Mikroskopi av fissionsjäst Sexuell Lifecycle
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
Även genetiskt utbyte mellan två celler är den centrala händelsen i sexuell reproduktion, bygger det på en kedja av händelser som främjar celldifferentiering, tillåter partner val, utföra cellcellfusion och upprätthålla genomisk stabilitet. Således sexuell livscykel presenterar sig som ett modellsystem för att studera ett antal biologiska frågor kring utvecklings växlar, svar på yttre stimuli, plasmamembranfusion, kromosomsegregation, etc. utforska fissionsjäst sexuella cykeln för att studera dessa fenomen ger fördelarna med modellsystem kraftfulla genetik, väletablerade hög genomströmning metoder och avancerad mikroskopi. Sex i fissionsjäst är en hetero händelse mellan en P-cell och en M-cell distinkta parningstyper. De två celltyper differentiellt uttrycka ett antal gener 1,2 inklusive sådana för produktion av den utsöndrade P- och M-feromoner, feromonreceptorer Map3 och Mam2 samt feromon-proteaSES Sxa1 och Sxa2. Homotalliska stammar, såsom den vanligen använda h90-stam, bär den genetiska informationen för båda parningstyper i en enda genomet och cellerna genomgår ett komplext mönster av parningstyp omkoppling genom hela den mitotiska livscykel (översikt i ref. 3). Flera isolat av heterotallism fissionsjäst som sällan eller aldrig byta parning typ används också ofta 4, framförallt H + N (P-typ) och h -S (M-typ) stammar.
I fissionsjäst är inträde i den sexuella livscykel under strikt närings reglering. Endast kväve svalt klyvningsjästceller gripa mitotisk reproduktion och producerar diffunderbara feromoner för att signalera närvaron av en passande partner och främja ytterligare steg i den sexuella cykeln (översikt i ref. 5). Kvävebrist de-undertrycker nyckeltranskriptionsregulator för parning Ste11 som fungerar som en utvecklings switch och främjar eXpression av parning specifika gener inklusive feromonreceptorn och feromonproduktionsgener 6,7. Feromon-receptor engagemang aktiverar receptor kopplat protein G-alfa och nedströms MAPK signaleringen vilket ytterligare förbättrar Ste11 transkriptionsaktivitet 8-10, vilket ökar feromonproduktion i en positiv feedback mellan parningspartner. Feromonnivåer är avgörande för att framkalla olika cellpolariseringstillstånd genom att reglera huvudarrangören av cell polaritet, Rho-familjen GTPas Cdc42 11. Vid exponering för låga feromon koncentrationer är aktiv Cdc42 visualiseras i dynamiska fläckar utforska cell periferi, och ingen celltillväxt observeras i detta skede. Ökade feromonnivåerna främja stabiliseringen av Cdc42 verksamhet till en enda zon och tillväxt av en polariserad projektion, benämnd shmoo, som ger partnerceller i kontakt. Därefter de två haploida passande partners smälter för att bilda en diploid zygot. Senaste arbete visar the förekomsten av en ny aktin struktur nödvändig för fusion som sätts samman genom parning-inducerad formin FUS1 12. Detta fusions fokus koncentrerar typ-V myosin beroende processer och positionerar maskiner och cellväggsnedbrytning, vilket möjliggör ombyggnad av cellväggen för att tillåta plasmamembrankontakt utan cellys 12. Vid cell-cellfusion, kärnorna kommer i kontakt och genomgå karyogamy. En framstående dynein beroende back-och-tillbaka rörelse av kärnan i den zygot (hästsvans rörelse) främjar då hopkopplingen av kromosomhomologer 13,14, vilket följs av meios. Slutligen, de fyra produkter av meios förpackas i enskilda sporer under sporulering.
På grund av sin komplexitet och de många stegen har detaljerad kontroll av parning varit utmanande. Två anmärkningsvärda svårigheter är att hela processen tar väl över femton timmar och att cellerna är svåra att synkronisera. dessa difficulties kringgås av encelliga mikroskopi metoder. Här en allmän protokoll för att undersöka sexuell livscykel i fissionsjäst presenteras. Med smärre justeringar, medger detta protokoll studiet av alla de olika stegen i processen, nämligen induktionen av parnings genprodukten, cell polarisering och parning mellan syster celler efter parning typ växling och mellan icke-syster partners, cell-cellfusion, och efter fusionen hästsvans rörelse, meios och sporulering. Denna metod gör det möjligt att 1) enkelt visualisera fluorescerande taggade proteiner tiden före, under och efter fusionen; 2) diskriminera beteendet hos celler av motsatt parningstyp; och 3) mått och kvantifiera parametrar såsom shmooing, parning, fusion eller sporulering effektivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miljöförhållanden och tillgången på näringsämnen i synnerhet starkt påverka fissionsjäst fysiologi. Kväve svält är nödvändigt för engagemang för sexuell reproduktion och initialt leder till stora förändringar i mitotiska cellcykelprogression (ref. 21 och Figur 2). Vid kväverening från exponentiellt växande befolkning, cellstorlek på division minskar snabbt (figur 2C) och majoriteten av celler gripa mitotiskt progression kortare än längden av nyfödda e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AV-stöddes av en EMBO långsiktig postdoctoral gemenskap. Forskning i Martin lab finansieras genom ett ERC Starting Grant (GeometryCellCycle) och Swiss National Science Foundation (31003A_155944) till SGM.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
References
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
