Abstract
As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios profissionais primariamente responsável pela aquisição, processamento e apresentação de antigénios no antigénio que apresenta moléculas para iniciar a imunidade mediada por células-T. As células dendríticas podem ser separados em vários subconjuntos fenotipicamente e funcionalmente heterogéneas. Três subconjuntos importantes de células dendríticas esplênicas são plasmocit�des, as células CD8a POS e CD8a Neg. As DCs plasmocitoides são produtores naturais de interferão de tipo I e são importantes para a imunidade de células T anti-viral. O subconjunto de CD8a Neg DC é especializado para apresentação de antígenos MHC classe II e está envolvido no centro de priming células T CD4. O CD8a Pos DCs são os principais responsáveis para a apresentação cruzada de antígenos exógenos e priming células T CD8. As DCs CD8a Pos ter sido demonstrado ser mais eficaz na apresentação de antigénios de glicolípidos por moléculas CD1d a um cel t especializadol população conhecidas como células invariante natural killer T (iNKT). A administração de ligando Flt-3 aumenta a frequência de migração de células progenitoras de células dendríticas a partir da medula óssea, resultando em última análise, a expansão de células dendriticas em órgãos linfóides periféricos em modelos murinos. Temos este modelo adaptado para purificar grandes números de células dendríticas funcionais para utilização em experiências de transferência de células para comparar proficiência in vivo de diferentes subconjuntos de DC.
Introduction
As células dendríticas (DC) foram descobertos há quase quarenta anos como o "grande estreladas celular (dendron grego)" encontrado nos órgãos linfóides 1. Muitos estudos têm demonstrado que DC são as únicas células que apresentam o antigénio que pode estimular eficazmente células T ingénuas 2. Uma das principais funções destas células é a absorção de antigénios e apresentação e o seu processamento eficiente e carregamento destes para moléculas que apresentam antigénios. No baço de ratinho, as DCs pode ser separado em subconjuntos e plasmocit�des convencionais. As DCs plasmocitoides são caracterizados por uma baixa expressão de CD11c e níveis elevados de B220 e Gr-1. Eles também são positivas para o mPDCA1 marcador de superfície e secretar interferon tipo I em resposta a toll like receptor 9 ligantes (TLR9). As DCs convencionais são elevados para CD11c e MHC classe expressão II. Eles podem ser divididos em três subgrupos distintos com base na expressão de superfície de marcadores fenotípicos tais como CD4, CD8a, DEC205, CD11b e receptor de células dendríticas 2 inibitória (DCIR2, reconhecida pelo anticorpo 33D1) proteínas de 3,4. Os CD8a Pos DCs são também conhecidos como CDC1, são positivos para DEC205, mas negativo para marcadores mielóides tais como CD11b e 33D1. O CD8a Neg DCs, também chamado cdc2, são positivos para 33D1, CD11b e CD4, mas falta DEC205. O subconjunto dupla negativa (isto é, negativo para CD4 e CD8a) é relativamente rara, e é negativo para DEC205 e 33D1. É o subconjunto menos caracterizado e pode ser uma forma menos diferenciadas de CD8a Neg DC.
Diferenças fenotípicas nos diferentes subconjuntos de DC também se estendem para as suas funções in vivo. O CD8a Neg DCs são altamente fagocítica e são pensados para apresentar antigénio exógeno principalmente por via do MHC de classe II às células T CD4 + 3. Em contraste, as DCs CD8a Pos são especializados para apresentação de antigénio proteico solúvel em MHC de classe Inum mecanismo denominado apresentação cruzada. O resultado da apresentação cruzada depende do estado de activação de estas DCs 5, e pode levar à expansão das células T citotóxicas (CTL) ou o desenvolvimento de células T reguladoras 6 2,7. Segmentação de antigénio para CD8a Pos DCs utilizando resultados de entrega anti-DEC205-anticorpo-mediadas, em grande parte na eliminação de células T 8, enquanto que a apresentação de antigénios derivados de células apoptóticas infectadas induz uma forte resposta de CTL 9.
Além do reconhecimento de antigénios peptídicos, o sistema imunitário de mamífero evoluiu para reconhecer lípido e antigénios de glicolípidos. Estes antigénios são apresentados por moléculas de CD1, que são proteínas de MHC de classe I na superfície de células semelhantes que existem em várias formas relacionadas em vários mamíferos. Em ratos, um único tipo de molécula de CD1 CD1d altamente conservada chamada é responsável pela apresentação de antigénios glicolipidicos 10. O prefeito população de células T que reconhecem os complexos glicolipidicos / CD1d é chamado células NKT invariantes (células iNKT). Estas células expressam um receptor de células T semi-invariante (TCR) composto por uma cadeia invariante TCRα que é emparelhado com cadeias TCRβ que a diversidade 11 limitadas. Ao contrário das células T convencionais que precisam proliferam e se diferenciam para se tornarem células T efectoras activadas, existem células iNKT como uma população efectora e começar a responder rapidamente após a administração de 12 glicolípido. Identificação de células apresentadoras de antigénio lípido fisiologicamente relevante é uma área activa de investigação, e vários tipos de células distintos, tais como células B, macrófagos e células dendríticas têm sido sugeridos para executar esta função. No entanto, demonstrou-se que o subconjunto CD8a Pos de DCS é a principal célula mediar a captação e a apresentação de antigénios a células lipídicas rato iNKT 13 e glicolípido mediada cross-priming de células T CD8 14.
ove_content "> Para comparar a eficiência da apresentação de antigénio por diferentes células apresentadoras de antigénio, uma abordagem simples é a transferência de diferentes tipos de APC purificadas pulsadas com quantidades equivalentes de antigénio em hospedeiros sem tratamento prévio. experiências de transferência celular deste tipo são muitas vezes realizados para estudos imunológicos. no entanto, a realização de estudos de transferência com DCs tratadas ex vivo antigénio é desafiador, uma vez que estas células não existem populações como raros em órgãos linfóides, onde eles constituem menos do que 2% do total de células 15. por conseguinte, é necessário reforçar o desenvolvimento destas células em animais dadores para aumentar a eficácia dos protocolos de isolamento.Sabe-se que o linfóide comum e progenitores mielóides comuns, que são necessários para a geração de pdc e CD8 Pos subconjuntos e CD8 Neg DC, fms relacionados expressa a tirosina-cinase do receptor 3 (Flt-3). Após a in vivo, ligando Flt-3 (Flt-3L) administração, emigratião de Flt-3 que expressam as células progenitoras da medula óssea é aumentada, resultando no aumento da semeadura de órgãos linfóides periféricos e a expansão da sua descendência madura CC 16. A expressão de Flt-3 é perdida durante compromisso com o B, T ou NK vias de diferenciação celular. Portanto, apenas alterações mínimas são observados nestas células após administração Flt-3L. Expansão similar em populações DC é observada em ratinhos portadores de tumores gerados por implantação de uma linha celular de melanoma B16-secretoras de murino Flt-3L, que proporciona um método simples e económico para proporcionar níveis sistémicos sustentados de Flt-3L 17,18. Utilizando esta abordagem, temos desenvolvido um protocolo com base na implantação de células B16 de melanoma secretoras de Flt-3L para estimular a expansão de todos os subconjuntos normais DC em baço de ratinho, aumentando assim os rendimentos destas células que podem ser isolados por experiências subsequentes . Nós sempre achar que dentro de 10 - 14 dias após im subcutâneaplantação do tumor secretor de Flt-3, os murganhos desenvolvem esplenomegalia com enriquecimento acentuada das DCs para constituir 40 - 60% do total de células de baço. A partir destes baços, diferentes subconjuntos de DC pode ser isolado com pureza elevada utilizando kits de purificação de células padrão disponíveis comercialmente que utilizam marcadores fenotípicos específicos do subconjunto.
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Protocol
Experiências em animais são feitos de acordo com as directrizes aprovadas do comitê institucional cuidados com os animais e uso (IACUC). Todos os procedimentos que requerem a esterilidade são realizadas em uma cabine de segurança biológica.
1. Implantação de Melanoma B16.Flt3L em Ratos
- Cultura da linha expressando Flt-3 de células de melanoma B16 em frascos de cultura de tecidos T25, a uma densidade de 0,5 X 10 6 células / ml em meio DMEM completo com 10% de CO 2 a 37 ° C. Crescer até as células atingirem confluência ~ 90% (~ 20 h).
- Colher as células por digestão com tripsina. Aspirar os meios de cultura de células e lavar as células aderentes com PBS. Adicionar 5 ml de 0,05% de tripsina e incubar durante 5 min a 37 ° C. Adicionar a frio 20 ml de meio DMEM completo (4 ° C) contendo soro fetal de vitelo (FCS) para extinguir a digestão com protease. Levante as células off batendo levemente seguido cuidado pipetando para cima e para baixo.
- Recolher as células por centrifugação a 300xg durante 10 min a 4 ° C. Contar as células utilizando um hemocitómetro ou um contador de viabilidade de células automatizado. Ressuspender a uma densidade de 10 8 culas / ml em PBS.
- Ratinhos implante (C57BL / 6 ou outra estirpe histocompatível) com células de tumor por injecção subcutânea como descrito por Machholz et al. 19, na base do pescoço com 100 ul de suspensão de células (10 7 células).
- Permitir que o tumor crescer até serem palpáveis ou visíveis (2 - 10 mm de diâmetro, geralmente de 7 - 12 dias) antes de sacrificar os animais para os órgãos de colheita.
2. Preparação de Esplênica suspensão única célula de RATOS COM TUMOR
- Anestesiar ratos com uma overdose de isoflurano (ajustar a taxa de fluxo de isoflurano a> 5% e continuar a exposição, pelo menos, 2 minutos após a paragens de respiração). Sacrificar o mouse rolamento Flt-3 tumor melanoma por deslocamento cervical de acordo com as diretrizes institucionais para a eutanásia.
- disinfect a pele com 70% de etanol e colheita do baço utilizando uma técnica asséptica, com o auxílio de uma tesoura esterilizada 20.
- Colocar o baço em uma placa de Petri estéril para o transporte para a cabine de segurança biológica. Execute todas as etapas a partir daqui em condições estéreis.
- Transferir baço para um prato fresco Petri e lavar com meio RPMI. Cortar o baço em pedaços pequenos (~ 0,2 centímetros 2) utilizando um bisturi. Incubar durante 30 min a 37 ° C com 10 ml de solução de colagenase / ADNase.
- Verter a suspensão parcialmente digerido de tecido do baço sobre um filtro celular de 70 uM. Comprimir os restantes fragmentos de tecido através da tela do filtro com 5 ml de uma êmbolo da seringa.
- Lavar o filtro de malha com 10 ml de meio fresco e descartar o filtro. Centrifugar a suspensão a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar as células.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos. Incubar à temperatura ambiente fou 10 min. Extingue-se a tampão de lise dos glóbulos vermelhos por adição de 10 ml de meio RPMI completo.
- Agregar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender em volume apropriado para atingir a densidade de células de 10 8 culas / ml em tampão de separação de células (por exemplo, MACS) contendo 20 ug / ml de anticorpo de Fc-bloco (2.4G2).
3. Purificação de plasmocitóides DCs, CD8a Pos DCs e CD8a Neg DCs a partir do baço suspensão única célula
Nota: O isolamento dos subconjuntos de DC esplénicos de suspensão de célula única é um processo multi-passo, como ilustrado na Figura 1 execute todas as etapas usando tampão de pré-arrefecido e um banho de água gelada para manter a temperatura a 4-8 ° C.. Todos os volumes de reagente na seção seguinte do protocolo são calculados para uma entrada inicial de 200 ul de suspensão de células do baço em 10 8 células / ml). Este pode ser aumentado oupara baixo com base na sua necessidade, alterando o volume de suspensão de células (sempre com uma densidade de 1 x 10 8 células / ml) e outros reagentes proporcionalmente no passo inicial (3.1.1 e 3.2.1). Ajustar os volumes de reagente em todas as etapas posteriores de acordo. Por exemplo, se começando com 100 ul de suspensão de células do baço a 1 x 10 8 / mL, usar metade dos volumes de reagentes indicados em todas as etapas.
- Isolamento de plasmocitóides DCs (PDC)
- Adicionar 300 ul de coquetel de anticorpo marcado com biotina fornecido no kit de isolamento de DC plasmocit�des a 200 ul de suspensão de células do baço.
- Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min. Toque no tubo a cada 3 minutos para manter as células em suspensão, e para maximizar a ligação do anticorpo.
- Adicionar 12 ml de tampão de célula triagem e peletizar as células por centrifugação a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante para remover os anticorpos não ligados biotinilados.
- Ressuspender a célulapellet em 500 ul de tampão de separação de células. Adicionar 300 ul de esferas de anticorpo anti-conjugado com biotina. Repita o passo 3.1.2 e 3.1.3.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão de separação de células. Execute todas as etapas a partir deste ponto à temperatura ambiente usando buffers pré-arrefecido.
- Coloque uma célula ativada magnética fresco triagem coluna LS no suporte magnético. Lave e equilibrar coluna com 5 ml de tampão de separação de células.
- Pipetar a suspensão de células na coluna, aplicando-o suavemente para o centro da superfície do leito da coluna. Recolhe-se o fluxo através de.
- Lava-se a coluna com 10 ml de tampão de separação de células. Recolha este fluxo através e combinar com o fluxo através do passo 3.1.7. Os pDCs são enriquecidos nesse fluxo de coluna através de (FT1).
- Agregar as células de FT1 por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, ressuspender em 2 ml de tampão de triagem de células e passar as células através de uma coluna LS frescorepetindo os passos 3.1.6 - 3.1.8. Este uso de duas colunas sequenciais produz pureza aumentada de células isoladas.
- as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, e ressuspender com 2 ml de RPMI completo. Coloque em gelo até ser necessário.
- Isolamento de CD8a Pos e CD8a DCs Neg
Nota: O primeiro passo neste processo é a depleção de células B, PDC, T e NK.- Começando com toda a suspensão de células do baço (1 ml de 8 a 10 células / ml obtidas no passo 2.8), adicionar 100 ul de coquetel de anticorpo conjugado com biotina fornecido no kit de isolamento de CD8a Pos DC.
- Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min. Toque suavemente o tubo a cada 3 min para maximizar a ligação dos anticorpos marcados com biotina para suas células alvo.
- Adicionar 12 ml de tampão de célula triagem e peletizar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar Supernatant para remover os anticorpos biotinilados não ligados.
- Adicionar 150 ul de tampão de separação de células e 100 ul de contas de anti-biotina fornecidos no kit de isolamento de CD8a Pos DC. Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min.
- Adicionar 10 ml de tampão de célula triagem e peletizar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em tampão de classificação 1 ml de células e passar sobre uma coluna LS frescos acordo com o procedimento nos passos 3.1.6 através de 3.1.8.
- Recolhe-se o fluxo não marcado a 2 (FT2) e descartar o material retido coluna. Esta fracção não marcado é enriquecido para CD8a Pos e CD8a DCs Neg.
- Agregar as células em FT2 por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em tampão de células de triagem 1 ml e adicionar 200 ul de anti-CD8a contas magnéticas conjugadas fornecidos no kit de isolamento de CD8a Pos DC.
- Repcomer passos 3.2.2 através de 3.2.6. O fluxo através da coluna é enriquecido para CD8a Neg DCs e esgotado para CD8a Pos DCs. Esta é rotulada fluxo através de 3 (FT3).
- Para eluir a CD8a Pos DCs retidos na coluna, a coluna de remover o íman, adicionam-se 5 ml de tampão de separação de células e purgar a matriz da coluna utilizando o êmbolo fornecida com a coluna LS.
- Agregar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em tampão de triagem 1 ml de células. Para aumentar a pureza, executar as células eluídas novamente através de uma coluna LS fresca, repetindo os passos 3.1.6 a 3.1.8, excepto descartar o fluxo através e recolher células retidas como em 3.2.11.
- Para a purificação de CD8a Neg DCs a partir da suspensão FT3, sedimentar a FT3 por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender em 300 ul de tampão de separação de células.
- Adicione 100 ml de mag anti-CD11cgrânulos magnética. Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min.
- Adicionar triagem células de tampão e 10 ml de pelotas de células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Repita os passos 3.1.5 através de 3.1.8. O CD8a Neg DCs são selecionados positivamente com contas CD11c e estão ligadas à coluna. O fluxo que atravessa pode ser descartado.
- Elui-se as células retidas na coluna tal como descrito no passo 3.2.11 para recolher a CD8a purificada Neg DCs.
4. Pulsing APCs com antígenos e Transferência de celular
- Contar as células vivas após purificação usando exclusão de azul tripano 21 a distinguir as células vivas e mortas.
- Incubam-se as células com o antigénio de escolha. Use análogos de antigénio glicolipídico ceramida chamada alfa-galactosilo (αGalCer) na concentração de 100 nM de 13. Normalmente, placa 10 6 células viáveis bem em meio RPMI / completo utilizando ultra-low ATTAChment de fundo em U placas de 96 poços para minimizar a ligação de células. Incubar as células em uma atmosfera de 5% de CO2 a 37 ° C durante 1-4 h.
- Células colheita com cuidado pipetando várias vezes. Use largas dicas furo de pipeta para minimizar os danos celulares a partir de forças de cisalhamento. Lavar os poços com PBS e agrupar as lavagens para maximizar a colheita de células.
- Agregar as células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender a densidade desejada em PBS. Tipicamente, injectar 1 milhão de células em 200 ul por animal receptor. Manter as células no gelo para maximizar a viabilidade antes da administração em animais hospedeiros.
- Injetar células por via intravenosa em ratos, quer através do vão lateral da cauda ou do plexo venoso retro-orbital 19. Usar uma agulha G 27 numa seringa de 1 ml e injectar um volume máximo de 0,1 ml por ratinho.
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Representative Results
O resultado deste procedimento baseia-se na ampliação de subconjuntos de DC de murino por Flt-3L expressos pelas células de melanoma implantado. O tumor B16.Flt3L foi derivado a partir de um ratinho C57BL 6 /, e deve ser implantado num animal com essa estirpe de fundo, a fim de evitar o fracasso do tumor para se estabelecer devido à rejeição. Em alguns casos, pode ser desejável a utilização de ratinhos geneticamente modificados para derivar as DCs com defeitos conhecidos nas vias de sinalização ou receptores de interesse. É importante ter em mente que o tumor pode desenvolver-se com diferentes cinéticas em tais animais, por isso é importante para monitorar o crescimento de tumor com base na aparência e palpação no local da inoculação. Na nossa experiência, uma vez que o tumor é palpável, o tumor B16.Flt3L ratinhos portadores mostram consistentemente um aumento marcado na celularidade do baço que se correlaciona com a expansão de todos os subconjuntos de DC (Figura 2A). Nós normalmente ver um increas de 2 a 3 vezese no número total de esplenócitos obtidos a partir de ratinhos portadores de melanoma B16.Flt3L em comparação com animais naive. O aumento no número de DC, em parte, contribui para a redução aparente na frequência de células B, enquanto que há pouca ou nenhuma alteração no número absoluto de células B. Curiosamente, enquanto que uma grande expansão (~ 15 a aumento de 20 vezes no número absoluto) é observado para as DCs convencionais nestes ratinhos, há apenas um modesto aumento (cerca de 4 vezes) observado no subconjunto DC plasmocit�des.
A estratégia de propagação diferentes para identificar subconjuntos de DC é mostrado na Figura 2A e baseia-se na expressão de B220, CD11b, CD11c e CD8a como marcadores fenotípicos específicos do subconjunto (Figura 2B). Investigou-se também DEC205, CD11b e expressão mPDCA1 nestes subconjuntos como mostrado na Figura 2B. Isto mostra o padrão esperado, com mPDCA apenas no subconjunto pDC, enquanto dezembro 205 é expressa altamente sobre CD8a Pos DCs e CD11b é detectado o mais proeminente na CD8a DCs Neg. Foram também analisadas as alterações nas frequências de células para cada um dos subconjuntos purificada a cada etapa do protocolo descrito aqui (resumidos na Figura 2C, com exemplos detalhados dos dados de citometria de fluxo na Figura 3). O isolamento dos subconjuntos de DC esplénicas descritos no presente método é um processo de múltiplos passos (Figura 1). Purificação de DCs plasmocitoides baseia-se na selecção negativa para enriquecer estas células após a depleção de todas as populações indesejadas como B, T, células NK e DC convencionais. A purificação do CD8a Pos DCs, e CD8a Neg DCS é realizada por selecção positiva destas células após a depleção de células T, B e NK. O elevado grau de pureza de cada um dos subconjuntos de DC obtidas utilizando este procedimento (tipicamente ~ 95%) é também ilustrada na Figura 3.
ve_content. "FO: manter-together.within-page =" 1 "> Dependendo das experiências para ser realizada, estas células podem ser pulsadas com um antigénio desejado e transferida para hospedeiros murinos histocompatíveis para estudos imunológicos Além disso, estas células podem também ser usado para estudos in vivo de atividades estimulantes ou regulamentares dos subconjuntos fisiológicas DC. os rendimentos celulares para os subconjuntos de DC purificadas por 2 x 10 7 esplenócitos totais são cerca de um milhão pDCs de 2 milhões de CD8a Pos DCs e 4 milhões de CD8a DCs Neg.
Figura 1. Isolamento de DCs. Um esquema que ilustra as várias etapas do protocolo para o isolamento de diferentes subconjuntos de DCs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. >
Figura 2. Análise do baço DC Subconjuntos em camundongos com tumores B16.Flt3L. A) estratégia Gating é ilustrada para identificar as populações de células correspondentes a pDCs (R1), CD8a Pos DCs (R5) e CD8a Neg DCs (R6). B) A expressão de mPDCA1, 33D1, DEC205 e CD11b em diferentes subconjuntos. As células contidas no portão R4 (um subconjunto de linfócitos, negativo para B220, CD11c, CD11b) são utilizadas como uma população de controlo sem a expressão destes marcadores c) enriquecimento relativo de DC e subpopulações de linfócitos isolados a partir dos baços de ratinhos no dia. 14 após a inoculação de células de melanoma B16.Flt3L é mostrado no gráfico da esquerda como barras pretas, enquanto que a frequência destas populações de células em ratinhos ingénuos é mostrado como barras brancas. O enredo da direita apresenta os mesmos dados como números de celulares.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise do baço DC Subconjuntos Durante Enriquecimento protocolo. A) O enriquecimento de DCs plasmocitoides B220 (alto e baixo CD11c, R1) a partir de 10% da população inicial de células de baço de ratinhos portadores de tumor B16.Flt3L para ~ 95% de pureza em coluna fluir através 1. Note-se que as células de retentado fluido desta coluna estão esgotados desta população. B) Enriquecimento de DC convencionais (em CD11c alta, mistura de CD8a positiva e negativa) de ~ 33% nos baços de B16.Flt3L melanoma portadoras de ratinhos no dia 10 após a implantação do tumor para ~ 78% em o fluxo através da fracção 2. Na coluna retido 2 lotes, as populações positivas CD11c parecem ser partialiado empobrecido, correspondente à remoção de números substanciais de DC durante a selecção negativa para destruir as células T, B e NK. Mais fraccionamento do fluxo através de duas suspensão utilizando selecção positiva para os rendimentos de ligação anti-CD8> 95% de pureza de CD8a Pos DCs. O fluxo através deste foi então submetido a selecção positiva para a ligação de anti-CD11c, produzindo uma população de> 95% puro CD8a DCs Neg. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As células dendríticas são aceites como sendo a principal antigénio profissional células envolvidas na iniciação de respostas de células T apresentando. Sua função principal é fazer um levantamento do microambiente do tecido, tomando-se e processar antigénios para apresentação às células T. A fim de estudar a função dos subconjuntos de DC específicos, estes devem ser isolado em quantidade suficiente usando uma abordagem que mantém o seu fenótipo e funções normais. A maioria dos protocolos contar com o isolamento de DC subconjunto específico de ratinhos ingénuos. Uma vez que estas células são raros, os procedimentos de isolamento não são eficientes e de baixo rendimento números de células. Por exemplo, um baço produzirá apenas cerca de 0,5-1000000 DCs CD8 pos, enquanto a maioria das experiências realizadas com estudos de transferência de utilizar pelo menos este número de células por animal. Assim, uma limitação importante dos métodos existentes é a incapacidade para isolar os números de células suficientes, sem utilizar um grande número de ratinhos dadores e volumes substanciaisde reagentes. O nosso método ultrapassa substancialmente esses problemas utilizando ratinhos implantados com um tumor secretor de Flt-3L para expandir as DCs, permitindo a purificação de um número muito maior de três subconjunto DC bem reconhecido usando uma série de passos de purificação imunomagnéticas. O protocolo descrito aqui, portanto, proporciona uma grande melhoria sobre os métodos existentes em termos de rendimento por pelo menos várias vezes.
existem Algumas advertências para o protocolo de isolamento descritas aqui. A principal limitação é que o processo usado para isolar essas células podem inadvertidamente alterar o seu fenótipo. DCs são extremamente sensíveis à contaminação de endotoxinas e estímulos mecânicos que podem levar a mudanças no seu fenótipo e função. Outra limitação desta técnica é a dependência sobre a secreção de Flt-3L para expandir subconjuntos de DC. Isto resulta na falta de expansão do tecido residente subconjuntos de DC que não expressam o receptor Flt-3.
oprotocolo descrito aqui baseia-se no enriquecimento de células, utilizando reagentes disponíveis comercialmente. O kit de purificação para o isolamento de células é fornecido com um protocolo que contém os volumes recomendadas de reagentes a serem utilizados. A composição de células de tumor de ratos portadores é dramaticamente diferente da dos ratos ingénuos (Figura 2C), e, portanto, ter modificado as quantidades de reagentes usados na nossa técnica, a fim de atingir pureza celular óptimo. As DCs são células aderentes e pode anexar a matriz de coluna não especificamente. A equilibração do leito da coluna com tampão contendo EDTA minimiza a adesão celular, e a utilização de passagens em série ao longo de duas colunas consecutivas aumenta ainda mais a pureza da célula.
DC são células altamente aderentes e in vivo são geralmente estreitamente associado com a matriz extracelular de tecidos. A fim de aumentar o rendimento, é muito importante para digerir o tecido esplénico com colagenase e ADNase para tim suficientee extrair um número máximo destas células. Também é importante ter certeza de que os fragmentos de tecido esplênico são completamente submerso na solução de colagenase / DNase I ao se submeter a digestão. Outra característica crítica é de isolamento DC para manter a esterilidade estrita e condições livres de endotoxinas durante o procedimento de isolamento, uma vez que estas células são altamente responsivo endotoxina. Use reagentes recém-preparados a partir de stocks livres de endotoxinas e filtro de esterilizar todos os reagentes antes de usar. Todos os buffers de isolamento de células e meios de comunicação deve ser complementado com FCS que é certificada como livre de endotoxina detectável. Estas células são também altamente sensíveis a estímulos mecânicos e a estimulação mecânica repetida pode alterar o estado de maturação destas células. Embora alguma força mecânica é necessária para forçar o tecido através de um filtro de células após a digestão de colagenase, isso deve ser feito o mais suavemente possível. Além disso, pipetagem vigorosa das células deve ser evitado tanto quanto pose, e largura do furo de pipeta pontas devem ser usados para minimizar as forças de cisalhamento.
O modelo de transferência adoptiva é útil para investigação de apresentação de antígenos e priming células T por subconjuntos específicos de DCs. No entanto, demonstrou-se em outros estudos que a transferência do antigénio pode ocorrer a partir de antigénios pulsados DC para DC endógenos. Assim, a resposta imune adaptativa instigada por células antígeno pulsada pode refletir apresentação de DCs endógenas apresentando o antígeno "capturado" e não a do APC transferido. Esse tipo de transferência é aumentado exponencialmente se as preparações DC isoladas contêm células mortas ou a morrer. Por conseguinte, é importante levar a cabo o isolamento e a transferência protocolo CC tão rapidamente quanto possível, utilizando condições estéreis com tampões pré-arrefecida para aumentar a sobrevivência celular. Nós escolhemos um período antigénio pulsante relativamente curto de 4 horas, por essa razão, com incubação em placas de cultura de células de ligação baixa para minimizar a aderência celular duranteeste passo. Além disso, a condição de cultura prolongado pode alterar o estado de maturação de DC cultivadas, e pode influenciar o resultado de experiências de transferência adoptivos 22.
Em resumo, a biologia das células dendríticas é uma área muito ativa de pesquisa e desenvolvimento de um método confiável para gerar DCs que reflectem fielmente a sua fenotípica in vivo e divergência funcional proporciona uma imensa oportunidade de estudar estas células. Isto torna-se especialmente importante para os estudos envolvendo produtos químicos que podem modular funções DC, mas não podem ser administrados por via sistémica em modelos animais. Tratar os isolados subconjuntos de DC de interesse ex vivo com esses produtos químicos é uma abordagem prática e viável que pode ajudar a elucidar os detalhes mecanicistas de vias de apresentação de antígenos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIAID AI45889 subvenção para SAP citometria de fluxo estudos foram realizados utilizando as instalações nucleares FACS apoiados pelo Cancer Center Einstein (NIH / NCI CA013330) e Center for AIDS Research (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
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