Abstract
الخلايا الجذعية (DCS) هي المهنية الخلايا المقدمة للمستضد المسؤولة في المقام الأول لاكتساب ومعالجة وعرض المستضدات على مستضد الجزيئات لبدء الحصانة بوساطة الخلايا التائية. الخلايا الجذعية يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات فرعية ظاهريا وغير متجانسة وظيفيا. ثلاث مجموعات فرعية مهمة من الخلايا الجذعية الطحال هي بلازماوية الشكل، وخلايا CD8α نقاط البيع وCD8α NEG. في البلدان النامية بلازماوية الشكل والمنتجين الطبيعي الإنترفيرون من النمط الأول ومهمة لمكافحة الفيروسات مناعة الخلايا التائية. فرعية CD8α NEG العاصمة متخصصة لMHC من الدرجة الثانية تقديم المستضد وشملت مركزي في فتيلة خلايا CD4 T. وCD8α نقاط البيع البلدان النامية هي المسؤولة في المقام الأول عن عبر تقديم المستضدات الخارجية وCD8 T فتيلة الخلية. وقد أظهرت CD8α نقاط البيع البلدان النامية أن تكون أكثر كفاءة في تقديم المستضدات شحمي سكري جزيئات CD1d إلى سل تي المتخصصةالسكان ل المعروفة باسم ثابتة القاتلة الطبيعية خلايا T (iNKT). إدارة FLT-3 يجند يزيد من وتيرة هجرة الأسلاف الخلايا الجذعية من نخاع العظام، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى توسيع الخلايا الجذعية في الأعضاء الليمفاوية الطرفية في نماذج الفئران. تكيفنا هذا النموذج لتنقية أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية وظيفية لاستخدامها في التجارب نقل خلية للمقارنة في الجسم الحي الكفاءة من مجموعات فرعية العاصمة مختلفة.
Introduction
تم اكتشاف الخلايا الجذعية (DC) منذ ما يقرب من أربعين عاما باسم "النجمية الكبيرة (تغصن اليوناني) خلية" وجدت في الأجهزة اللمفاوية 1. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن البلدان النامية هي خلايا مقدمة للمستضد الوحيدة التي يمكن أن تحفز على نحو فعال خلايا T ساذجة 2. والمهمة الرئيسية لهذه الخلايا هي امتصاص وعرض المستضدات والمعالجة بكفاءة وتحميل هذه على تقديم المستضد الجزيئات. في الطحال الماوس، البلدان النامية يمكن فصلها إلى بلازماوية الشكل وفرعية التقليدية. وتتميز البلدان النامية بلازماوية بانخفاض التعبير عن CD11c وومستويات عالية من B220 وGR-1. بل هي أيضا إيجابية للسطح علامة mPDCA1 وتفرز النوع الأول الإنترفيرون ردا على حصيلة مثل مستقبلات 9 (TLR9) بروابط. في البلدان النامية التقليدية مرتفعة عن CD11c ووMHC من الدرجة الثانية التعبير. ويمكن تقسيمها إلى ثلاث مجموعات فرعية مختلفة تعتمد على التعبير عن سطح علامات المظهرية مثل CD4، CD8α، DEC205، CD11B والخلايا الجذعية مستقبلات المثبطة 2 (DCIR2، معترف بها من قبل الأجسام المضادة 33D1) البروتينات 3،4. ومن المعروف أيضا CD8α نقاط البيع البلدان النامية كما cDC1، هي ايجابية لDEC205، ولكن سلبية لعلامات الدم النخاعي مثل CD11b و33D1. وCD8α NEG البلدان النامية، كما دعا cDC2، إيجابية ل33D1، CD11b وCD4 ولكنها تفتقر DEC205. فرعية سلبية مزدوجة (أي سلبية لكلا CD4 وCD8α) هي نادرة نسبيا، وسلبية للDEC205 و33D1. هو أقل فرعية السمات التي تميزت وقد يكون شكلا أقل تميزا من CD8α NEG العاصمة.
الاختلافات المظهرية في مختلف مجموعات فرعية العاصمة تمتد أيضا إلى وظائفهم في الجسم الحي. وCD8α NEG البلدان النامية هي أكلة للغاية ويعتقد أن تقديم مستضد خارجي أساسا عن طريق معقد التوافق النسيجي الكبير الثاني لخلايا CD4 T 3. في المقابل، في نقاط البيع البلدان النامية CD8α هي متخصصة لتقديم المستضد البروتين القابلة للذوبان على MHC الصف الأولفي آلية تسمى عبر العرض. نتائج عبر العرض يعتمد على حالة تفعيل هذه البلدان النامية 5، وإما أن تؤدي إلى توسيع الخلايا التائية السامة (CTLs) أو تطور الخلايا التائية التنظيمية 6 2،7. استهداف مستضد إلى CD8α نقاط البيع البلدان النامية استخدام نتائج تسليم بوساطة مكافحة DEC205 الضد إلى حد كبير في حذف خلايا تي 8، في حين عرض المستضدات المشتقة من الخلايا أفكارك المصابة يؤدي الى CTL استجابة قوية 9.
بالإضافة إلى الاعتراف مستضدات الببتيد، تطورت الجهاز المناعي الثدييات الاعتراف الدهون ومولدات المضادات شحمي سكري. يتم عرض هذه المستضدات من قبل جزيئات CD1، التي هي معقد التوافق النسيجي الكبير الطبقة أحب بروتينات سطح الخلية الموجودة في النماذج الخاصة المتعددة في مختلف الثدييات. في الفئران، ونوع واحد من الحفظ جدا جزيء CD1 دعا CD1d هو المسؤول عن تقديم المستضدات شحمي سكري 10. الاختصاص ويطلق السكان من خلايا تي التي تعترف CD1d / المجمعات شحمي سكري خلايا NKT ثابتة (خلايا iNKT). هذه الخلايا تعبر عن شبه ثابتة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) يتألف من سلسلة TCRα ثابتة أن يقترن مع سلاسل TCRβ التي التنوع 11 محدودة. وخلافا للخلايا T التقليدية التي تحتاج لتتكاثر والتفريق لتصبح تنشيط خلايا T المستجيب، وجود خلايا iNKT باعتبارها السكان المستجيب وتبدأ الاستجابة بسرعة بعد تناوله شحمي سكري 12. تحديد الخلايا مستضد الدهون ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية هي منطقة نشطة للبحث، لذا تم اقتراح العديد من أنواع الخلايا المتميزة مثل B الخلايا، الضامة والبلدان النامية لأداء هذه المهمة. ومع ذلك، وقد تبين أن مجموعة فرعية CD8α نقاط البيع من البلدان النامية هي الخلية الأساسية التوسط امتصاص وعرض المستضدات الدهون في خلايا فأر iNKT 13 و شحمي سكري بوساطة عبر فتيلة من خلايا CD8 T 14.
ove_content "> لمقارنة كفاءة تقديم المستضد من قبل مختلف خلايا مقدمة للمستضد، نهج مباشرة هو لنقل أنواع مختلفة من ناقلات الجنود المدرعة النقاء نابض مع المبالغ المعادلة المستضد إلى المضيفين السذاجة. وغالبا ما يتم إجراء تجارب نقل خلية من هذا النوع للدراسات المناعية. ومع ذلك، إجراء الدراسات نقل مع البلدان النامية خارج الحي مستضد تعامل يشكل تحديا، لأن هذه الخلايا موجودة السكان نادرة كما هو الحال في الأجهزة اللمفاوية حيث أنها تشكل أقل من 2٪ من مجموع الخلايا (15). ولذا فمن الضروري تعزيز تطوير هذه الخلايا في الحيوانات المانحة لزيادة كفاءة بروتوكولات العزلة.ومن المعروف أن اللمفاوية المشترك والأسلاف النخاعي المشتركة، التي مطلوبة من أجل جيل من الحزب الديمقراطي المسيحي، CD8 نقاط البيع وفرعية CD8 NEG العاصمة، صريحة تتعلق FMS مستقبلات التيروزين كيناز 3 (FLT-3). عليها في الجسم الحي FLT-3 يجند (FLT-3L) الإدارة، emigratوزيادة أيون من FLT-3 معربا عن الخلايا السلف من نخاع العظام، مما أدى إلى زيادة البذر من الأعضاء الليمفاوية الطرفية وتوسيع بهم ناضجة العاصمة ذرية 16. يتم فقدان التعبير عن FLT-3 خلال الالتزام B، T أو NK مسارات تمايز الخلايا. لذلك، لوحظ فقط الحد الأدنى من التعديلات في هذه الخلايا على إدارة FLT-3L. لوحظ توسع مماثل في السكان في العاصمة الفئران تحمل الأورام الناتجة عن زرع خط الخلية B16-سرطان الجلد إفراز الفئران FLT-3L، الذي يوفر طريقة بسيطة واقتصادية لتوفير مستويات النظامية مستمرة من FLT-3L 17،18. باستخدام هذا النهج، قمنا بتطوير بروتوكول على أساس زرع الخلايا B16-سرطان الجلد إفراز FLT-3L لتحفيز التوسع في جميع مجموعات فرعية العاصمة العادية في الطحال الماوس، وبالتالي زيادة كبيرة في العوائد من هذه الخلايا التي يمكن أن تكون معزولة عن تجارب لاحقة . نجد دائما أنه في غضون 10-14 يوما بعد ايم تحت الجلدمزرعة للورم إفراز FLT-3، والفئران تطوير تضخم الطحال مع تخصيب ملحوظ في البلدان النامية تشكل 40 - 60٪ من مجموع خلايا الطحال. من هذه الطحال، مجموعات فرعية العاصمة مختلفة يمكن أن تكون معزولة مع نقاء عالية باستخدام معيار المتاحة تجاريا مجموعات تنقية الخلايا التي تستخدم علامات المظهرية-فرعية معينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تتم التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC). يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تتطلب العقم في خزانة السلامة البيولوجية.
1. زرع B16.Flt3L الميلانوما في الفئران
- ثقافة FLT-3 معربا عن B16 سرطان الجلد خط خلية في T25 قوارير زراعة الأنسجة في مناطق ذات كثافة من 0.5 × 10 6 خلية / مل في المتوسط DMEM كاملة مع 10٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. تنمو حتى تصل إلى خلايا ~ 90٪ التقاء (~ 20 ساعة).
- حصاد الخلايا بواسطة التربسين الهضم. نضح وسائل الإعلام ثقافة الخلية وغسل الخلايا الملتصقة مع برنامج تلفزيوني. إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة الباردة 20 مل الكامل DMEM المتوسطة (4 درجة مئوية) التي تحتوي على مصل العجل الجنين (FCS) لإرواء عملية الهضم البروتيني. رفع الخلايا من قبل طفيفة البزل تليها pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
- جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو آلية مكافحة بقاء الخلية. و resuspend إلى كثافة من 10 8 خلية / مل في برنامج تلفزيوني.
- الفئران زرع (C57BL / 6 أو سلالة متوافق نسيجيا آخر) مع الخلايا السرطانية عن طريق الحقن تحت الجلد كما وصفها Machholz وآخرون. 19 في قاعدة العنق مع 100 ميكرولتر من تعليق خلية (10 7 خلايا).
- السماح للورم أن ينمو حتى اضح أو مرئية (2-10 ملم في القطر، وعادة 7-12 أيام) قبل التضحية الحيوانات لأجهزة الحصاد.
2. إعداد الطحال تعليق خلية واحدة من ورم وإذ الفئران
- تخدير الفئران مع جرعة زائدة من الأيزوفلورين (ضبط معدل تدفق الأيزوفلورين ل> 5٪ ومواصلة التعرض 2 دقيقة على الأقل بعد توقف التنفس). التضحية FLT-3 الورم القتامي تحمل الماوس عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للقتل الرحيم.
- ديsinfect الجلد مع الايثانول 70٪ والطحال الحصاد باستخدام تقنية العقيم مع المعونة من مقص العقيمة 20.
- وضع الطحال في طبق بتري معقمة لنقلها إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تنفيذ جميع الخطوات من هنا تحت ظروف معقمة.
- نقل الطحال إلى طبق بيتري الطازجة وتغسل مع RPMI المتوسطة. قطع الطحال إلى قطع صغيرة (~ 0.2 سم 2) باستخدام مشرط. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 10 مل من محلول كولاجيناز / الدناز.
- صب تعليق هضمها جزئيا من أنسجة الطحال على مصفاة الخلية 70 ميكرون. ضغط شظايا الأنسجة المتبقية من خلال شبكة من مصفاة باستخدام 5 مل حقنة الغطاس.
- غسل فلتر شبكة مع 10 مل من متوسطة جديدة والتخلص من مرشح. الطرد المركزي تعليق في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لخلايا بيليه.
- نضح طاف و resuspend بيليه خلية في 2 مل من العازلة تحلل كريات الدم الحمراء. في احتضان RT وأو 10 دقيقة. إخماد العازلة تحلل كريات الدم الحمراء عن طريق إضافة 10 مل من المتوسط RPMI كاملة.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. resuspend في حجم مناسب لتحقيق كثافة الخلية من 10 8 خلية / مل في الخلية فرز عازلة (على سبيل المثال، أجهزة ماكينتوش) التي تحتوي على 20 ميكروغرام / مل من FC-كتلة الجسم المضاد (2.4G2).
3. تنقية بلازماوية البلدان النامية، CD8α نقاط البيع البلدان النامية وCD8α NEG البلدان النامية من الطحال تعليق خلية واحدة
ملاحظة: عزل مجموعات فرعية العاصمة الطحال من تعليق خلية واحدة هو إجراء متعددة الخطوات كما هو موضح في الشكل رقم 1 تنفيذ كافة الخطوات باستخدام عازلة تبرد قبل وحمام الماء المثلج للحفاظ على درجة حرارة 4-8 درجة مئوية. يتم احتساب كافة وحدات التخزين كاشف في القسم التالي من بروتوكول للمساهمة الأولي من 200 ميكرولتر من تعليق خلية الطحال في 10 8 خلية / مل). يمكن زيادتها هذا الأمر أوأسفل على أساس الحاجة الخاص بك عن طريق تغيير حجم التعليق الخلية (دائما في كثافة 1 X 10 8 خلايا / مل)، والكواشف الأخرى نسبيا في الخطوة الأولى (3.1.1 و 3.2.1). ضبط كميات كاشف في كل خطوات لاحقة وفقا لذلك. على سبيل المثال، إذا بدءا من 100 ميكرولتر من تعليق خلية الطحال في 1 × 10 8 / مل، واستخدام نصف كميات كاشف ورد في جميع الخطوات.
- عزل بلازماوية البلدان النامية (PDC)
- إضافة 300 ميكرولتر من المسمى البيوتين كوكتيل الأجسام المضادة المنصوص عليها في بلازماوية عدة العزلة العاصمة إلى 200 ميكرولتر من تعليق خلية الطحال.
- تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة. الاستفادة من أنبوب كل 3 دقائق للحفاظ على الخلايا مع وقف التنفيذ، وتحقيق أقصى قدر من الأجسام المضادة ملزمة.
- إضافة 12 مل الفرز الخلية العازلة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح طاف لإزالة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز غير منضم.
- Resuspend والخليةبيليه في 500 ميكرولتر من خلية عازلة الفرز. إضافة 300 ميكرولتر من مكافحة البيوتين الخرز الضد مترافق. كرر الخطوة 3.1.2 و3.1.3.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 2 مل من خلية عازلة الفرز. تنفيذ جميع الخطوات من هذه النقطة في RT باستخدام مخازن تبريد مسبقا.
- وضع الخلايا المغناطيسية جديدة تنشيط فرز عمود LS في الوقوف المغناطيسي. غسل وتتوازن العمود مع 5 مل من خلية عازلة الفرز.
- ماصة تعليق الخلية على العمود، وتطبيق برفق إلى وسط سطح سرير العمود. جمع التدفق من خلال.
- غسل العمود مع 10 مل من خلية عازلة الفرز. جمع هذا التدفق من خلال الجمع بين ومع تدفق من خلال من الخطوة 3.1.7. وأثرى PDCS في هذا التدفق عمود من خلال (FT1).
- بيليه الخلايا من FT1 بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، resuspend في 2 مل خلية عازلة الفرز وتمر الخلايا من خلال عمود LS جديدةبتكرار الخطوات 3.1.6 - 3.1.8. هذا الاستخدام من عمودين متتابعة غلة نقاء تعزيز الخلايا المعزولة.
- خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و resuspend مع 2 مل كاملة RPMI. وضع على الجليد لحين الحاجة إليها.
- عزل CD8α نقاط البيع وCD8α NEG البلدان النامية
ملاحظة: الخطوة الأولى في هذا الإجراء هو استنزاف الخلايا البائية، PDC، T وNK.- بدءا كله تعليق خلية الطحال (1 مل 10 8 خلية / مل حصلت عليه في الخطوة 2.8)، إضافة 100 ميكرولتر من البيوتين مترافق كوكتيل الأجسام المضادة المنصوص عليها في عدة العزلة CD8α نقاط البيع العاصمة.
- تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة. الاستفادة من أنبوب بلطف كل 3 دقائق لتحقيق أقصى قدر ملزمة من الأجسام المضادة المسمى البيوتين إلى الخلايا المستهدفة.
- إضافة 12 مل الفرز الخلية العازلة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح السوبرعائم لإزالة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز غير منضم.
- إضافة 150 ميكرولتر من خلية عازلة فرز و 100 ميكرولتر من الخرز مكافحة البيوتين المنصوص عليها في عدة العزلة CD8α نقاط البيع العاصمة. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 10 مل الفرز الخلية العازلة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- Resuspend الخلايا في 1 مل خلية عازلة الفرز وتمرير أكثر من عمود LS جديدة وفقا للإجراءات في الخطوات 3.1.6 خلال 3.1.8.
- جمع تدفق الخالي من الملصقات من خلال 2 (FT2) وتجاهل retentate العمود. وأثرى هذا جزء الخالي من الملصقات لCD8α نقاط البيع وCD8α NEG البلدان النامية.
- بيليه الخلايا في FT2 بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- Resuspend الخلايا في 1 مل العازلة خلية الفرز وإضافة 200 ميكرولتر من-CD8α المضادة حبات مغناطيسية مترافق المنصوص عليها في عدة العزلة CD8α نقاط البيع العاصمة.
- ممثلأكل الخطوات 3.2.2 خلال 3.2.6. وأثرى تدفق من خلال العمود لCD8α NEG البلدان النامية واستنزاف لCD8α نقاط البيع البلدان النامية. هذا هو المسمى تدفق من خلال 3 (FT3).
- إلى أزل CD8α نقاط البيع البلدان النامية الاحتفاظ بها في العمود، وإزالة عمود من المغناطيس، إضافة 5 مل من خلية عازلة الفرز وتطهير مصفوفة عمود باستخدام المكبس المتوفرة مع عمود LS.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح وطاف resuspend في 1 مل خلية عازلة الفرز. لزيادة نقاء، تشغيل خلايا مزال مرة أخرى من خلال عمود LS جديدة بتكرار الخطوات 3.1.6 إلى 3.1.8، إلا تجاهل التدفق من خلال وجمع الخلايا الاحتفاظ بها في 3.2.11.
- لتنقية CD8α NEG البلدان النامية من تعليق FT3، بيليه FT3 بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وresuspend في 300 ميكرولتر من خلية عازلة الفرز.
- إضافة 100 ميكرولتر من المجموعة الاستشارية للألغام المضادة للCD11c وحبات المغنطيسية. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 10 مل خلية فرز خلايا العازلة وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- كرر الخطوات من 3.1.5 خلال 3.1.8. ويتم اختيار CD8α NEG البلدان النامية بشكل إيجابي مع الخرز CD11c وولا بد أن العمود. تدفق من خلال يمكن التخلص منها.
- أزل الخلايا الاحتفاظ بها في العمود كما هو موضح في الخطوة 3.2.11 لجمع النقي CD8α NEG البلدان النامية.
4. النبض ناقلات الجنود المدرعة مع المستضدات ونقل خلية
- عد الخلايا الحية بعد تنقيتها باستخدام الأزرق الاستبعاد التريبان 21 لتمييز الخلايا الحية والميتة.
- احتضان الخلايا مع مستضد في الاختيار. استخدام نظائرها من المستضد شحمي سكري يسمى ألفا galactosyl سيراميد (αGalCer) في 100 نانومتر تركيز 13. عادة، لوحة 10 6 خلايا قابلة للحياة / جيد في المتوسط RPMI كاملة باستخدام فائقة منخفضة اتاكhment U-أسفل 96 لوحات جيدة للحد من مرفق الخلية. احتضان الخلايا في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعة.
- حصاد الخلايا بواسطة pipetting بلطف عدة مرات. استخدام واسعة نصائح تتحمل ماصة للتقليل من تلف الخلايا من قوى القص. غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني وتجمع هذه يغسل لتعظيم حصاد الخلايا.
- بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend إلى كثافة المطلوبة في برنامج تلفزيوني. عادة، حقن 1000000 الخلايا في 200 ميكرولتر في الحيوان المتلقي. تبقي الخلايا على الجليد لتحقيق أقصى قدر من الجدوى قبل الإدارة في الحيوانات المضيفة.
- حقن الخلايا عن طريق الوريد في الفئران إما من خلال عبثا الذيل الأفقي أو الضفيرة الوريدية الرجعية المدارية 19. استخدام 27 G إبرة في حقنة 1 مل، وحقن الحد الأقصى لحجم 0.1 مل في الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائج هذا الإجراء تعتمد على التوسع في مجموعات فرعية العاصمة من قبل الفئران FLT-3L التي أعرب عنها خلايا سرطان الجلد المزروع. وقد استمدت الورم B16.Flt3L من C57BL / 6 الماوس، وينبغي زرعها في الحيوانات مع هذه الخلفية سلالة من أجل تجنب الفشل من الورم لتصبح المنشأة بسبب الرفض. في بعض الحالات، قد يكون من المستحسن استخدام الفئران المعدلة وراثيا لاشتقاق البلدان النامية مع العيوب المعروفة في مسارات الإشارات أو مستقبلات المصالح. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن الورم قد تتطور مع حركية مختلفة في مثل هذه الحيوانات، ولذلك فمن المهم مراقبة نمو الورم على أساس المظهر والجس في موقع الحقن. في تجربتنا، وبمجرد أن الورم هو واضح، الورم B16.Flt3L تحمل الفئران تظهر باستمرار زيادة ملحوظة في الخلوية الطحال الذي يرتبط مع التوسع في جميع مجموعات فرعية العاصمة (الشكل 2A). ونحن نرى عادة الزياده 2- 3 أضعافه في عدد من إجمالي splenocytes تم الحصول عليها من الفئران الحاملة للسرطان الجلد B16.Flt3L بالمقارنة مع الحيوانات ساذجة. الزيادة في عدد DC في جزء يساهم في تخفيض واضح في وتيرة الخلايا البائية، في حين هناك القليل من عدم التغيير في الأرقام المطلقة من الخلايا البائية. ومن المثير للاهتمام، في حين أن التوسع الكبير (~ 15- لزيادة 20 أضعاف في أعداد المطلقة) لوحظ بالنسبة للبلدان النامية التقليدية في هذه الفئران، لا يوجد سوى زيادة متواضعة (حوالي 4 أضعاف) لوحظ في فرعية العاصمة بلازماوية الشكل.
يتم عرض استراتيجية النابضة لتحديد مجموعات فرعية العاصمة مختلفة في الشكل 2A، ويقوم على التعبير عن B220، CD11b، CD11c ووCD8α كعلامات المظهرية-فرعية معينة (الشكل 2B). نحن أيضا التحقيق DEC205، CD11b والتعبير mPDCA1 على هذه فرعية كما هو مبين في الشكل 2B. وهذا يدل على نمط متوقع، مع mPDCA فقط على مجموعة فرعية الحزب الديمقراطي المسيحي، في حين ديسمبر وأعرب عن 205 كبيرا على CD8α نقاط البيع البلدان النامية وتم الكشف عن CD11b أبرزها على CD8α NEG البلدان النامية. نحن أيضا بتحليل تغيرات في الخلايا الترددات لكل من مجموعات فرعية تنقيته في كل خطوة من بروتوكول صفها هنا (ملخصة في الشكل 2C، مع أمثلة تفصيلية لتدفق البيانات cytometric في الشكل 3). عزل مجموعات فرعية العاصمة الطحال وصفها في هذه الطريقة هو إجراء متعددة الخطوات (الشكل 1). تنقية البلدان النامية بلازماوية تعتمد على اختيار السلبية لإثراء هذه الخلايا بعد استنفاد جميع السكان غير مرغوب فيها مثل B، T، الخلايا القاتلة الطبيعية، والبلدان النامية التقليدية. يتم تنفيذ تنقية CD8α نقاط البيع البلدان النامية، وCD8α NEG البلدان النامية عن طريق الانتقاء الإيجابية لهذه الخلايا بعد نضوب خلايا T و B و NK. عالية النقاء من كل من المجموعات الفرعية العاصمة تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء (عادة ~ 95٪) ويتضح أيضا في الشكل (3).
ve_content. "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> اعتمادا على التجارب التي يتعين القيام بها، وهذه الخلايا يمكن نابض مع مستضد المطلوب ونقلها إلى المضيفين الفئران متوافق نسيجيا للدراسات المناعية وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه الخلايا أيضا استخدامها في الدراسات المجراة من الأنشطة المحفزة أو التنظيمية لمجموعات فرعية العاصمة فسيولوجية، وعائدات الخليوي لمجموعات فرعية العاصمة النقاء في 2 × 10 7 مجموع splenocytes ما يقرب من مليون PDCS، 2000000 CD8α نقاط البيع البلدان النامية و4 ملايين CD8α NEG البلدان النامية.
الشكل 1. عزل البلدان النامية. التخطيطي يوضح الخطوات المختلفة لبروتوكول لعزل مجموعات فرعية مختلفة من البلدان النامية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. >
الشكل 2. تحليل الطحال العاصمة مجموعات فرعية في الفئران مع B16.Flt3L الأورام. أ) يتضح استراتيجية المحاصرة لتحديد السكان الخلية المقابلة لPDCS (R1)، CD8α نقاط البيع البلدان النامية (R5) وCD8α NEG البلدان النامية (R6). ب) التعبير عن mPDCA1، 33D1، DEC205 وCD11b على مجموعات فرعية مختلفة. وتستخدم مجموعة سكانية السيطرة التي تفتقر إلى التعبير عن هذه العلامات C) تخصيب النسبي من العاصمة واللمفاويات فرعية معزولة عن الطحال من الفئران في اليوم؛ الخلايا الموجودة في البوابة R4 (السلبية للB220، CD11c و، CD11b مجموعة فرعية من الخلايا الليمفاوية). 14 بعد تلقيح خلايا سرطان الجلد B16.Flt3L هو مبين في المؤامرة اليسار كما القضبان السوداء، بينما يظهر التردد من هؤلاء السكان الخلايا في الفئران السذاجة كما أشرطة بيضاء. تعرض مؤامرة اليمين نفس البيانات وأرقام الهواتف المحمولة.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تحليل الطحال العاصمة مجموعات فرعية خلال بروتوكول التخصيب. أ) إثراء البلدان النامية بلازماوية الشكل (B220 السامية وCD11c ومنخفضة، R1) من 10٪ في البدء السكان من splenocytes من ورم B16.Flt3L تحمل الفئران إلى ~ 95٪ النقاء في العمود تتدفق من خلال 1. لاحظ أن retentate خلايا مزال من هذا العمود ونضبت هذه الفئة من السكان. ب) إثراء البلدان النامية التقليدية (في CD11c والعليا، خليط من CD8α الإيجابية والسلبية) من ~ 33٪ في الطحال من B16.Flt3L الفئران في يوم 10 بعد زرع الورم إلى ~ 78٪ في الحاملة للسرطان الجلد تدفق الى 2 جزء. في المؤامرات العمود retentate 2، يظهر السكان إيجابي CD11c وأن يكون حزبالمنضب حليف، المقابلة لإزالة أعداد كبيرة من البلدان النامية خلال اختيار السلبية لاستنزاف خلايا T و B و NK. مزيد من التجزئة للتدفق من خلال 2 تعليق باستخدام اختيار إيجابية للعائدات ملزمة لمكافحة CD8> 95٪ نقاء CD8α نقاط البيع البلدان النامية. تدفق من خلال من هذا وبعد ذلك تعرض لاختيار إيجابية لربط مكافحة CD11c و، مما أسفر عن عدد سكانها> 95٪ نقية CD8α NEG البلدان النامية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتقبل الخلايا الجذعية ليكون المستضد المهنية الرئيسية تقديم الخلايا المشاركة في فتيلة من ردود الخلايا التائية. وظيفتها الرئيسية هي لمسح المكروية الأنسجة عن طريق تناول ومعالجة المستضدات لعرضها على خلايا تي. من أجل دراسة وظيفة فرعية العاصمة محددة، وهذه تحتاج إلى أن تكون معزولة في أعداد كافية باستخدام النهج الذي يحافظ على النمط الظاهري وظائف وضعها الطبيعي. معظم البروتوكولات تعتمد على عزل فرعية العاصمة معينة من الفئران ساذجة. وبما أن هذه الخلايا هي نادرة، وإجراءات العزل ليست فعالة وتسفر عن انخفاض أعداد الخلايا. على سبيل المثال، سوف الطحال واحدة تسفر فقط عن 0،5-1٬000٬000 البلدان النامية CD8 نقاط البيع، في حين أن معظم التجارب أجريت مع الدراسات نقل استخدام ما لا يقل عن هذا العدد من الخلايا لكل حيوان. وبالتالي، يشكل قيدا رئيسيا من الأساليب القائمة هو عدم القدرة على عزل أعداد الخلايا كافية دون استخدام أعداد كبيرة جدا من الفئران المانحة وكميات كبيرةمن الكواشف. أسلوبنا يتغلب إلى حد كبير هذه المشاكل باستخدام الفئران مزروع مع إفراز الورم FLT-3L لتوسيع كثيرا من البلدان النامية، مما يسمح تنقية أعداد أكبر بكثير من فرعية العاصمة الثلاث المعترف بها جيدا باستخدام سلسلة من الخطوات لتنقية immunomagnetic. وبالتالي يوفر بروتوكول صفها هنا تحسنا كبيرا مقارنة مع الطرق القائمة من حيث العائدات بنسبة لا تقل عن عدة أضعاف.
وتوجد هناك بعض المحاذير لبروتوكول العزلة هو موضح هنا. الحد الرئيسي هو أن هذا الإجراء يستخدم لعزل هذه الخلايا قد تغير عن غير قصد ملامحهم. البلدان النامية هي حساسة بشكل رائع للتلوث الذيفان الداخلي والمحفزات الميكانيكية التي قد تؤدي إلى تغيرات في النمط الظاهري وظيفة. الحد آخر من هذه التقنية هو الاعتماد على إفراز FLT-3L لتوسيع فرعية العاصمة. وهذا يؤدي إلى عدم التوسع في مجموعات فرعية العاصمة المقيمين الأنسجة التي لا تعبر عن مستقبلات FLT-3.
البروتوكول الموصوفة هنا يعتمد على تخصيب الخلية باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا. طقم لعزل تنقية الخلايا يأتي مع البروتوكول الذي يحتوي على كميات الموصى بها من الكواشف لاستخدامها. تكوين خلية الورم الحاملة للفئران تختلف بشكل كبير عن تلك الفئران السذاجة (الشكل 2C)، وبالتالي قمنا بتعديل المبالغ للمواد المستخدمة في تقنية لدينا من أجل تحقيق النقاء الخلية الأمثل. في البلدان النامية هي خلايا ملتصقة وقد نعلق على مصفوفة عمود غير وجه التحديد. موازنة من السرير العمود مع العازلة التي تحتوي على EDTA يقلل التقيد الخلية، واستخدام مرور التسلسلي على عمودين متتالية تحسن نقاء خلية أخرى.
البلدان النامية هي خلايا ملتصقة جدا وفي الجسم الحي عموما ترتبط ارتباطا وثيقا مع المصفوفة النسيج خارج الخلية. من أجل زيادة الغلة، من المهم جدا لهضم أنسجة الطحال مع كولاجيناز والدناز وجود عدد كاف تيمه لاستخراج أقصى عدد من هذه الخلايا. ومن المهم أيضا أن تتأكد من أن شظايا الأنسجة الطحال وغرقت تماما في حل أنا كولاجيناز / الدناز حين تمر الهضم. ميزة أخرى هامة من العزلة هي العاصمة للحفاظ على عقم صارمة وشروط خالية من الذيفان الداخلي خلال إجراء العزل، لأن هذه الخلايا هي غاية استجابة الذيفان الداخلي. استخدام الكواشف الطازجة من المخزونات خالية من الذيفان الداخلي، وتصفية تعقيم جميع الكواشف قبل الاستخدام. وينبغي أن يستكمل جميع المخازن عزل الخلايا وسائل الإعلام مع FCS أن يتم اعتماد أن تكون خالية من الذيفان الداخلي للكشف. هذه الخلايا هي أيضا حساسة للغاية للمؤثرات الميكانيكية والتحفيز الميكانيكي المتكرر قد يغير دولة نضوج هذه الخلايا. على الرغم من أن هناك حاجة إلى بعض القوة الميكانيكية لإجبار الأنسجة من خلال مصفاة الخلية بعد الهضم كولاجيناز، وهذا ينبغي أن يتم ذلك بلطف قدر الإمكان. وبالإضافة إلى ذلك، pipetting لقوي من الخلايا ينبغي تجنب قدر الامكانوينبغي استخدام البريد، وماصة تتحمل واسعة نصائح لتقليل قوى القص.
نموذج نقل بالتبني هو مفيد للتحقيق في تقديم المستضد وT فتيلة الخلية عن طريق فرعية محددة من البلدان النامية. ومع ذلك، فقد ثبت في دراسات أخرى أن نقل المستضد قد تحدث من المستضد نابض البلدان النامية إلى البلدان النامية الذاتية. وبالتالي، قد تعكس استجابة تكيفية المناعة بتحريض من خلايا مستضد نابض العرض الذي قدمه البلدان النامية الذاتية تقديم "القبض" مستضد وليس من APC نقلها. ويزداد هذا النوع من نقل أضعافا مضاعفة إذا كانت الاستعدادات العاصمة معزولة تحتوي على الخلايا الميتة أو التي تحتضر. ولذلك فمن المهم لتنفيذ العزل ونقل بروتوكول العاصمة بأسرع وقت ممكن، وذلك باستخدام ظروف معقمة مع مخازن تبريد مسبقا لتعزيز بقاء الخلية. اخترنا فترة مستضد ينبض قصيرة نسبيا من 4 ساعات لهذا السبب، مع الحضانة في لوحات زراعة الخلايا ملزمة المنخفضة للحد من مرفق الخلية خلالهذه الخطوة. وبالإضافة إلى ذلك، مدد حالة الثقافة قد يغير الوضع نضوج البلدان النامية مثقف، ويمكن أن تؤثر على نتائج تجارب نقل بالتبني 22.
وباختصار، بيولوجيا الخلايا الجذعية هي منطقة نشطة جدا من الأبحاث، وتطوير طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد البلدان النامية التي تعكس بأمانة في الجسم الحي المظهرية ويوفر اختلاف وظيفي فرصة هائلة لدراسة هذه الخلايا. هذا يصبح من المهم وخاصة بالنسبة للدراسات التي تنطوي على المواد الكيميائية التي قد تعدل وظائف العاصمة ولكن لا يمكن أن تدار بشكل منتظم في النماذج الحيوانية. علاج فرعية العاصمة معزولة من الاهتمام خارج الحي مع هذه المواد الكيميائية هو النهج العملي والممكن عمليا التي يمكن أن تساعد في الكشف عن تفاصيل الآلية من مسارات تقديم المستضد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIAID منحة AI45889 إلى SAP التدفق الخلوي وأجريت دراسات من استخدام المرافق الأساسية FACS بدعم من مركز أينشتاين السرطان (NIH / NCI CA013330) ومركز لأبحاث الإيدز (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
