Transarterial Administrasjon av Onkolytiske virus for Lokal regional terapi av ortotopiske HCC i rotter

Introduction

Leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreftsykdommen i verden, og den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødsfall, noe som gjør det til et betydelig helseproblem ^1,2. For pasienter som ikke er kvalifisert for tumor reseksjon, eller de venter på levertransplantasjon, lokoregionalt terapi involverer transarterial embolisering (TAE) eller transarterial chemoembolization (TACE) brukes som standard palliativ omsorg ^3,4. Disse behandlingene utnytte unike med dobbel blodtilførsel i leveren hvor svulster er lei nesten utelukkende ved lever arteriell blodstrøm, mens rundt leveren mottar mesteparten av sin blodforsyning fra portvenen ^5,6.

På grunn av de ekstremt begrensede efficacies av etablerte behandlingsformer for HCC har onkolytiske virus dukket opp som lovende alternative behandlingsformer. JX-594, nylig omdøpt Pexa-Vec, er en tymidinkinase-slettet vaccinia vektor, bevæpnet med granulocytt-mMakrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), som har gjennomført klinisk fase II-studie for HCC ^7. Mer nylig har en rekombinant vesikulær stomatitt virus vektor (VSV) uttrykker humant interferon beta inne i en fase jeg klinisk studie for sorafenib-ildfast HCC (NCT01628640). Som onkolytiske virus gå nærmere få godkjent for klinisk anvendelse for HCC pasienter, behovet for en effektiv administreringsrute målrette multifokal sykdom er tydelig. Mens systemisk tilførsel er stort sett ineffektive på grunn av ineffektiv svulst transduksjon, kan intratumorale anvendelser begrenser effektiviteten av terapien til den injiserte tumor, slik uninjectable mikroskopiske lesjoner som er mottakelige for sykdomsprogresjon.

Vi har etablert en fremgangsmåte for å isolere de leverarterien hos rotter for å administrere onkolytisk virusbehandling i en lokoregional måte å målrette ortotopisk HCC. Vi har vist at denne tilførselsvei resulterer i trygge og effective transduksjon av multifokale HCC knuter, noe som resulterer i betydelig overlevelse forlengelse i immun kompetente rotter ^8-10. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å få tilgang til, dissekere, og injisering i den hepatiske arterien hos rotter. En ordning av fremgangsmåten er vist i figur 1 (tidligere utgitt ⁹⁾

Protocol

Merk: Følgende trinn er utført i samsvar med retningslinjene i vår institusjon og de lokale myndighetene i Bayern, Tyskland. Alle forsøk på å reprodusere denne protokollen må gjøres i tilslutning med lokale retningslinjer for human behandling av dyr, som diktert av lokale dyr omsorg og bruk komité. For eksempel, mange institutter krever at sterile hansker er slitt under gnager kirurgi. Videre arbeid med virus må utføres i henhold til lokale forskrifter, ta vare for personlig og miljøsikkerhet. Hensyn må tas for å avhende forurenset avfall og å rengjøre instrumenter og arbeidsområde (dvs. ved autoklave og rengjøring med et passende antiviral desinfeksjonsmiddel i henhold til produsentens instruksjoner).

1. Forberedelser før du begynner Surgery

1. Sterilisere kirurgiske instrumenter (dvs. ved autoklave).
2. Spe viruset til approprIate konsentrasjon, som vil variere avhengig av giftigheten av det bestemte virus som brukes og følsomhet av rotte-stammen.
   Merk: For eksempel, når du bruker vesikulær stomatitt virus hos hann Buffalo rotter, vi vanligvis injiserer 10 ⁷ pfu i en 1 ml volum, som er den høyeste tolererte dose i denne modellen.
   1. Forhåndsutfyll viruset (ved bruk av aseptisk teknikk) i 1 ml sprøyter, og legger 30 G kanyler, ta vare å fjerne luft fra sprøyten og nålen.
3. Klargjør den kirurgiske plass med alle materialer og utstyr som kreves, og spray området med etanol for å desinfisere. Fyll en liten beholder med sterilt saltvann (0,9% NaCl) for å fukte gasbind vattpinner og bomull-tipped applikatorer.

2. Utarbeidelse av Rat

1. Administrere en smertestillende (som angitt av lokale dyr omsorg og bruk komité), på riktig dose 30 min før start av kirurgiske prosedyren. For eksempel,administrere en høy dose av metamizol (100-200 mg / kg).
2. Bedøve rotte ved hjelp av inhalering (isofluran) eller injeksjon (dvs. en blanding av medetomidin (0,15 mg / kg), midazolam (2 mg / kg), og Fentanyl (0,005 mg / kg), også kjent som MMF) anestesi. Administrere isolflurane gjennom en fordamper på 1-3% og justere etter behov for å opprettholde normal pust og puls.
   1. Før du fortsetter, må du kontrollere at rotta er fullt bedøvet og ute av stand til å føle smerte ved å knipe foten pad og observere for en reaksjon.
   2. Påfør en veterinær øyesalve for å hindre tørrhet under anestesi.
3. Barbere mageområdet fra sternum ned til like over kjønnsorganene ved hjelp av en liten veterinær hårklipper. Vær nøye med å oppnå en tett barbering uten å skade huden.
4. Fest rotte til det kirurgiske sengen ved hjelp av tape på for- og bakbena, og hvis du bruker inhalasjonsanastesi, plassere snuten inn i en passende størrelse nesen membran. Plasser en varmeputeunder rotte for å opprettholde kroppstemperaturen. Desinfiser mageområdet ved hjelp av et kirurgisk klasse desinfiserende, etterfulgt av en alkohol skylling og anvendelse av en antiseptisk maling.

3. Laparotomi

1. Ved hjelp av en liten buet skalpell, for eksempel # 15, foreta en liten loddrett snitt i huden lag direkte langs midtlinjen. Utvid snittet opp til xyphoid prosessen. Deretter innsnittet muskelen laget ved forsiktig å løfte opp med et par Adson tang for å lage en skalpell innsnitt, og deretter forlenger snittet opp til xyphoid prosessen med kirurgiske sakser. Pass på å ikke punktere organene i bukhulen eller å skade små fartøy på hver side av xyphoid prosessen.
2. Plasser en retractor over magen for å spre muskel og hud og utsette hele mageområdet.
3. Fukt to 7,5 x 7,5 cm ² gasbind vattpinner med sterilt fysiologisk saltvann og spre en over toppen av den kirurgiskeåpning og en over bunnen, slik som vist i figur 2A.

4. Isolering av leverpulsåren

1. Ved hjelp av to fuktet bomulls applikator spinner fuktet med sterilt fysiologisk saltvann, løfter forsiktig tarmen og cecum ut av bukhulen, og plassere dem på nedre gasbind pinne. Brett gasbind for å holde organene fuktig og å holde dem ute av veien.
2. Ved hjelp av to fuktet bomulls applikatoren vattpinner, forsiktig løft opp venstre lateral leveren lobe, som vil være den mest dominerende lapp med tanke på dette stadiet. Snu lobe oppover, og ved hjelp av en liten par fjær saks, skjære gjennom den fibrøse hinnen på undersiden av fliken, slik at lobe for å være fullstendig snudd oppover og hviler på toppen av den tidligere plassert gasbind vattpinne. Brett gasbind pinnen over lapp for å holde den på plass.
3. Fortsett med neste lapp (fremre caudatus), som nå er den mest fremre lapp i sikte. med the hjelp av en dissekere mikroskop og fin pinsett, dissekere den tynne membranen som omgir lapp for å slippe den og la den bli fritt snudd oppover. Plasser lapp under gasbind pinnen sammen med den venstre lateral lapp.
4. Observer bakre caudatus lapp, som nå vil være synlig. Gjenta trinn 4,3 til helt dissekere bakre caudatus lapp og snu den opp og inn i gasbind sammen med de tidligere plassert leveren fliker.
5. Bare under den opprinnelige plasseringen av caudatus lapp, finne felles leverpulsåren, som nå skal være synlig og lett gjenkjent av sin sterke pulsering. Etter arterien til den anatomiske høyre, observere tykk membran materialet skjuler gastroduodenalsår og riktig lever arterier fra visningen. Bruke fin pinsett, løft opp dette materialet og forsiktig rive det, ta vare å unngå eventuelle små fartøy i dette området. Bruk bomull applikator vattpinner til å stoppe blødninger som kan oppstå.
   1. Finn enrterial grener, som vil være godt synlig ved hjelp av en dissekere mikroskop når membranene er skikkelig dissekert.
6. Ved hjelp av to fine, atraumatiske tang, nøye dissekere den felles leverpulsåren, gastroduodenal arterie, og den riktige leverarterien slik at de er frigjort fra de omkringliggende membraner (figur 2B).

5. Forberedelse av arterien til injeksjonsvæske

1. Passere en 7-0 prolene sutur under gastroduodenale arterie, og bruke en micro-nål-innehaveren å binde en permanent ligatur på distal ende, like over delinger (se Figur 1 for riktig plassering). Tillat ca 2 inches av suturmateriale blir tilbake på endene, og klemme dem sammen med en nål for å trekke holder arterien vises, som i figur 2C.
2. Plasser en liten klemme på den felles leverpulsåren å midlertidig blokkere blodstrømmen (figur 2C).
   Merk: Dette er important for å forhindre massiv blødninger når nålen er fjernet fra arterien. Videre vil blokkering av arterielle blodstrøm tillate tregere virus administrasjon og bedre transduksjon effektivitet.
   1. Viktig: Arbeid raskt for å begrense mengden av tid som blodstrømmen stoppes - utfør injeksjon og påfølgende ligering av arterien i 5 minutter for å klemme den felles leverpulsåren.
3. Hvis det er mulig, øke forstørrelsen på dissekere mikroskop, slik at gastroduodenale arterie er i skarp fokus og ser stor nok til å nøyaktig sette inn 30 G nål. Plassere nålen på injeksjonssprøyte inn i lumen av gastroduodenal arterien og langsomt trykk på stempelet.
   Merk: Riktig plassering av nålen vil resultere i den injiserte oppløsning som strømmer direkte gjennom riktig leverarterien og inn i leveren.
   1. Utfør injeksjons veldig sakte for å maksimere transduksjon effektivitet.
<li> Når hele injeksjonsvolumet har blitt administrert langsomt trekke nålen fra arterien.
Merk: Det bør ikke være noen blødning fra injeksjonsstedet. I det tilfellet at blødningen forekommer, indikerer det at klemmen ikke er riktig plassert, og skal raskt justeres.

6. Avslutnings

1. Passere en annen 7-0 prolene sutur under gastroduodenale arterie, og knyt en andre permanent ligatur over injeksjonsstedet.
2. Fjerne klemmen fra den felles leverpulsåren. Bekreft at blodstrømmen gjennom riktig leverpulsåren til leveren er gjenopprettet.
   1. Skjær de løse endene av ligaturer.
3. Bekrefte at det ikke er noen blødning før retur tarmen og leveren til bukhulen. Pass på at tillegget er returnert i sin opprinnelige orientering.
4. Sy muskel og hud i separate lag som bruker 4-0 Vicryl sutur materiale med en buet nål. Place continuous sting ca 1 mm fra hverandre, og trekk.
   1. Under suturering fasen administrere et analgetikum slik som buprenorfin (0,05 mg / kg).
5. Fjern rotte fra anestesi. Hvis isofluran har blitt brukt, bør rotte gjenvinne bevissthet i løpet av noen minutter. Hvis MMF har vært brukt som et injiserbart anestesi, antagoniserer den med en subkutan injeksjon av Atipamezol (0,75 mg / kg), flumazenil (0,2 mg / kg), og Nalokson (9,12 mg / kg), noe som vil reversere effekten av anestesi og la dyrene til å gjenvinne bevissthet innen 20 min. Hold rotter varme med en infrarød oppvarming lampe under den første oppvåkning fasen.
   1. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
   2. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi i selskap med andre dyr før fullt restituert.
6. Overvåk rotter postoperativt for patologiske tegn på stress, og følgeopp med smertestillende som kreves av lokale dyr omsorg og bruk komité. For eksempel kan buprenorfin administreres ved 0,05 mg / kg hver 12. time.

Representative Results

Med erfaring, kan en nesten 100% suksessrate (som betyr at arterien ble vellykket dissekert og injisert, og dyret overlevde operasjonen) oppnås. Imidlertid vil helsetilstanden rotte før kirurgi (grad av tumorbyrden, underliggende leverfunksjon, etc.) åpenbart spille en rolle i utfallet av kirurgiske inngrep. Etter kirurgi, kan rotter forventes å oppleve forbigående vekttap og en svak, forbigående økning av leverenzymer, selv om buffer alene, uten virus, ble injisert.

Vi har tidligere demonstrert at trans-hepatisk arteriell administrering av onkolytiske vesikulær stomatitt-virus (VSV) eller Newcastle sykdomsvirus (NDV) resulterer i effektiv tumor transduksjon og tumor-spesifikke virusreplikasjon, i en ortotopisk, multifokal HCC modell ^8,9. Selv om de to virusene varierer i sine intratumorale kinetikkav virusreplikasjon, ved de respektive tidspunktene av maksimal virusreplikasjon, mange foci av virus forplantning, som dokumentert av positive enzymatisk farging for LacZ reporter genet, kunne observeres utelukkende innenfor HCC knuter, mens de omkringliggende lever viste ingen tegn på virus replikasjon (figur 3 og 4, som tidligere publiserte data ^8,9). I tillegg morfometrisk analyse av tilfeldig utvalgte VSV-behandlede tumornoduler viste at svulsten transduksjon effektivitet ikke korrelerer med tumorstørrelse (figur 3).

Videre er evnen til å levere terapeutiske midler via leverarterien tilbyr også muligheten for å kombinere terapi med en embolisering middel som et alternativ til TACE. Vi har vist at, ved å blande onkolytisk VSV ved et 1: 1 forhold med en nedbrytbar stivelse mikrosfære (DSM) embolisering midlet og tilføre suspensjonen through leverpulsåren, kan vi oppnå massive tumor nekrose og meget betydelig overlevelse forlengelse hos rotter bærende multifokal HCC knuter ^11. Trans-lever arteriell administrasjon av DSM resulterte i en nesten komplett embolisering av tumorknuter, og samtidig ha en minimal effekt på perfusjon av normale levervev, som demonstrert ved dynamisk kontrastforsterket magnetisk resonanstomografi (DCE-MRI) med en gadolinium kontrast middel (Figur 5, tidligere publiserte data ^11).

Figur 1. Skjematisk fremstilling av hepatisk arteriell infusjon prosedyre. Den hepatiske fartøy (vanlig leverarterien, riktig leverarterien, og gastroduodenal arterie) dissekeres ved hjelp av et disseksjonsmikroskop. Etter ligering av gastroduodenal arterien og tidsmessig blokk av den felles leverarterien,1 ml PBS eller VSV vektor administreres via gastroduodenal arterien gjennom riktig leverarterien. Etter injeksjon, er den proksimale området av gastroduodenal arterien ligeres for å forhindre blødning, blir blokken med den felles leverarterien frigjort, og den recommencement av hepatisk blodstrøm er bekreftet. Dette tallet har vært tidligere utgitt ^ni. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2. Fotografier av lever arteriell infusjon prosedyre. En laparotomisert rotte viser plassering av bukveggen retractor og gasbind vattpinner (A). Etter løfte ut lever lapper, felles leverpulsåren (betegnet CHA) og gastroduodenale arterie (betegnet GA) er identifisert og dissected (B). Etter ligering av den distale ende av gastroduodenal arterien, er det vanlig rarterien midlertidig fastklemt (C). Den gastroduodenale arterie er nå klar til injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Transduksjon og tumor-selektive replikering av VSV etter leverarterien administrering i rotter som bærer multifokal HCC. Sett av dyrene (n = 3 / tidspunkt) ble avlivet (A) i 30 min, og (B) på dag 1 post-virus infusjon, og frossen lever snitt ble farget for β-gal ekspresjon. Representative seksjoner er vist ved lave (til venstre) og høyere forstørrelser (til høyre). Pilene viser grensene mellom tumorlesjoner og HEPAtic parenchyma. (C) Forholdet mellom tumorstørrelse og transduksjon effektivitet. HCC-holdige leversnitt ble analysert ved morfometrisk analyse for å kvantifisere total tumor og X-gal-positive områder. Dette tallet har vært tidligere utgitt ^ni. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4. NDV / F3aa (L289A) behandling resulterer i tumor-spesifikke virusreplikasjon i leverkreft (HCC) -holdige rotter. Mann Buffalo rotter bærer multifokale ortotopiske HCC knuter ble behandlet med rNDV / F3aa (L289A) (10 ⁸ TCID ₅₀₎ ved lever arteriell infusjon, og drept på angitte tidspunkter etter behandling (n = 3). Tumor-holdige leversnitt ble utsattp-gal-farging. Representative seksjoner er vist på 5X (oversikt) og 20X (forstørrelse av tumor og leversnitt) forstørrelse. Virale titere ble kvantifisert ved TCID ₅₀ analyse av lever og tumor lysat, og er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. NDV, Newcastle disease virus; TCID _50, 50% vevkultur-infeksiøse doser. Merk, dette tallet har blitt forandret fra sin opprinnelige form ^8. Dette tallet har vært tidligere utgitt ^åtte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5. Dynamisk kontrastforsterket magnetisk resonanstomografi av emboliseres HCC. MCA-RH7777 tumorbærende rotter, enten nonembolized eller 30 min etter lever arteriell embolisering med DSM, ble fotografert med DCE-MRI. (<strong> A) Aksial T1-veid precontrast (a, c) og postcontrast (b, d) bilder viser mangel på kontrast i embolisert tumorknuter (d). (B) Data ble analysert kvantitativt ved å måle grå-skala signalintensitet i like store områder av interesse for tumornoduler og tilstøtende normalt levervev. En representant datasett vises. Dette tallet har vært tidligere utgitt ^11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veterinary clippers	Aesculap	GT415	Small, cordless trimmer ideal for removing fur from surgical area
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
30 G Needles	Braun	4656300	30 G x ½”
1 ml syringes	Braun	9161406V	Tuberculin syringe
Disposable scalpel	Feather	2975#15	#15 blade
Standard surgical scissors	Fine Science Tools	14001-13	Sharp/blunt, for opening skin and muscle
Adson forcep	Fine Science Tools	1101-12	With teeth, for grasping skin and muscle
Alm retractor	Fine Science Tools	17008-07	With blunt teeth, for spreading abdominal cavity open during surgery
Gauze swabs	Lohmann & Rauscher	18504	7.5 cm x 7.5 cm, should be autoclaved prior to use
Cotton-tipped applicator swabs	Lohmann & Rauscher	11970	Sterile
Fine-tipped foreceps	Fine Science Tools	11063-07	0.4 mm, angled tip, for dissecting hepatic artery
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09	For delicate cutting
Micro-needle holder	Fine Science Tools	12076-12	For ligating gastroduodenal artery
Needle holder	Fine Science Tools	12005-15	Tungsten carbide jaws
7-0 Prolene sutures	Ethicon	8648H	Polypropylene suture with curved needle, for ligating gastroduodenal artery
4-0 Vicryl sutures	Ethicon	V3040H	With curved needle attached
Infrared warming lamp	Beurer	IL11	For maintaining body temperature post-operatively