Abstract
Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno profesionales principalmente responsable de la adquisición, procesamiento y presentación de antígenos en moléculas presentadoras de antígenos para iniciar la inmunidad mediada por células T. Las células dendríticas se pueden separar en varios subconjuntos fenotípicamente y funcionalmente heterogéneos. Tres importantes subconjuntos de células dendríticas esplénicas son plasmocitoide, células CD8a POS y CD8a Neg. Las DCs plasmacitoides son productores naturales de interferón de tipo I y son importantes para la inmunidad de células T anti-viral. El subconjunto CD8a Neg DC está especializada para MHC de clase II presentación de antígenos y está implicado en el centro de cebado de células T CD4. El CD8a Pos países en desarrollo son los principales responsables de la presentación cruzada de antígenos exógenos y sensibilización de las células T CD8. Los CD8a Pos DC han demostrado ser más eficaz en la presentación de antígenos glicolípidos por moléculas CD1d a un cel T especializadal población conocidas como células T asesinas naturales invariantes (iNKT). La administración de Flt-3 ligando aumenta la frecuencia de la migración de progenitores de células dendríticas de la médula ósea, lo que se traduce en la expansión de las células dendríticas en los órganos linfoides periféricos en modelos murinos. Hemos adaptado este modelo para purificar grandes cantidades de células dendríticas funcionales para su uso en experimentos de transferencia de células para comparar dominio in vivo de diferentes subconjuntos de DC.
Introduction
Las células dendríticas (DC) fueron descubiertos hace casi cuarenta años como el "gran estrelladas (griego dendron) celular" que se encuentra en los órganos linfoides 1. Muchos estudios han demostrado que los países en desarrollo son las únicas células que presentan antígenos que pueden estimular eficazmente las células T ingenuas 2. Una función importante de estas células es la captación y presentación de antígenos y su procesamiento eficaz y la carga de éstos a las moléculas presentadoras de antígeno. En bazo de ratón, las DC se puede separar en plasmocitoide y subconjuntos convencionales. Las DCs plasmacitoides se caracterizan por una baja expresión de CD11c y altos niveles de B220 y Gr-1. Ellos también son positivas para el marcador de superficie mPDCA1 y secretan interferón de tipo I en respuesta al número 9 como ligandos del receptor (TLR9). Las CD convencionales son demasiado altos para CD11c y MHC clase II expresión. Ellos se pueden dividir en tres subconjuntos distintos basados en la expresión superficial de marcadores fenotípicos tales como CD4, CD8a, DEC205, CD11b y las células dendríticas del receptor inhibitorio 2 (DCIR2, reconocido por el anticuerpo 33D1) proteínas 3,4. Los CD8a Pos DC también se conocen como Cdc1, son positivas para DEC205, pero negativas para los marcadores mieloides tales como CD11b y 33D1. El CD8a Neg DC, también llamado cdc2, son positivos para 33D1, CD11b y CD4, pero carecen de DEC205. El subgrupo negativo doble (es decir, negativo para CD4 y CD8a) es relativamente poco frecuente, y es negativa para DEC205 y 33D1. Es el subconjunto menos caracterizado y puede ser una forma menos diferenciadas de CD8a Neg DC.
Las diferencias fenotípicas en los diferentes subconjuntos de DC se extienden también a sus funciones in vivo. El CD8a Neg los DC son altamente fagocítica y se cree que presentar el antígeno exógeno principalmente a través de MHC de clase II de células T CD4 3. Por el contrario, los países en desarrollo Pos CD8a son especializados para la presentación de antígeno de proteína soluble en MHC de clase Ien un mecanismo denominado presentación cruzada. El resultado de la presentación cruzada depende del estado de activación de estas DCs 5, y puede o bien conducir a la expansión de las células T citotóxicas (CTL) o el desarrollo de células T reguladoras 6 2,7. Focalización del antígeno a CD8a Pos DC usando resultados de la entrega mediada por anti-DEC205-anticuerpo en gran medida en la eliminación de las células T 8, mientras que la presentación de antígenos derivados de células apoptóticas infectadas induce una fuerte respuesta CTL 9.
Además del reconocimiento de antígenos peptídicos, el sistema inmune de los mamíferos ha evolucionado para reconocer los antígenos de lípidos y glicolípidos. Estos antígenos son presentados por moléculas CD1, que son proteínas de la superficie celular-I como de clase MHC que existen en múltiples formas relacionadas en diversos mamíferos. En ratones, un solo tipo de molécula de CD1 altamente conservada llamada CD1d es responsable de la presentación de antígenos glicolípidos 10. El mayor población de células T que reconocen complejos CD1d / glicolípidos se llama células NKT invariantes (células iNKT). Estas células expresan un receptor de células T semi-invariante (TCR) compuesto por una cadena invariante TCRα que se empareja con cadenas TCR que han diversidad 11 limitados. A diferencia de las células T convencionales que necesitan para proliferar y diferenciarse para convertirse en células T efectoras activadas, existen células iNKT como una población efectora y comenzar a responder rápidamente después de la administración glicolípido 12. Identificación de células presentadoras de antígeno de lípidos fisiológicamente relevante es un área activa de investigación, y se han sugerido varios tipos de células diferenciadas, tales como las células B, los macrófagos y las CD para realizar esta función. Sin embargo, se demostró que el subconjunto CD8a Pos de las DC es la célula primaria que media la captación y presentación de antígenos a las células de lípidos iNKT ratón 13 y glicolípido mediada cebado cruzado de células T CD8 14.
ove_content "> Para comparar la eficiencia de la presentación de antígenos por diferentes células presentadoras de antígenos, un enfoque directo es la transferencia de los diferentes tipos de APCs purificadas pulsadas con cantidades equivalentes de antígeno en huéspedes tratados previamente. experimentos de transferencia de células de este tipo se realiza a menudo para estudios inmunológicos. Sin embargo, la realización de estudios de transferencia con las DC tratadas ex antígeno in vivo es un reto, ya que estas células existen poblaciones tan raros en los órganos linfoides en las que constituyen menos del 2% del total de células 15. por tanto, es necesario mejorar el desarrollo de estas células en los animales donantes para aumentar la eficacia de los protocolos de aislamiento.Se sabe que la linfoide común y progenitores mieloides comunes, que son necesarios para la generación de pDC, CD8 Pos y subconjuntos CD8 Neg DC, expresa fms relacionadas receptor tirosina quinasa 3 (Flt-3). A in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) administración, emigration de Flt-3 que expresan las células progenitoras de la médula ósea se incrementa, lo que resulta en el aumento de la siembra de los órganos linfoides periféricos y la expansión de su progenie madura DC 16. La expresión de Flt-3 se pierde durante el compromiso con el B, T o NK vías de diferenciación celular. Por lo tanto, sólo alteraciones mínimas se observan en estas células tras la administración Flt-3L. Expansión similares en las poblaciones de DC se observa en ratones con tumores generados por la implantación de una línea celular B16-melanoma secretoras de murino Flt-3L, que proporciona un método sencillo y económico para proporcionar niveles sistémicos sostenidos de Flt-3L 17,18. Usando este enfoque, hemos desarrollado un protocolo basado en la implantación de células B16 melanoma secretoras de Flt-3L para estimular la expansión de todos los subconjuntos normales de corriente continua en el bazo del ratón, lo que aumenta en gran medida los rendimientos de estas células que se pueden aislar para experimentos posteriores . constantemente nos encontramos con que dentro de 10 - 14 días después de im subcutáneaplantación del tumor secretor de Flt-3, los ratones desarrollan esplenomegalia marcada con el enriquecimiento de las DC para constituir 40 - 60% del total de células de bazo. A partir de estos bazos, diferentes subconjuntos de DC se pueden aislar con alta pureza usando el estándar kits de purificación de células disponibles en el mercado que emplean marcadores fenotípicos-subconjunto específico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices aprobadas por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el uso (IACUC). Todos los procedimientos que requieren la esterilidad se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad.
1. Implantación de B16.Flt3L melanoma en ratones
- Cultura la expresión de línea de Flt-3 B16 melanoma celular en T25 matraces de cultivo tisular a una densidad de 0,5 x 10 6 células / ml en medio completo DMEM con 10% de CO2 a 37 ° C. Creciendo hasta que las células alcanzan ~ 90% de confluencia (~ 20 h).
- Recoger las células por digestión con tripsina. Aspirar los medios de cultivo celular y se lavan las células adherentes con PBS. Añadir 5 ml de tripsina al 0,05% y se incuba durante 5 min a 37 ° C. Añadir 20 ml fríos medio completo DMEM (4 ° C) que contiene suero de ternera fetal (FCS) para extinguir la digestión con proteasas. Levantar las células fuera golpeando ligeramente seguido pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Recoger las células por centrifugación a 300xg durante 10 min a 4 ° C. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de la viabilidad celular automatizado. Resuspender a una densidad de 10 8 células / ml en PBS.
- Ratones implante (C57BL / 6 o de otra cepa histocompatible) con células tumorales mediante inyección subcutánea como se describe por Machholz et al. 19 en la base del cuello con 100 l de suspensión de células (10 7 células).
- Deje que el tumor crezca hasta palpables o visibles (2 - 10 mm de diámetro, generalmente 7 - 12 días) antes de sacrificar animales para la extracción de órganos.
2. Preparación de esplénica suspensión de células individuales a partir de ratones portadores de tumor
- Anestesiar a los ratones con una sobredosis de isoflurano (ajuste la velocidad de flujo de isoflurano a> 5% y continuar la exposición al menos 2 minutos después de dejar de respirar). Sacrificar el ratón portador de un tumor de melanoma Flt-3 por dislocación cervical según las directrices institucionales para la eutanasia.
- disinfect la piel con 70% de etanol y el bazo cosecha utilizando una técnica aséptica con la ayuda de unas tijeras estériles 20.
- Coloque el bazo en una placa de Petri estéril para su transporte a la cabina de bioseguridad. Realizar todos los pasos de aquí en adelante en condiciones estériles.
- Transferencia de bazo a un plato fresco Petri y se lava con medio RPMI. Cortar el bazo en trozos pequeños (~ 0,2 cm 2) utilizando un bisturí. Incubar durante 30 min a 37 ° C con 10 ml de solución de colagenasa / DNasa.
- Se vierte la suspensión parcialmente digerido de tejido esplénico en un filtro de células de 70 micras. Comprimir los fragmentos de tejido restante a través de la malla del filtro utilizando un émbolo de la jeringa 5 ml.
- Lavar el filtro de malla con 10 ml de medio fresco y deseche el filtro. Centrifugar la suspensión a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar las células.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de lisis RBC. Se incuba a RT fo 10 min. Se detiene el tampón de lisis RBC mediante la adición de 10 ml de medio completo RPMI.
- Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender en volumen apropiado para alcanzar la densidad celular de 10 8 células / ml en tampón de clasificación de células (por ejemplo, MACS) que contiene 20 mg / ml de anticuerpo Fc-bloque (2.4G2).
3. Purificación de plasmocitoide DC, DC y CD8a Pos Neg CD8a países en desarrollo de esplénica suspensión de células individuales
Nota: El aislamiento de los subconjuntos de DC esplénicos de suspensión de células individuales es un procedimiento de múltiples etapas como se ilustra en la Figura 1 Realizar todos los pasos usando tampón de pre-enfriado y un baño de agua con hielo para mantener la temperatura a 4-8 ° C.. Todos los volúmenes de reactivos en el siguiente apartado del protocolo se calculan para una entrada inicial de 200 l de suspensión de células del bazo a los 10 8 células / ml). Esto se puede escalar hacia arriba o haciaabajo función de sus necesidades, cambiando el volumen de suspensión celular (siempre a una densidad de 1 x 10 8 células / ml) y otros reactivos proporcionalmente en la etapa inicial (3.1.1 y 3.2.1). Ajustar los volúmenes de reactivo en todos los pasos posteriores en consecuencia. Por ejemplo, si a partir de 100 l de suspensión de células del bazo en 1 x 10 8 / ml, utilizar la mitad de los volúmenes de reactivos indicadas en todos los pasos.
- El aislamiento de los DC plasmocitoide (PDC)
- Añadir 300 l de cóctel de anticuerpo marcado con biotina en el kit plasmocitoide aislamiento de CC a 200 l de suspensión celular esplénica.
- Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. Toque en el tubo de cada 3 minutos para mantener las células en suspensión, y para maximizar la unión de los anticuerpos.
- Añadir 12 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante para eliminar los anticuerpos no unidos con biotina.
- Resuspender la célulaprecipitado en 500 l de tampón de clasificación de células. Añadir 300 l de perlas de anticuerpo conjugado con anti-biotina. Repita el paso 3.1.2 y 3.1.3.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de clasificación de células. Realizar todos los pasos de este punto en adelante a temperatura ambiente utilizando tampones pre-enfriado.
- Coloque una célula activada magnética fresca de clasificación de columna LS en el soporte magnético. Lavar y equilibrar la columna con 5 ml de tampón de clasificación de células.
- Pipetear la suspensión celular en la columna, aplicando suavemente para el centro de la superficie del lecho de la columna. Recoger el flujo a través.
- Lavar la columna con 10 ml de tampón de clasificación de células. Recoger este flujo a través y se combinan con el flujo a través del paso 3.1.7. Los PDC se enriquecen en este flujo a través de la columna (FT1).
- Sedimentar las células de FT1 por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, se resuspenden en 2 ml de tampón de clasificación celular y pasar las células a través de una columna LS frescorepitiendo los pasos 3.1.6 - 3.1.8. Este uso de dos columnas secuenciales produce una mayor pureza de las células aisladas.
- Precipitar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, y resuspender con 2 ml RPMI completo. Colocar en hielo hasta que se necesite.
- Aislamiento de CD8a Pos Neg CD8a y los países en desarrollo
Nota: El primer paso en este procedimiento es el agotamiento de las células B, PDC, T y NK.- A partir de toda la suspensión de células de bazo (1 ml de 10 8 células / ml obtenidos en la etapa 2.8), añadir 100 l de cóctel de anticuerpo conjugado con biotina proporcionado en el kit de aislamiento de CD8a Pos DC.
- Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos. Toque en el tubo suavemente cada 3 minutos para maximizar la unión de los anticuerpos marcados con biotina a sus células diana.
- Añadir 12 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar súpersobrenadante para eliminar los anticuerpos no unidos con biotina.
- Añadir 150 l de tampón de clasificación celular y 100 l de perlas de anti-biotina proporcionados en el kit de aislamiento de CD8a Pos DC. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos.
- Añadir 10 ml de células de tampón de clasificación y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender las células en tampón de clasificación 1 ml de células y pasar por encima de una columna LS fresca acuerdo con el procedimiento en los pasos 3.1.6 a través de 3.1.8.
- Recoger el flujo sin etiqueta a 2 (FT2) y desechar el material retenido columna. Esta fracción se enriquece sin etiqueta para CD8a Pos Neg CD8a y los países en desarrollo.
- Sedimentar las células en FT2 por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender las células en tampón de clasificación celular 1 ml y añadir 200 l de perlas magnéticas conjugadas-CD8a contra proporcionados en el kit de aislamiento de CD8a Pos DC.
- Repscomer pasos 3.2.2 a través de 3.2.6. El flujo a través de la columna se enriquece para CD8a Neg DC y agota para CD8a Pos países en desarrollo. Esto se denomina flujo a través de 3 (T3L).
- Para eluir el CD8a Pos DCs retenido en la columna, eliminar la columna del imán, añadir 5 ml de tampón de clasificación celular y purgar la matriz de la columna usando el émbolo suministrado con la columna de LS.
- Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender en tampón de clasificación de 1 ml de células. Para aumentar la pureza, ejecute las células eluidas de nuevo a través de una columna LS fresco repitiendo los pasos 3.1.6 a 3.1.8, excepto desechar el flujo a través y recoger células retenidas como en 3.2.11.
- Para purificar el CD8a Neg DCs de la suspensión PIE3S, sedimentar los PIE3S por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender en 300 l de tampón de clasificación de células.
- Añadir 100 l de mag anti-CD11cperlas néticas. Mezclar bien e incubar en hielo baño de agua durante 15 minutos.
- Añadir ordenar celdas tampón y de pellets de 10 ml de células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Repita los pasos 3.1.5 a través de 3.1.8. El CD8a Neg DCs se seleccionan positivamente con perlas de CD11c y se unió a la columna. El flujo a través se puede descartar.
- La elución de las células retenidas en la columna como se describe en el paso 3.2.11 para recoger el purificada CD8a Neg DC.
4. pulsante APC con antígenos y de transferencia de células
- Contar las células vivas después de la purificación mediante exclusión con azul de tripano 21 para distinguir las células vivas y muertas.
- Se incuban las células con el antígeno de elección. Utilizar análogos de antígeno glicolípido ceramida llamada alfa-galactosil (αGalCer) a una concentración de 100 nM 13. Típicamente, la placa 10 6 células viables / pocillo en medio RPMI completo el uso de ultra bajo attachment de fondo en U de 96 pocillos para minimizar la unión celular. Se incuban las células en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 ° C por 1 - 4 horas.
- Las células de la cosecha con la pipeta suavemente varias veces. Utilice puntas de pipeta diámetro ancho para minimizar el daño celular de las fuerzas de corte. Lavar los pocillos con PBS y agrupar estos lavados para maximizar la obtención de células.
- Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender a la densidad deseada en PBS. Por lo general, se inyecta 1 millón de células en 200 l por animal receptor. Mantener las células en hielo para maximizar la viabilidad antes de la administración en animales huésped.
- Inyectar células vía intravenosa en ratones, ya sea a través del vano lateral de la cola o del plexo venoso retroorbital 19. Use una aguja 27 G en una jeringa de 1 ml, y se inyecta un volumen máximo de 0,1 ml por ratón.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El resultado de este procedimiento se basa en la expansión de los subgrupos de CD por murino Flt-3L expresado por las células de melanoma implantados. El tumor B16.Flt3L se derivó de un 6 mouse / C57BL, y debe ser implantado en animales con que cepa de antecedentes con el fin de evitar el fallo del tumor a establecerse debido al rechazo. En algunos casos, puede ser deseable usar ratones modificados genéticamente para derivar DCs con defectos conocidos en vías o receptores de interés de señalización. Es importante tener en cuenta que el tumor puede desarrollarse con diferentes cinéticas en estos animales, por lo que es importante controlar el crecimiento del tumor basada en la apariencia y la palpación en el sitio de la inoculación. En nuestra experiencia, una vez que el tumor es palpable, el tumor B16.Flt3L ratones portadores muestran consistentemente un marcado incremento en la celularidad esplénica que se correlaciona con la expansión de todos los subconjuntos de CC (Figura 2A). Normalmente vemos un Increas de 2 a 3 vecese en el número de esplenocitos totales obtenidos de ratones de melanoma que llevan B16.Flt3L comparación con los animales no tratados previamente. El aumento en el número de DC, en parte, contribuye a la aparente reducción en la frecuencia de las células B, mientras que hay muy poco o ningún cambio en el número absoluto de células B. Curiosamente, mientras que una gran expansión (~ 15 a aumento de 20 veces en el número absoluto) se observa para las CD convencionales en estos ratones, no es sólo un aumento modesto (aproximadamente 4 veces) observado en el subconjunto DC plasmacitoide.
La estrategia gating para identificar diferentes subconjuntos de DC se muestra en la Figura 2A y se basa en la expresión de B220, CD11b, CD11c y CD8a como marcadores fenotípicos-subconjunto específico (Figura 2B). También se investigó DEC205, CD11b y expresión mPDCA1 en estos subconjuntos como se muestra en la Figura 2B. Esto muestra el patrón esperado, con mPDCA sólo en el subconjunto PDC, mientras que diciembre 205 se expresa altamente en CD8a Pos DC y CD11b se detecta más prominente en los países en desarrollo CD8a Neg. También se analizaron las alteraciones en las frecuencias de células para cada uno de los subconjuntos purificados en cada paso del protocolo descrito aquí (que se resumen en la Figura 2C, con ejemplos detallados de los datos de citometría de flujo de la Figura 3). El aislamiento de los subconjuntos de DC esplénicas descritos en este método es un procedimiento multi-etapa (Figura 1). La purificación de las DC plasmacitoides se basa en la selección negativa para enriquecer estas células después de la depleción de todas las poblaciones no deseados como B, T, células NK y las CD convencionales. La purificación del CD8a Pos DCs, y CD8a Neg DCs se realiza mediante la selección positiva de estas células después de la depleción de las células T, B y NK. La alta pureza de cada uno de los subconjuntos de DC obtenido usando este procedimiento (típicamente ~ 95%) también se ilustra en la Figura 3.
ve_content. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Dependiendo de los experimentos a realizar, estas células pueden ser pulsadas con un antígeno deseado y se transfieren a hosts murinos histocompatibles para estudios inmunológicos Además, estas células pueden también ser utilizados para estudios in vivo de las actividades estimuladoras o reglamentarias de DC subconjuntos fisiológicas. los rendimientos celulares de los subgrupos de CD purificados por 2 x 10 7 esplenocitos totales son aproximadamente un millón de PDC, 2 millones CD8a Pos DC y 4 millones CD8a Neg DC.
Figura 1. Aislamiento de los países en desarrollo. Un esquema que muestra las diferentes etapas del protocolo para el aislamiento de los diferentes subgrupos de CD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. >
Figura 2. Análisis de subgrupos de CD bazo en ratones con tumores B16.Flt3L. A) se ilustra la estrategia de apertura de puerta para identificar las poblaciones de células correspondientes a PDC (R1), CD8a Pos DC (R5) y CD8a Neg DC (R6). B) Expresión de mPDCA1, 33D1, DEC205 y CD11b en diferentes subconjuntos. Las células contenidas en la puerta R4 (un subconjunto de linfocitos, negativo para el B220, CD11c, CD11b) se utilizan como una población de control que carecen de la expresión de estos marcadores c) enriquecimiento relativo de DC y subgrupos de linfocitos aislados de los bazos de ratones a día. 14 después de la inoculación de células de melanoma B16.Flt3L se muestra en el gráfico de la izquierda como barras negras, mientras que la frecuencia de estas poblaciones de células en ratones ingenuos se muestra como barras blancas. La trama de la derecha muestra los mismos datos que el número de células.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de subgrupos de CD esplénicos Durante Protocolo de enriquecimiento. A) El enriquecimiento de las CD plasmacitoides (B220 altos y bajos CD11c, R1) de 10% en la población a partir de esplenocitos de ratones portadores de tumores B16.Flt3L a ~ 95% de pureza en la columna de fluir a través de material retenido 1. Observe que las células eluidas de esta columna se agotan de esta población. B) el enriquecimiento de las CD convencionales (en CD11c alta, mezcla de CD8a positivo y negativo) de ~ 33% en el bazo de B16.Flt3L melanoma portadores de ratones en el día 10 después de la implantación del tumor a ~ 78% en el flujo a través de 2 fracción. En la columna de material retenido 2 parcelas, las poblaciones positivas CD11c parecen ser partialiado empobrecido, que corresponde a la eliminación de un número sustancial de los países en desarrollo durante la selección negativa para agotar las células T, B y NK. El fraccionamiento adicional de la corriente a través de 2 suspensión usando selección positiva para los rendimientos de unión anti-CD8> 95% de pureza de CD8a Pos DCs. El flujo a través de esta continuación, se sometió a una selección positiva para la unión de anticuerpos anti-CD11c, produciendo una población de> 95% de pureza CD8a Neg DC. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
se aceptan las células dendríticas que es el principal antígeno profesional que presenta células que participan en el cebado de respuestas de células T. Su función principal es la de inspeccionar el microambiente del tejido mediante la adopción y el procesamiento de antígenos para la presentación a las células T. Con el fin de estudiar la función de subconjuntos específicos de DC, estos necesitan ser aislados en cantidades suficientes utilizando un enfoque que mantiene su fenotipo y las funciones normales. La mayoría de los protocolos se basan en el aislamiento de subconjunto específico DC de ratones no tratados previamente. Puesto que estas células son poco frecuentes, los procedimientos de aislamiento no son eficientes y producen poca cantidad de células. Por ejemplo, un bazo producirá solamente cerca de 0,5-1000000 DCs CD8 de punto de venta, mientras que la mayoría de los experimentos llevados a cabo con estudios de transferencia utilizan al menos este número de células por animal. Por lo tanto, una limitación importante de los métodos existentes es la incapacidad de aislar el número de células suficientes sin necesidad de utilizar un gran número de ratones donantes y volúmenes sustancialesde los reactivos. Nuestro método supera sustancialmente estos problemas mediante el uso de ratones implantados con un tumor secretor de Flt-3L para ampliar en gran medida las DCs, lo que permite la purificación de un número mucho mayor del subconjunto DC tres bien reconocido utilizando una serie de etapas de purificación inmunomagnéticas. El protocolo descrito aquí, por tanto, proporciona una mejora importante sobre los métodos existentes en términos de rendimientos por lo menos varias veces.
Existen algunas advertencias para el protocolo de aislamiento descritas aquí. La principal limitación es que el procedimiento usado para el aislamiento de estas células puede alterar inadvertidamente su fenotipo. Los países en desarrollo son muy sensibles a la contaminación por endotoxinas y estímulos mecánicos que pueden dar lugar a cambios en su fenotipo y la función. Otra limitación de esta técnica es la dependencia de la secreción de Flt-3L para expandir subgrupos de CD. Esto da lugar a la falta de expansión de residentes tejido DC subconjuntos que no expresan el receptor Flt-3.
losprotocolo descrito aquí se basa en el enriquecimiento de células usando reactivos disponibles en el mercado. El kit para el aislamiento de la purificación celular viene con un protocolo que contiene los volúmenes recomendadas de reactivos para ser utilizado. La composición de las células de los ratones portadores de tumores es dramáticamente diferente de la de los ratones no tratados (Figura 2C), y por lo tanto han modificado las cantidades de reactivos utilizados en nuestra técnica con el fin de alcanzar la pureza óptima de la célula. Las CD son células adherentes y pueden adjuntar a la matriz de la columna de forma no específica. Equilibrado del lecho de la columna con tampón que contenía EDTA minimiza adherencia de las células, y el uso de paso en serie de más de dos columnas consecutivas mejora la pureza de células más allá.
DC son células altamente adherentes y in vivo son generalmente estrechamente asociado con la matriz de tejido extracelular. Con el fin de aumentar el rendimiento, es muy importante para digerir el tejido esplénico con colagenasa y ADNasa por suficiente time para extraer un número máximo de estas células. También es importante asegurarse de que los fragmentos de tejido esplénico se sumergen completamente en la solución de colagenasa / DNasa I mientras se somete a la digestión. Otra característica crítica de aislamiento DC es mantener estricta esterilidad y condiciones libres de endotoxinas durante el procedimiento de aislamiento, ya que estas células son muy sensibles endotoxina. Utilizar reactivos recién preparados a partir de las reservas libres de endotoxinas y esterilizar por filtración todos los reactivos antes de su uso. Todos los tampones de aislamiento de células y medios de comunicación deben ser complementados con FCS que está certificado para estar libre de endotoxina detectable. Estas células son también muy sensibles a los estímulos mecánicos y repetida estimulación mecánica puede alterar el estado de maduración de estas células. Aunque se necesita un poco de fuerza mecánica para forzar el tejido a través de un filtro de células después de la digestión con colagenasa, esto debe hacerse lo más suavemente posible. Además, el pipeteo vigoroso de las células se debe evitar tanto como sea posible, y pipeta de calibre ancho consejos deben utilizarse para reducir al mínimo las fuerzas de corte.
El modelo de transferencia adoptiva es útil para la investigación de la presentación de antígenos y la sensibilización de las células T mediante subconjuntos específicos de los países en desarrollo. Sin embargo, se ha demostrado en otros estudios que la transferencia de antígeno puede ocurrir a partir de DCs pulsadas antígeno a los DC endógenos. Por lo tanto, la respuesta inmune adaptativa instigada por células presentadoras de antígeno pulsadas puede reflejar la presentación por países en desarrollo endógenas que presentan el antígeno "capturado" y no la de APC transferido. Este tipo de transferencia se incrementa exponencialmente si las preparaciones aisladas de CC contienen células muertas o moribundas. Por tanto, es importante llevar a cabo el aislamiento y transferencia de protocolo DC tan rápidamente como sea posible, utilizando condiciones estériles con buffers pre-enfriado para mejorar la supervivencia celular. Elegimos un período relativamente corto de pulsación antígeno de 4 hr por esta razón, con la incubación en placas de cultivo celular de unión baja para minimizar la unión de las células duranteEste paso. Además, condiciones de cultivo extendida puede alterar el estado de maduración de las DC cultivadas, y puede influir en el resultado de los experimentos de transferencia adoptiva 22.
En resumen, la biología de células dendríticas es un área muy activa de investigación, y el desarrollo de un método fiable para generar los DC que reflejan fielmente sus características fenotípicas in vivo y divergencia funcional, y ofrece una gran oportunidad para estudiar estas células. Esto es especialmente importante para los estudios relacionados con productos químicos que pueden modular las funciones de CC, pero no pueden ser administrados por vía sistémica en modelos animales. El tratamiento de los aislados DC subconjuntos de interés ex vivo con estos productos químicos es un enfoque práctico y factible que puede ayudar a aclarar los detalles de la mecánica de las vías de presentación de antígeno.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIAID AI45889 subvención a SAP de citometría de flujo estudios se llevaron a cabo utilizando las instalaciones centrales de FACS apoyados por el Centro de Cáncer de Einstein (NIH / NCI CA013330) y el Centro para la Investigación del SIDA (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
