Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
Aunque el intercambio genético entre dos células es el evento central en la reproducción sexual, que se basa en una cadena de eventos que promueven la diferenciación celular, permiten la elección de pareja, llevan a cabo la fusión célula-célula y mantener la estabilidad genómica. Así, el ciclo de vida sexual se presenta como un sistema modelo para estudiar una serie de cuestiones biológicas en conmutación de desarrollo, respuesta a estímulos extrínsecos, la fusión de la membrana plasmática, la segregación de cromosomas, etc. Exploración de la levadura de fisión ciclo sexual para estudiar estos fenómenos aporta los beneficios de la poderosos genética del modelo de sistema, bien establecidos enfoques de alto rendimiento y microscopía sofisticado. Sexo en la levadura de fisión es un evento heterotípicos entre una célula P y una de las células M de los tipos de apareamiento diferentes. Los dos tipos de células expresan diferencialmente una serie de genes, incluidos los 1,2 para la producción del P- secretada y M-feromonas, receptores de feromonas y map3 MAM2 así como feromonas proteases Sxa1 y Sxa2. Cepas homotálicos, tales como la cepa H90 de uso común, llevan la información genética para los dos tipos de apareamiento en un único genoma y las células se someten a un complejo patrón de conmutación de tipo de apareamiento en todo el ciclo de vida mitótico (revisado en Ref. 3). Varias cepas de levadura de fisión heterotálico que cambian rara vez o nunca tipo de apareamiento también se utilizan comúnmente 4, lo más prominente de H + N (tipo P) y h -S (M-tipo) de las cepas.
En la levadura de fisión, la entrada en el ciclo de vida sexual es bajo una estricta regulación nutricional. Sólo las células de levadura de fisión nitrógeno hambre detienen la reproducción mitótico y producen feromonas difusibles para indicar la presencia de una pareja sexual y promover nuevas medidas del ciclo sexual (revisado en Ref. 5). privación de nitrógeno de-reprime el regulador transcripcional clave de Ste11 de acoplamiento que actúa como un interruptor de desarrollo y promueve eXpression de apareamiento genes específicos que incluyen el receptor de feromonas y la feromona genes de producción de 6,7. El compromiso de feromonas-receptor activa la proteína del receptor acoplado a G-alfa y la señalización de MAPK aguas abajo que mejora aún más la actividad de transcripción Ste11 8-10, lo que aumenta la producción de feromonas en una retroalimentación positiva entre compañeros de apareamiento. Los niveles de feromonas son cruciales para inducir diferentes estados de polarización de células, regulando el organizador principal de la polaridad celular, la Rho GTPasa Cdc42 familiar 11. Tras la exposición a bajas concentraciones de feromonas, activa Cdc42 se visualiza en parches dinámicos que exploran la periferia de la célula, y no el crecimiento celular se observa en esta etapa. Aumento de los niveles de feromonas promueven la estabilización de la actividad Cdc42 a una sola zona y el crecimiento de una proyección polarizada, denominado el shmoo, que trae las células asociadas en contacto. Posteriormente, los dos socios de apareamiento haploides se fusionan para formar un cigoto diploide. Un trabajo reciente revela THe existencia de una estructura de actina novela esencial para la fusión que se monta por el formin apareamiento inducida FUS1 12. Este enfoque de fusión concentra procesos dependientes de tipo V de miosina y posiciona la maquinaria de degradación de la pared celular, lo que permite la remodelación de la pared celular para permitir el contacto de la membrana plasmática sin lisis celular 12. Tras la fusión célula-célula, los núcleos entran en contacto y se someten a la cariogamia. Un prominente movimiento hacia atrás y hacia adelante dineína dependiente del núcleo dentro del cigoto (el movimiento de la cola de caballo), entonces promueve el emparejamiento de cromosomas homólogos 13,14, que es seguido por meiosis. Por último, los cuatro productos de la meiosis se empaquetan en esporas individuales durante la esporulación.
Debido a su complejidad y los numerosos pasos a seguir, un seguimiento detallado de acoplamiento ha sido un reto. Dos dificultades notables son que todo el proceso se lleva bien más de quince horas y que las células son difíciles de sincronizar. estos droblemas son eludidas por los enfoques de microscopía de una sola célula. Aquí un protocolo general para investigar se presenta el ciclo de vida sexual en la levadura de fisión. Con ajustes menores, este protocolo permite el estudio de todos los diferentes pasos del proceso, a saber, la inducción de producto génico de apareamiento, la polarización celular y el apareamiento entre hermanos células tras el cambio al tipo de apareamiento y entre los socios no hermanas, la fusión célula-célula, y después de la fusión de la cola de caballo movimiento, la meiosis y esporulación. Este método permite a 1) visualizar fácilmente las proteínas etiquetadas con fluorescencia con el tiempo antes, durante y después de la fusión; 2) discriminar el comportamiento de las células de tipo de apareamiento opuesto; y 3) la medida y cuantificación de parámetros tales como shmooing, el apareamiento, la fusión o la eficiencia esporulación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las condiciones ambientales, y la disponibilidad de nutrientes, en particular, afectan en gran medida la fisiología de la levadura de fisión. Hambre de nitrógeno es necesaria para el compromiso de la reproducción sexual e inicialmente da lugar a notables cambios en la progresión del ciclo celular mitótico (Ref. 21 y Figura 2). Tras la eliminación de nitrógeno de crecimiento exponencial de la población, el tamaño de celda en la división disminuye rápidamente (Figura 2C)</st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AV fue apoyado por una beca postdoctoral largo plazo EMBO. La investigación en el laboratorio de Martin está financiado por una subvención de inicio del CEI (GeometryCellCycle) y una subvención Swiss National Science Foundation (31003A_155944) para SGM.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
