Introduction
간세포 암 (HCC)은 전 세계적으로 다섯 번째 가장 일반적인 암, 그리고 중요한 건강 문제 1,2하고 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인이다. 색전술 (TAE) 또는 화학 색전술 (TACE)을 포함하는 종양 절제술, 또는 그 기다리고 간 이식, 국소 치료를받을 수없는 환자의 표준 완화 의료 3,4으로 적용됩니다. 주변 간 간문맥 5,6-로부터 혈액 공급의 대부분을 수신하면서 이들 치료법은 종양 간 동맥 혈류가 거의 독점적으로 공급되고, 이에 의해 간에서 이중 혈액 공급의 고유 기능을 이용한다.
HCC에 대한 설립 치료의 매우 제한된 효능으로 인해 종양 살상 바이러스는 유망한 대체 치료제로 등장했다. JX-594는 최근 Pexa-VEC 이름을 변경하는 티미 딘 키나제 삭제 된 우두 벡터, 과립구-m로 무장이다HCC 7의 II 상 임상 시험이 완료된 acrophage 콜로니 자극 인자 (GM-CSF). 최근 인간 인터페론 - 베타를 발현하는 재조합 수 포성 구내염 바이러스 벡터 (VSV)는 sorafenib-내화 HCC (NCT01628640)에 대한 상 임상 시험을 체결했다. 종양 살상 바이러스가 가까운 환자에서 간세포 암종에 대한 임상 응용 프로그램에 대한 승인을 얻기로 이동함에 따라, 효과적인 투여 경로에 대한 필요성은 다 초점 질병이 분명하다 목표로한다. 전신적 전달로 인해 비효율적 종양 전달에 크게 효과가 있지만, 애플리케이션은 종양 질환 진행에 민감 uninjectable 미세한 병변을 떠나는 주입 종양 치료의 효능을 제한 할 수있다.
우리는 소성을 HCC를 대상으로하는 국소 방식으로 콜리 틱 바이러스 치료를 관리하는 쥐의 간 동맥을 분리하는 방법을 설립했다. 우리는 증명이 안전하고 효과적인 광고에서이 투여 경로 결과면역 능력이 쥐 8-10에서 중요한 생존 연장의 결과로, 다 초점 HCC 결절의 전달을했습니다. 여기서는, 액세스 해부 및 쥐의 간동맥에 주입하는 방법을 설명한다. 절차의 방식은도 1에 도시된다 (이전 9 공개)
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Protocol
주 : 다음 단계는 우리 기관의 지침과 바바리아, 독일의 지방 정부에 따라 수행되고있다. 지역 동물 관리 및 사용위원회에 의해 결정으로이 프로토콜을 재현하는 모든 시도는 동물의 인도적인 처리를위한 로컬 가이드 라인 준수에해야합니다. 예를 들어, 많은 기관은 멸균 장갑 설치류 수술 중 착용 할 것을 요구하고 있습니다. 또한, 바이러스와 작품은 개인과 환경 안전을위한주의하면서 현지 규정에 따라 수행해야합니다. 관리가 제대로 오염 된 폐기물 처분하고 (고온 가압 멸균 및 제조업체의 지침에 따라 적절한 항 바이러스 소독제로 청소하여, 예) 장비와 작업 공간을 청소주의해야한다.
시작 수술 전에 1. 준비
- (고압 증기 멸균에 의해, 즉) 수술기구를 소독.
- appropr에 바이러스를 희석사용되는 특정 바이러스의 독성 래트 균주의 민감성에 따라 달라질 늦었 농도.
주 : 수컷 버팔로 쥐 포성 구내염 바이러스를 사용하는 경우 예를 들어, 우리는 일반적으로 그 모델에서의 최대 허용 투여 량 인 1 ml의 부피에서 107 PFU를 주입.- 1 ml를 주사기에 (무균 기술을 사용하여) 바이러스를 미리 기입하고, 주사기와 바늘에서 공기를 제거하기 위해주의하면서 30 G 바늘을 연결합니다.
- 필요한 모든 재료와 장비와 수술 공간을 준비하고 소독하는 에탄올로 영역을 스프레이. 거즈 면봉과 면봉 어플리케이터를 가습에 대한 멸균 생리 식염수 (0.9 % NaCl을)이있는 작은 용기를 입력합니다.
쥐 2. 준비
- (로컬 동물 관리 및 사용위원회에 의해 지정된대로) 적절한 용량을 30 분에서 전에 수술 절차를 시작하기에, 진통제를 관리 할 수 있습니다. 예를 들면,설피 린의 높은 용량 (100 ~ 200 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.
- 흡입 (이소 플루 란) 또는 주사 (즉, 또한 MMF로 알려진 메데 토미의 혼합물 (0.15 ㎎ / ㎏), 미다 졸람 (2 ㎎ / ㎏)과 펜타닐 (0.005 ㎎ / ㎏)) 마취를 사용하여 쥐를 마취. 1-3%에 증발기를 통해 isolflurane 관리 정상 호흡 및 심박수를 유지하기 위해 필요한만큼 조정한다.
- 진행하기 전에, 쥐가 완전히 진정과 발 패드를 곤란하게하고 반응 관찰하여 통증을 느낄 수없는되어 있는지 확인합니다.
- 마취 동안 건조를 방지하기 위해 동물의 눈 연고를 적용합니다.
- 단지 작은 동물 머리 깎기를 사용하여 성기 위 아래로 흉골에서 복부 영역을 면도. 피부를 부상없이 밀착 면도를 달성하기 위해주의하십시오.
- 흡입 마취를 사용하여 적절한 크기의 코 콘에 주둥이를 배치하면, 앞장서고와 뒷다리에 테이프를 사용하여 수술 침대에 쥐를 수정합니다. 가열 패드를 배치래트 아래 체온을 유지한다. 방부제 페인트 알코올 린스 및 응용 하였다 외과 등급의 살균제를 사용하여 복부를 소독.
3. 개복술
- 예 # 15로, 작은 만곡 메스를 사용하여, 직접 정중선을 따라 스킨 층의 작은 수직 절개를 만든다. xyphoid 과정까지 절개를 확장합니다. 다음 부드럽게 메스 절개를하기 Adson 집게 쌍으로 올려 근육층을 절개하고 수술 용 가위로 xyphoid 공정까지 절개를 연장한다. 복강의 장기를 천공하거나 xyphoid 프로세스 양쪽의 작은 혈관 손상되지 않도록주의한다.
- 근육과 피부를 확산하고, 전체 복부를 노출 복부에 걸쳐 트랙터를 놓습니다.
- 멸균 생리 식염수와 함께이 7.5 X 7.5 cm 2 거즈 면봉을 적셔 수술의 상단에 하나를 확산도 2a에 도시 된 바와 같이, 개방 및 하단에 하나.
간장 동맥 4. 분리
- 부드럽게 복강 밖으로 장과 맹장을 들어 올려 하부 거즈 면봉에 배치, 멸균 생리 식염수에 적신이 젖은면 도포 면봉을 사용. 촉촉한 장기를 유지하고 길에서 그들을 유지하기 위에 거즈를 접으십시오.
- 두 적신면 도포 면봉을 사용하여 부드럽게이 단계에서보기에 가장 지배적 인 로브 될 것입니다 왼쪽 측면 간 엽을 올립니다. 로브가 완전히 위쪽으로 이성을 상실하고 이전에 배치 거즈 면봉의 상단에 휴식을 할 수 있도록 로브의 밑면에있는 섬유 멤브레인을 통해 잘라 봄 가위의 작은 쌍을 사용하여 위쪽 로브 플립합니다. 제자리에 고정하기 위해 엽 위에 거즈 면봉을 접습니다.
- 지금보기에서 가장 전엽 인 다음 로브 (전방 미상)를 계속합니다. 번째로해부 현미경 미세 겸자 E 보조제,이를 분리하고 자유롭게 위쪽으로 대칭되도록하기 위하여 로브를 둘러싼 박막을 해부. 왼쪽 측면 로브와 함께 거즈 면봉 아래 로브를 놓습니다.
- 지금 볼 수 있습니다 후방 꼬리가 로브를 관찰합니다. 완전히 후방 꼬리가 로브를 해부 위쪽과 거즈 안에 함께 이전에 배치 간 로브와 그것을 뒤집어 단계를 반복 4.3.
- 그냥 꼬리가 로브의 원래 위치 아래에, 지금 눈에 보이는 쉽고 강력한 맥동에 의해 인식 될 것입니다 일반적인 간동맥을 찾을 수 있습니다. 해부학 오른쪽에있는 동맥을 이어보기에서 십이지장과 적절한 간 동맥을 가리는 두꺼운 멤브레인 재료를 관찰합니다. 미세 집게를 사용하여이 물질을 들어 올려 조심스럽게이 지역에있는 작은 혈관을 피하기 위해주의하면서 그것을 찢어. 발생할 수있는 출혈을 멈추게하는면 도포 면봉을 사용합니다.
- ㄱ을 찾습니다멤브레인이 제대로 해부하면 해부 현미경의 도움을 명확히 볼 수 rterial 분기.
- 이 좋은, 무 외상성 집게를 사용하여 조심스럽게 일반적인 간 동맥, 위 십이지장 동맥, 그들은 주변의 막 (그림 2B)에서 해방되도록 적절한 간 동맥을 해부하다.
주입을위한 동맥 5. 준비
- 십이지장 동맥 아래에 7-0 prolene의 봉합을 전달, 그냥 분기 (적절한 배치를위한 그림 1 참조) 이상, 선단에 영구적 인 끈을 묶어 마이크로 바늘 홀더를 사용합니다. 끝 부분에 남아있는 봉합 재료의 약 2 인치를 허용하고도 2c에서와 같이 가르쳐 동맥을 당겨 바늘 홀더를 고정.
- 일시적으로 혈액의 흐름 (그림 2C)를 차단하는 일반적인 간 동맥에 작은 클램프를 놓습니다.
참고 :이 꼬마 도깨비입니다바늘이 혈관으로부터 제거되면 ortant 다량 출혈을 방지한다. 또한, 동맥 혈류의 차단은 느린 바이러스 관리 및 더 나은 전달 효율성을 수 있습니다.- 중요 혈액 흐름이 정지되는 시간 제한 신속하게 작업 - 공통 간동맥 클램핑 5 분 이내에 동맥 주입 이후 결찰을 수행한다.
- 가능하다면, 위 십이지장 동맥 날카로운 초점이 정확하게 30 G 바늘을 삽입하기에 충분히 큰 표시되도록, 해부 현미경의 배율을 높일 수 있습니다. 십이지장 동맥의 내강에 주입 주사기의 바늘을 놓고 플런저를 밀어 천천히.
참고 : 바늘의 적절한 배치는 적절한 간동맥을 통해 간으로 직접 흐르는 주입 된 용액에 발생합니다.- 전달 효율을 최대화하는 것이 매우 천천히 주입을 수행한다.
<리> 전체 주입량을 투여 한 후, 천천히 동맥 바늘 후퇴.
참고 : 주사 부위로부터 출혈이 없어야합니다. 출혈이 발생 않는 경우에는, 상기 클램프가 적절하게 배치되지 않고 신속하게 조정되어야 함을 나타낸다.
6. 결산
- 십이지장 동맥 아래 두 번째 7-0 prolene의 봉합을 전달하고, 주사 부위 위에 제 2 영구 합자 넥타이.
- 일반적인 간동맥에서 클램프를 제거합니다. 간으로 적절한 간 동맥을 통해 혈액의 흐름을 확인하는 복원되었습니다.
- 합자의 느슨한 끝을 잘라.
- 복강에 창자와 간을 반환하기 전에 더 출혈이 없음을 확인합니다. 부록은 원래의 방향으로 반환주의하십시오.
- 곡선 바늘로 4-0 vicryl 봉합사 재료를 사용하여 별도의 레이어에서 근육과 피부를 봉합. 장소 continuou의 봉합은 약 1mm 떨어져 단단히 잡아 당깁니다.
- 봉합 단계에서, 진통제 등의 부 프레 노르 핀 등 (0.05 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다.
- 마취에서 쥐를 제거합니다. 이소 플루 란이 사용 된 경우, 래트는 몇 분 안에 의식을 회복한다. MMF는 주사 마취로 사용 된 경우, 마취 효과를 반전되는, Atipamezole (0.75 ㎎ / ㎏), 플루 마제 닐 (0.2 ㎎ / ㎏) 및 날록손 (9.12 ㎎ / ㎏)의 피하 주사로 길항 과 동물이 20 분 안에 의식을 회복 할 수 있습니다. 초기 각성 단계에서 적외선 온난화 램프와 따뜻한 쥐를 유지합니다.
- 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오.
- 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.
- 고통의 병적 징후가 수술 후 쥐를 모니터링하고 follow-진통제와 로컬 동물 관리 및 사용위원회가 필요. 예를 들면, 부 프레 노르 핀은 / 0.05 mg을 투여 12 시간마다 kg을 할 수있다.
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Representative Results
경험 (동맥 성공적 해부 주입 한 동물이 수술을 살아되었음을 의미 함)이 거의 100 % 성공률을 달성 할 수있다. 그러나, (기타 종양 부담 정도 기본적인 간 기능) 수술 전에 래트의 상태 분명 수술 개입의 결과에 중요한 역할을한다. 수술 후, 래트를 단독 버퍼해도 바이러스없이 주입하고, 일시적인 체중 감량과 간 효소의 약간의 일시적인 상승이 발생할 것으로 예상 될 수있다.
우리는 이전에 보여준 그 콜리 틱 수 포성 구내염 바이러스 (VSV) 또는 동 소성, 다 초점 HCC 모델 8,9 효율적인 종양 전달과 종양 특이 바이러스 복제, 뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV) 결과의 트랜스 간 동맥 관리. 두 바이러스는 종양 동역학 다르지만주변 간 바이러스의 증거는 없었다 동안 바이러스 복제의 LacZ를 리포터 유전자 양성 효소 염색에 의해 입증되는 바와 같이 최대 바이러스 복제, 바이러스 전파의 여러 병소의 각 시간 점에서 독점적 HCC 결절에서 관찰 될 수있다 복제 (이전 데이터 8,9를 발표 그림 3, 4). 또한, 무작위로 선택된 VSV 처리 된 종양 결절의 형태 학적 분석은 종양의 형질 도입 효율이 종양 크기 (도 3)과 연관되지 않는 것을 보였다.
또한, 간동맥을 통해 치료제를 전달하는 능력은 TACE 대안으로서 색전 요법 제와 결합 할 수있는 가능성을 제공한다. 우리는 증명하고, 그 1에서 콜리 틱 VSV를 혼합하여 : 분해성 전분 마이크로 스피어 (DSM) 색전술 에이전트와 1 비율 및 서스펜션 THR을 주입간장 동맥 깨닫지 못하고 있거나 남의 우리는 베어링 다 초점 HCC 11 결절 쥐의 거대한 종양 괴사 매우 중요한 생존 연장을 달성 할 수있다. 정상 간 조직의 관류에 최소한의 영향을하면서 가돌리늄 대비를 사용하여 동적 조영 증강 자기 공명 영상 (DCE-MRI)에 의해 입증으로 DSM의 횡단 간 동맥 투여, 종양 결절의 거의 완전한 색전술 결과 제 (도 5는 이전의 데이터를 11 일 공개).
도 1은 간동맥 주입 절차의 도식 표현. 간세포 용기 (간동맥 적절한 간동맥 및 십이지장 동맥) 해부 현미경의 도움으로 절개되어있다. 십이지장 동맥의 결찰 및 공통 간 동맥의 시간 블록 한 후,PBS 또는 VSV 벡터 1 ㎖ 적절한 간동맥을 통해 십이지장 동맥을 통해 투여된다. 주입 후, 십이지장 동맥의 근위 사이트 출혈을 방지하기 위해 결찰 공통 간동맥 블록이 해제되고, 간 혈류를 다시 시작하는 것 확인된다. 이 그림은 이전 9 출판되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 간장 동맥 주입 절차의 사진은 2. laparotomized 쥐 복벽 권취 거즈 면봉 (A)의 배치를 보여준다. 간장 로브, 일반 간장 동맥 (지정 CHA) 및 위 십이지장 동맥 (지정 GA) 확인하고 창피를 해제 한 후sected (B). 십이지장 동맥의 선단부를 결찰 한 후, 간동맥을 일시적으로 (C)에 고정된다. 위 십이지장 동맥 이제 주입을위한 준비가되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다 초점 HCC 베어링 쥐 그림 3. 형질 도입 및 간 동맥 투여 후 VSV의 종양 선택적 복제. 동물의 세트 (N = 3 / 시점) 1 일 후 바이러스에서 30 분 및 (B)에서 (A) 희생 주입, 냉동 간 부분은 β-여자의 발현을 염색 하였다. 대표 섹션은 낮은 (왼쪽)과 높은 배율 (오른쪽)에 표시됩니다. 화살표는 종양 병변 및 HEPA 사이의 경계를 표시틱 실질. 종양의 크기 및 형질 도입 효율 간의 (C)의 관계. HCC 함유 간 부분은 전체 종양 및 X-gal을 양성 영역을 정량화하는 형태 학적 분석에 의해 분석 하였다. 이 그림은 이전 9 출판되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. NDV / F3aa (L289A) 간세포 암종에서 종양 특이 바이러스 복제의 치료 결과 (HCC) -bearing 쥐. 다 초점 소성을 HCC 결절 베어링 남성 버팔로 쥐 rNDV / F3aa (L289A) (50 10 8 TCID)로 처리 하였다 간동맥 주입하여, 상기 지정된 시간에 사망은 후 처리 포인트 (N = 3). 종양 함유 간 절 하였다β-갤런하는 염색. 대표 섹션은 5 배 (개요)와 20 배 (종양과 간 부분의 확대) 확대에 표시됩니다. 바이러스 역가 간 종양 해물의 TCID 50 분석에 의해 정량화하고, SD ± 평균으로 표현된다. NDV, 뉴캐슬 질병 바이러스; TCID 50, 50 % 조직 배양 감염 용량. 이 그림은 원래의 형태 8에서 수정되었습니다 유의하십시오. 이 그림은 이전에 8 게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
nonembolized 또는 DSM과 간 동맥 색전술 후 30 분 중 색전 HCC. MCA-RH7777 종양 - 베어링 쥐, 그림 5. 동적 조영 증강 자기 공명 영상은 DCE-MRI와 몇 군데 있었다. (<강한> A) 축 T1-무게 precontrast (A, C) 및 조영 증강은 (B, D) 이미지는 색전 종양 결절 (d)에 대비 부족을 보여줍니다. (B) 데이터는 정량적 암종 및 인접 정상 간 조직의 관심의 동일한 크기의 영역에서 계조 신호 세기를 측정하여 분석 하였다. 하나의 대표 데이터 세트가 도시된다. 이 그림은 이전에 11 게시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary clippers | Aesculap | GT415 | Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| 30 G Needles | Braun | 4656300 | 30 G x ½” |
| 1 ml syringes | Braun | 9161406V | Tuberculin syringe |
| Disposable scalpel | Feather | 2975#15 | #15 blade |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | Sharp/blunt, for opening skin and muscle |
| Adson forcep | Fine Science Tools | 1101-12 | With teeth, for grasping skin and muscle |
| Alm retractor | Fine Science Tools | 17008-07 | With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery |
| Gauze swabs | Lohmann & Rauscher | 18504 | 7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use |
| Cotton-tipped applicator swabs | Lohmann & Rauscher | 11970 | Sterile |
| Fine-tipped foreceps | Fine Science Tools | 11063-07 | 0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For delicate cutting |
| Micro-needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | For ligating gastroduodenal artery |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12005-15 | Tungsten carbide jaws |
| 7-0 Prolene sutures | Ethicon | 8648H | Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | V3040H | With curved needle attached |
| Infrared warming lamp | Beurer | IL11 | For maintaining body temperature post-operatively |
References
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- Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Bruix, J., Sala, M., Llovet, J. M. Chemoembolization for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 127, 179-188 (2004).
- Miraglia, R., Pietrosi, G., Maruzzelli, L., Petridis, I., Caruso, S., Marrone, G., Mamone, G., Vizzini, G., Luca, A., Gridelli, B. Efficacy of transcatheter embolization/chemoembolization (TAE/TACE) for the treatment of single hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 13, 2952-2955 (2007).
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