Микроскопия делящихся дрожжей Жизненный цикл сексуальной
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
Хотя обмен генетическим материалом между двумя ячейками является центральным событием в половом размножении, он опирается на цепи событий, которые способствуют дифференциации клеток, позволяют по выбору партнера, осуществляют слияние клеток клеток и поддержания стабильности генома. Таким образом, половой жизненный цикл представляет себя в качестве модельной системы для изучения ряда биологических вопросов , связанных с развитием коммутаторов, реакция на внешние раздражители, плазма слияния мембран, сегрегации хромосом и т.д. исследуя делящихся дрожжей полового цикла для изучения этих явлений приносит выгоды от мощные генетика Модель системы, устоявшихся высокой пропускной способности подходов и утонченный микроскопии. Секс в делящихся дрожжей является гетеротипичной событие между Р-клетки и М-клетки различных типов спаривания. Эти два типа клеток дифференцированно выражают ряд генов , в том числе 1,2 для производства секретируемого Р- и М-феромоны, феромонов-рецепторов Map3 и Mam2, а также феромона-протеяSES Sxa1 и Sxa2. Homothallic штаммы, такие как обычно используемые H90 штамма, несут генетическую информацию для обоих типов спаривания в одном геноме , и клетки претерпевают сложную картину переключения типа спаривания на протяжении митотического жизненного цикла (см. Обзор 3). Множественные изоляты гетероталличных делящихся дрожжей , которые редко или никогда не переключать тип спаривания также обычно используются 4, наиболее заметно Н + N (P-типа) и Н (М -S-типа) штаммов.
В делящихся дрожжей, вступление в половой жизненный цикл находится под строгим питательного регулирования. Только азотные голодали дрожжевые клетки деления задержать митотическую воспроизводства и производят диффундирующего феромоны , чтобы сигнализировать наличие брачного партнера и продвигать дальнейшие шаги полового цикла (см. Обзор 5). лишение азота де-репрессирует ключевым регулятором транскрипционный спариванию Ste11, который действует в качестве переключателя развития и способствует еXpression скрещивания специфических генов , включая рецептор феромона и феромона генов производства 6,7. Взаимодействие с феромонами-рецептор активирует рецептор белка связью G-альфа и вниз по течению сигнализации МАРК , который дополнительно усиливает Ste11 транскрипционную активность 8-10, тем самым увеличивая выработку феромонов в положительной обратной связи между брачных партнеров. Уровни Феромонные имеют решающее значение , чтобы побудить различные состояния клеточной поляризации путем регулирования главного организатора клеточной полярности, в Rho-семейства GTPase Cdc42 11. При воздействии низких концентрациях феромонов, активный Cdc42, визуализируется в динамических пластырей, исследующих периферию клетки, а не роста клеток не наблюдается на данном этапе. Повышенные уровни феромона способствовать стабилизации активности Cdc42 в одной зоне и роста поляризованной проекции, называют Shmoo, который приносит партнерам клетки в контакте. Впоследствии два гаплоидных партнеры сопрягаемые сплавить, чтобы сформировать диплоидные зиготы. Последние работы показывает, тысе существование нового структуры актина , необходимой для слияния , который собран с помощью сопрягаемой-индуцированной формина Fus1 12. Этот слитый фокус концентратов типа V миозина зависимые процессы и позиционирует клеточной стенки машины деградации, таким образом , позволяя ремоделирование клеточной стенки , чтобы обеспечить контакт с плазматической мембраной без лизиса клеток 12. После слияния клетка-клетка, ядра вступают в контакт и подвергаются кариогамии. Известный динеин-зависимой возвратно-поступательное движение ядра внутри зиготы (лошадь хвост движения) , а затем способствует спаривание хромосом гомологов 13,14, за которым следует мейоза. И, наконец, четыре продукты мейоза упаковывают в индивидуальные споры во время споруляции.
Из-за своей сложности и многочисленных этапов, детальный мониторинг вязки была сложной. Два заметных трудностей в том, что весь процесс занимает хорошо более пятнадцати часов, и что клетки трудно синхронизировать. Эти difficulties обходят с помощью подходов микроскопии одноклеточных. Здесь общий протокол для исследования половой жизненный цикл у делящихся дрожжей представлен. С незначительными изменениями, этот протокол позволяет исследовать все различные этапы процесса, а именно индукции продукта гена спаривания, поляризации клеток и спаривания между сестринских клеток после переключения типа спаривания и между партнерами, не сестра, слияния клетка-клетка, и пост-фьюжн хвощ движения, мейоза и спорообразование. Этот метод позволяет 1) легко визуализировать флуоресцентно меченных белков с течением времени до, во время и после слияния; 2) различать поведение клеток противоположного типа спаривания; и 3) измерения и количественной оценки таких параметров, как shmooing, вязки, фьюжн или эффективность спорообразования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Условия окружающей среды, а также наличие питательных веществ, в частности, сильно влияют на физиологию делящихся дрожжей. Азотное голодание необходимо для приверженности к половому размножению и первоначально приводит к поразительным изменениям в прогрессии митотического клеточно…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AV была поддержана долгосрочной докторантуру EMBO. Исследования, проведенные в лаборатории Мартина финансируется за счет гранта ERC Starting (GeometryCellCycle) и грант научного фонда Швейцарский национальный (31003A_155944) до СГМ.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
