מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
למרות חילופי גנטי בין שני תאים הוא האירוע המרכזי ברבייה מינית, היא מסתמכת על שרשרת האירועים מקדמים התמיינות תאים, לאפשר בחירה שותף, לבצע איחוי תאי תאים ולשמור על יציבות גנומית. כך מחזור החיים המיניים מציגים את עצמו כמערכת מודל ללמוד מספר השאלות ביולוגיות לגבי מתגים התפתחותי, בתגובה לגירויים חיצוניים, היתוך קרום פלזמה, פרדה כרומוזום, וכו 'היכרות עם שמרי ביקוע מחזור מיני ללמוד תופעות אלה מביאה את היתרונות של גנטיקת העצמה של מודל המערכת, ומבוסס גישות תפוקה גבוהה במיקרוסקופ משוכלל. סקס בשמרי ביקוע הוא אירוע heterotypic בין תא-P ו- M-תא של סוגי הזדווגות ברורים. שני סוגי התאים דיפרנציאלי להביע מספר הגנים 1,2 כולל אלה לייצור של P-המופרש ו- M-פרומונים, פרומון קולטנים Map3 ו Mam2 וכן פרומון פרוטיאהses Sxa1 ו Sxa2. זנים Homothallic, כגון זן h90 נפוץ, לשאת את המידע הגנטי לשני סוגי ההזדווגות בגנום יחיד התאים עוברים דפוס מורכב של מיתוג סוג ההזדווגות לאורך כל מחזור החיים mitotic (הנסקרת נ"צ. 3). מבודד מרובה של ביקוע שמרי heterothallic כי לעתים רחוקות או אף פעם לא יחליף את סוג ההזדווגות משמש גם 4 נפוץ, ובעיקר את h + N (P-type) ו- h -S (M-סוג) זנים.
בשמרי ביקוע, כניסת מחזור החיים המיניים נמצאת תחת רגולציה קפדנית תזונתית. רק בתאי שמרי ביקוע מורעבי חנקן לעצור רביית mitotic ולייצר פרומונים diffusible לאותת נוכחות של שותף הזדווגות ולקדם צעדים נוספים של המחזור המיני (הנסקרת נ"צ. 5). מניעת חנקן דה-מדחיק את הרגולטור תעתיק המפתח של Ste11 ההזדווגות שפועל כמתג התפתחותי ומקדם דוארxpression הזדווגות גנים ספציפיים כולל קולטן פרומון ואת הגנים ייצור פרומון 6,7. אירוסי פרומון קולטן מפעילים את החלבון בשילוב קולטן G-אלפא ואיתות MAPK במורד זרם אשר משפר עוד יותר פעילות תעתיק Ste11 8-10, ובכך להגדיל ייצור פרומון בתוך משוב חיובי בין בני זוג הזדווגות. רמות פרומון הם קריטיים כדי לגרום מצבי קיטוב תאים שונים על ידי ויסות מארגן אדון קוטביות התא, Cdc42 GTPase Rho-משפחה 11. בחשיפה לריכוזים נמוכים פרומון, פעיל Cdc42 היא דמיינה בטלאים דינמיים לחקור את פריפרית התא, ולא צמיחת תאים הוא ציינה בשלב זה. רמות פרומון מוגברים לקדם את התייצבות פעילות Cdc42 לאזור וצמיחה יחיד של הקרנה מקוטבת, כינה את shmoo, מה שמביא תאים שותף בקשר. בהמשך לכך, שני שותפי הזדווגות הפלואידים פתיל כדי ליצור זיגוטה דיפלואידי. מחקר שנערך לאחרונה מגלה הקיומו דואר של מבנה יקטין רומן חיוני היתוך שמורכב על ידי formin מושרה ההזדווגות Fus1 12. מוקד היתוך זה מתרכז תהליכים התלויים שרירן הסוג-V ו- ממקם את המכונות שפלות דופן תא, ובכך מאפשר שיפוץ של דופן התא כדי לאפשר מגע קרום פלזמה ללא תא תמוגה 12. לאחר איחוי תאים תאים, הגרעינים באים במגע ועוברים karyogamy. תנועה בולטת-dynein תלויים גב ו-ושוב של גרעין בתוך הזיגוטה (תנועת זנב סוס) אז מקדם ההתאמה של homologs כרומוזום 13,14, אשר מלווה המיוזה. לבסוף, ארבעה מוצרים של המיוזה ארוזים לתוך נבגים בודדים במהלך נביגה.
בגלל המורכבות שלה ואת הצעדים הרבים המעורבים, ניטור של הזדווגות מפורט כבר מאתגר. שני קשיים בולטים הן כי התהליך כולו לוקח הרבה מעל חמישה עשר שעות וכי תאים קשים לסנכרן. אלה דifficulties אפשר להערים על ידי גישות מיקרוסקופיה תא בודד. הנה פרוטוקול החקירה כללי מחזור החיים מינית בשמרי ביקוע מוצגים. עם שינויים קלים, פרוטוקול זה מאפשר הלימוד של כל השלבים השונים של התהליך, כלומר האינדוקציה של תוצר גן הזדווגות, קיטוב תא זיווג בין-תאי ואחות אחרי מיתוג סוג ההזדווגות בין בני זוג לא-אחות, היתוך תאי תאים, ופוסט היתוך סוס זנב התנועה, המיוזה ו נביגה. שיטה זו מאפשרת ל -1) בקלות לדמיין fluorescently מתויג חלבונים לאורך זמן מראש, במהלך פיוז'ן פוסט; 2) להפלות את התנהגותם של תאים מסוג ההזדווגות מול; ו -3) למדוד ולכמת פרמטרים כגון shmooing, הזדווגות, איחוי או יעיל נביגה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תנאים סביבתיים, וזמינות מזינה בפרט, מאוד משפיעים על הפיסיולוגיה שמרים ביקוע. רעב חנקן הכרחי מחויב הרבייה המינית בתחילה מובילה לשינויים בולטים את התקדמות מחזור תא mitotic (Ref. 21 ואיור 2). לאחר הסרת חנקן מן האוכלוסייה גדלה באופן אקספוננציאלי, גודל תא בחטיבה י?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AV נתמכה על ידי עמיתי הבתר EMBO לטווח ארוך. מחקר במעבדת מרטין ממומן על ידי מענק מוצא ERC (GeometryCellCycle) ומענק קרן הלאומי למדע שוויצרי (31003A_155944) כדי SGM.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
