.

2. Voorbereiding van de Rat

1. Dien een pijnstiller (zoals aangegeven door de lokale dierlijke zorg en het gebruik commissie), bij de juiste dosis 30 minuten voor het begin van de chirurgische procedure. Bijvoorbeeld,toedienen van een hoge dosis metamizol (100-200 mg / kg).
2. Verdoven van de rat, door middel inhalering (isofluraan) of injecteerbare (dwz een mengsel van Medetomidine (0,15 mg / kg), Midazolam (2 mg / kg) en fentanyl (0,005 mg / kg), ook bekend als MMF) anesthesie. Dien isolflurane door middel van een verdamper bij 1-3% en aan te passen als nodig is om een ​​normale ademhaling en de hartslag te houden.
   1. Voordat u verder gaat, ervoor zorgen dat de rat volledig verdoofd en niet in staat om pijn te voelen door knijpen de voet pad en observeren voor een reactie.
   2. Breng een veterinaire oogzalf tot droog te voorkomen tijdens de anesthesie.
3. Scheer de buik van het borstbeen naar beneden tot net boven de genitaliën met een kleine veterinaire tondeuse. Zorg ervoor dat een glad scheerresultaat te bereiken zonder de huid te beschadigen.
4. Bevestig de rat aan de chirurgische bed met behulp van tape op de voor- en achterpoten en, bij gebruik van inhalatie-anesthesie, plaatst u de snuit in een voldoende omvang neuskegel. Plaats een verwarmingselementonder het rat lichaamstemperatuur te handhaven. Ontsmet het buikgebied met een chirurgische kwaliteit ontsmettingsmiddel, gevolgd door een spoeling alcohol en toepassing van een antisepticum verf.

3. Laparotomie

1. Met behulp van een kleine gebogen scalpel, zoals # 15, een kleine verticale incisie in de huid laag direct langs de middellijn. Verleng de incisie tot aan de xyphoid proces. Vervolgens incise de spierlaag door voorzichtig te tillen met een paar Adson tang om een ​​scalpel incisie en trek de insnijding tot aan de xyphoid proces chirurgische schaar. Let erop dat de organen van de buikholte doorboren of de kleine bloedvaten aan weerszijden van de xyphoid nadelig beïnvloeden.
2. Plaats een retractor over de buik om de spieren en huid te verspreiden en bloot de hele buikstreek.
3. Bevochtig twee 7,5 x 7,5 cm ² gaaskompressen met steriele fysiologische zoutoplossing en gespreid over één boven de chirurgischeopening en een over de bodem, zoals getoond in figuur 2A.

4. Isolatie van de leverslagader

1. Met behulp van twee bevochtigde katoenen applicator doekjes bevochtigd met een steriele fysiologische zoutoplossing, de darmen en blindedarm til uit de buikholte, en leg ze op de lagere gaas swab. Vouw het gaas naar de organen vochtig te houden en om ze uit de weg te houden.
2. Met behulp van twee bevochtigde katoenen applicator wattenstaafjes, voorzichtig til de linker laterale lever kwab, die de meest overheersende kwab gezien in dit stadium zal zijn. Flip de lob omhoog en, met een paar kleine lente schaar, dwars door de vezelige membraan aan de onderzijde van de nok, zodat de lob volledig opgeklapt worden en rusten bovenop de eerder geplaatste gaas doekje. Vouw het gaas swab over de kwab om het te houden op zijn plaats.
3. Verder met de volgende kwab (de voorste nucleus caudatus), die nu de voorkwab gezien. met the behulp van een dissectie microscoop en fijne tang, ontleden het dun membraan rond de kwab om deze los en laat hem vrij omhoog worden omgedraaid. Plaats de lob onder het gaas staafje met de linker laterale lob.
4. Let op de achterste Spiegelse kwab, die nu zichtbaar zal zijn. Herhaal stap 4.3 met het achterste Spiegelse kwab volledig te ontleden en te spiegelen naar boven en in het gaas samen met de eerder geplaatste lever lobben.
5. Net onder de oorspronkelijke positie van de Spiegelse kwab, vindt de leverslagader, die nu zichtbaar en gemakkelijk te herkennen aan zijn sterke pulsaties zal zijn. Naar aanleiding van de slagader naar de anatomische rechts, let op de dikke membraneuze materiaal verduistert de gastroduodenale en de juiste lever slagaders uit het zicht. Met behulp van fijne tang, til dit materiaal en voorzichtig scheuren, zorg ervoor dat alle kleine schepen in dit gebied te voorkomen. Gebruik katoenen applicator doekjes om eventuele bloeden die kunnen optreden te stoppen.
   1. Zoek het eenrterial takken, die duidelijk zichtbaar met behulp van een stereomicroscoop bij de membranen goed worden ontleed.
6. Met behulp van twee fijne, atraumatische pincet voorzichtig ontleden de leverslagader, gastroduodenale slagader en de juiste leverslagader zodat zij bevrijd zijn van de omliggende membranen (Figuur 2B).

5. Bereiding van de slagader voor injectie

1. Laat een 7-0 Prolene hechtdraad onder de gastroduodenale slagader, en gebruik een micro-naaldhouder een vaste ligatuur binden aan het distale uiteinde, net boven de bifurcatie (zie Figuur 1 voor de juiste plaatsing). Rekening met ongeveer 2 inch hechtmateriaal nog op de uiteinden en klem ze een naaldhouder aan de slagader onderwezen trekken, zoals in figuur 2C.
2. Plaats een kleine klem op de leverslagader om de bloedstroom (figuur 2C) tijdelijk te blokkeren.
   Let op: Dit is important massale bloeden te voorkomen wanneer de naald uit de arterie verwijderd. Bovendien zal de blokkering van arteriële bloedstroom mogelijk maken langzamere virustoediening en betere transductie efficiëntie.
   1. Belangrijk: Werk snel om de hoeveelheid tijd die bloedstroom beperken gestopt - de injectie toe en daaropvolgende ligatie van de arterie binnen 5 min van klemmen van de leverslagader.
3. Als het mogelijk is, de vergroting van de microscoop ontleden, zodanig dat de gastroduodenale slagader is in scherpe focus en lijkt groot genoeg om nauwkeurig steek de 30 G naald. Plaats de naald van de injectiespuit in het lumen van de gastroduodenale slagader en druk langzaam op de zuiger.
   Noot: De juiste plaatsing van de naald resulteert in de geïnjecteerde oplossing direct stroomt door het juiste hepatische slagader en naar de lever.
   1. Voer de injectie heel langzaam aan transductie efficiëntie te maximaliseren.
<li> Zodra bij injectievolume is toegediend, langzaam trek de naald uit de slagader.
Opmerking: Er mag geen bloeden uit de injectieplaats zijn. In het geval dat bloeding optreedt, betekent dit dat de klem niet goed geplaatst en moeten snel worden aangepast.

6. Closing

1. Laat een tweede 7-0 Prolene hechtdraad onder de gastroduodenale slagader, en bind een tweede permanente ligatuur boven de injectieplaats.
2. Verwijder de klem van de leverslagader. Controleer of de bloedstroom door de juiste leverslagader naar de lever is hersteld.
   1. Snijd de losse eindjes van de ligaturen.
3. Controleer dat er geen bloeden, voordat de darmen en de lever naar de buikholte. Zorg ervoor dat de appendix wordt teruggebracht in de oorspronkelijke oriëntatie.
4. Hechtdraad de spier en huid in afzonderlijke lagen met behulp van 4-0 vicryl hechtmateriaal met een gebogen naald. plaats Continuous hechtingen ongeveer 1 mm van elkaar en trek stevig vast.
   1. Tijdens de fase hechten, dienen een analgeticum zoals buprenorfine (0,05 mg / kg).
5. Verwijder rat uit anesthesie. Als isofluraan is gebruikt, moet de rat bewustzijn binnen enkele minuten terug te krijgen. Als MMF is gebruikt als een injecteerbare verdoving antagoniseren met een subcutane injectie van Atipamezole (0,75 mg / kg), Flumazenil (0,2 mg / kg) en naloxon (9,12 mg / kg), die de effecten van de verdoving omkeren en laat de dieren weer bij bewustzijn komen binnen 20 minuten. Houd ratten warm met een infrarood opwarming lamp tijdens de eerste fase van ontwaken.
   1. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
   2. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
6. Monitor ratten post-operatief voor pathologische tekenen van angst, en de followmet pijnstillers zoals vereist door de lokale dierlijke zorg en het gebruik commissie. Zo kan buprenorfine worden toegediend bij 0,05 mg / kg elke 12 uur.

Representative Results

Met ervaring, kan een bijna 100% slagingspercentage (wat betekent dat de slagader met succes werd ontleed en geïnjecteerd, en het dier overleefde chirurgie) worden bereikt. Echter, de gezondheidsstatus van de rat voorafgaand aan de operatie (mate van tumorlast onderliggende leverfunctie, enz.) Vanzelfsprekend een rol spelen bij de uitkomst van de chirurgische ingreep. Na de operatie kunnen ratten worden verwacht voorbijgaand gewichtsverlies en een geringe, voorbijgaande stijgingen van leverenzymen ervaren, zelfs als alleen buffer zonder virus werd geïnjecteerd.

We hebben eerder aangetoond dat trans-lever arteriële toediening van oncolytische vesiculair stomatitis virus (VSV) of Newcastle disease virus (NDV) resulteert in een efficiënte tumor transductie en tumor-specifieke virus replicatie, in een orthotope, multifocale HCC model ^8,9. Hoewel de twee virussen verschillen in kinetiek intratumoralevan virusreplicatie, bij de respectievelijke tijdstippen van maximale virusreplicatie vele foci van viruspropagatie, zoals bewezen door positieve enzymatische kleuring voor LacZ reportergen werden waargenomen uitsluitend binnen HCC knobbeltjes, terwijl de omringende levers vertoonde geen bewijs van virus replicatie (Figuur 3 en 4, van vroegere studies ^8,9). Bovendien, morfometrische analyse van willekeurig gekozen VSV-behandelde tumoren aangetoond dat tumor transductie efficiëntie niet correleert met tumorgrootte (figuur 3).

Bovendien het vermogen om therapeutische middelen af ​​door de leverslagader biedt ook de mogelijkheid om therapie te combineren met een embolisatie middel als alternatief voor TACE. We hebben aangetoond dat, door mengen oncolytische VSV op een 1: 1 verhouding met een afbreekbare microsfeer zetmeel (DSM) embolisatie middel en infusie van de suspensie thrdoorgedreven de leverslagader, kunnen we bereiken enorme tumor necrose en zeer aanzienlijke verlenging overleving in ratten met multifocale HCC knobbeltjes ^11. Trans-hepatische arteriële toediening van DSM tot een vrijwel volledige embolisatie van tumoren, terwijl ze een minimale invloed op de perfusie van normaal leverweefsel, zoals aangetoond door dynamische contrast versterkte MRI (DCE-MRI) met een gadolinium contrast middel (Figuur 5, eerder gepubliceerde gegevens ^11).

Figuur 1. Schematische weergave van de lever arteriële infusie procedure. De lever schepen (leverslagader, goede leverslagader en gastroduodenale slagader) worden ontleed met behulp van een dissectie microscoop. Na ligatie van de gastroduodenale slagader en temporele blok van de leverslagader,1 ml van PBS of VSV vector worden toegediend via de gastroduodenale slagader door de juiste leverslagader. Na injectie wordt de proximale locatie van de gastroduodenale slagader geligeerd om bloeden te voorkomen, wordt het blok van de leverslagader vrijkomen en de hervatting van de hepatische bloedstroom bevestigd. Dit cijfer is eerder gepubliceerd ^9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Foto's van de hepatische arteriële infusie procedure. Een laparotomized rat toont de plaatsing van de buikwand retractor en gaaskompressen (A). Na het opheffen van de lever lobben, de leverslagader (aangeduid CHA) en gastroduodenale slagader (aangewezen GA) worden geïdentificeerd en dissected (B). Na ligeren van het distale uiteinde van de gastroduodenale slagader wordt de leverslagader tijdelijk ingeklemd (C). De gastroduodenale slagader is nu klaar voor injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Transductie en tumor-selectieve replicatie van VSV na leverslagader toediening bij ratten met multifocale HCC. Sets van dieren (n = 3 / tijdstip) werden opgeofferd (A) en 30 min en (B) op dag 1 post-virus infusie en bevroren lever werden gekleurd voor β-gal expressie. Representatieve secties worden getoond bij lage (links) en hogere vergrotingen (rechts). Pijlen geven de grenzen tussen tumor laesies en hepatic parenchym. (C) Verbindingen tussen tumorgrootte en transductie efficiëntie. HCC-bevattende lever secties werden geanalyseerd door morfometrische analyse om de totale tumor en X-gal-positieve gebieden te kwantificeren. Dit cijfer is eerder gepubliceerd ^9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. NDV / F3aa (L289A) behandeling leidt tot tumor-specifieke virus replicatie in hepatocellulair carcinoom (HCC) dragende ratten. Mannelijke Buffalo ratten met multifocale orthotope HCC knobbeltjes werden behandeld met rNDV / F3aa (L289A) (10 ⁸ _TCID50) door hepatische arteriële infusie en gedood op de aangegeven tijdstippen na behandeling (n = 3). Tumor-bevattende leversecties onderworpenaan P-gal kleuring. Representatieve secties worden getoond bij 5X (overzicht) en 20X (vergroting van de tumor en de lever secties) vergroting. Virale titers werden gekwantificeerd door _TCID50 analyse van lever en tumor lysaat en worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. NDV, NCD-virus; _TCID50, 50% weefselkweek infectieuze dosis. Let op, deze figuur is gewijzigd ten opzichte van de oorspronkelijke vorm ^8. Dit cijfer is eerder gepubliceerd ^8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Dynamisch contrast-enhanced magnetische resonantie beeldvorming van geëmboliseerde HCC. McA-RH7777 tumordragende ratten, ofwel nonembolized of 30 minuten na de lever arteriële embolisatie met DSM, werden afgebeeld met DCE-MRI. (<strong> A) Axial T1-gewogen precontrast (a, c) en postcontrast (b, d) beelden tonen weinig contrast in geëmboliseerde tumoren (d). (B) De gegevens werden kwantitatief geanalyseerd door het meten van grijs-schaal signaal intensiteiten in even grote regio's van belang van tumoren en aangrenzend normaal leverweefsel. Een vertegenwoordiger dataset wordt getoond. Dit cijfer is eerder gepubliceerd ^11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary clippers	Aesculap	GT415	Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
30 G Needles	Braun	4656300	30 G x ½”
1 ml syringes	Braun	9161406V	Tuberculin syringe
Disposable scalpel	Feather	2975#15	#15 blade
Standard surgical scissors	Fine Science Tools	14001-13	Sharp/blunt, for opening skin and muscle
Adson forcep	Fine Science Tools	1101-12	With teeth, for grasping skin and muscle
Alm retractor	Fine Science Tools	17008-07	With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery
Gauze swabs	Lohmann & Rauscher	18504	7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use
Cotton-tipped applicator swabs	Lohmann & Rauscher	11970	Sterile
Fine-tipped foreceps	Fine Science Tools	11063-07	0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09	For delicate cutting
Micro-needle holder	Fine Science Tools	12076-12	For ligating gastroduodenal artery
Needle holder	Fine Science Tools	12005-15	Tungsten carbide jaws
7-0 Prolene sutures	Ethicon	8648H	Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery
4-0 Vicryl sutures	Ethicon	V3040H	With curved needle attached
Infrared warming lamp	Beurer	IL11	For maintaining body temperature post-operatively