Abstract
樹状細胞（DC）は、取得処理と、T細胞媒介性免疫を開始するための分子を抗原提示細胞に抗原を提示するために主に関与プロフェッショナル抗原提示細胞です。樹状細胞は、いくつかの表現型および機能的異種のサブセットに分離することができます。脾臓樹状細胞の三つの重要なサブセットは、CD8αPOSおよびCD8αNegの細胞形質です。形質のDCは、型の天然の生産Iインターフェロンと抗ウイルスT細胞免疫のために重要です。 CD8αNegの DCサブセットは、MHCクラスII抗原提示に特化されており、中央にCD4 T細胞のプライミングに関与しています。 CD8α 順位 DCは、外因性抗原とCD8 T細胞プライミングの交差提示を主に担います。 CD8α 順位 DCは、特殊なTセルへのCD1d分子による糖脂質抗原の提示で最も効率的であることが実証されています不変ナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞として知られているリットル人口。 FLT-3リガンドの投与は、最終的にマウスモデルにおける末梢リンパ器官における樹状細胞の増殖を生じる、骨髄由来の樹状細胞前駆体の遊走の頻度を増加させます。我々は、異なるDCサブセットのインビボでの能力を比較するため、細胞移入実験において使用するための機能的樹状細胞を大量に精製するために、このモデルを適応しています。
Introduction
「大きな星状（ギリシャデンドロン ）細胞」は、リンパ系器官1に見られるような樹状細胞（DC）は、ほぼ40年前に発見されました。多くの研究は、DCが効果的にナイーブT細胞2を刺激することができる唯一の抗原提示細胞であることを示しています。これらの細胞の主要な機能は、抗原提示分子への取り込みおよび抗原の提示とその効率的な処理およびこれらのロードをです。マウスの脾臓において、DCは、形質従来のサブセットに分離することができます。形質DCはCD11cの低い発現とB220とのGr-1の高レベルによって特徴付けられます。彼らはまた、表面マーカーmPDCA1に対して陽性であると私は受容体9（TLR9）リガンドなどの通行料に応じて型インターフェロンを分泌します。従来のDCはCD11cのとMHCクラスII発現のために高いです。彼らはそのようなCD4、CD8α、DEC205、CDなどの表現型マーカーの表面発現に基づいて、三つの異なるサブセットに分割することができます11b及び（33D1抗体によって認識DCIR2、）樹状細胞阻害受容体2タンパク質3,4。 CD8α 順位のDCも、CDC1として知られているDEC205に陽性であるが、このようなCD11bおよび33D1などの骨髄性マーカーについて陰性です。また、CDC2呼ばCD8αNegの DCは、33D1、CD11bおよびCD4陽性であるが、DEC205を欠いています。ダブルネガティブサブセット（CD4およびCD8αの両方のための、すなわち 、負）は、比較的まれで、DEC205および33D1のために負です。これは、少なくとも特徴づけられたサブセットであり、CD8αNegの DCのあまり分化の形態であってもよいです。
様々なDCサブセットにおける表現型の違いはまた、in vivoでの機能を拡張します。 CD8αNegの DCは、高い食作用であり、主にCD4 T細胞3にMHCクラスIIを介して外因性抗原を提示すると考えられています。対照的に、CD8α 順位 DCは、MHCクラスIの可溶性タンパク質抗原の提示のために特化されメカニズムに交差提示と呼ばれます。交差提示の結果は、これらのDC 5の活性化状態に依存し、細胞傷害性T細胞（CTL）または制御性T細胞を6 2,7の開発の拡大につながることができます。感染アポトーシス細胞由来抗原の提示は、強力なCTL応答9を誘導するのに対し、主としてT細胞8の削 除に抗DEC205抗体媒介送達の結果を用いて、CD8α 順位 DCに抗原の標的。
ペプチド抗原の認識に加えて、哺乳動物の免疫系は、脂質と糖脂質抗原を認識するように進化してきました。これらの抗原は、種々の哺乳動物における関連する複数の形で存在するMHCクラスI様細胞表面タンパク質であるCD1分子によって提示されます。マウスでは、CD1dのと呼ばれる高度に保存されたCD1分子の単一型は、糖脂質抗原10のプレゼンテーションを担当しています。メジャーな CD1d /脂質複合体を認識するT細胞の集団は、インバリアントNKT細胞（iNKT細胞）と呼ばれます。これらの細胞は、多様11が制限されているTCRβ鎖と対になっている不変のTCRα鎖からなる半不変T細胞受容体（TCR）を発現します。増殖し、活性化されたエフェクターT細胞になるように分化する必要があり、従来のT細胞とは異なり、iNKT細胞は、エフェクター集団として存在し、糖脂質、投与12後に迅速に対応を開始します。生理学的に関連する脂質抗原提示細胞の同定は、研究の活発な領域であり、例えば、B細胞、マクロファージ及び樹状細胞などのいくつかの異なる細胞型は、この機能を実行するために提案されています。しかし、DCのCD8α 順位サブセットマウスiNKT細胞13およびCD8 T細胞の14の糖脂質媒介性クロスプライミングの取り込みおよび脂質抗原の提示を媒介する主要な細胞であることが実証されました。
別抗原提示細胞による抗原提示の効率を比較するためにove_content ">、直接的なアプローチは、ナイーブな宿主に抗原の等量でパルス精製APCの異なる種類を転送することである。このタイプの細胞移入実験は、多くの場合、免疫学的研究のために行われます。これらの細胞は、それらが全細胞15の2％未満を構成しているリンパ器官のような稀な集団が存在しかし、 エクスビボ抗原処理されたDCと転写研究を行うことは、困難である。ドナー動物におけるこれらの細胞の発達を強化することが必要です分離プロトコルの効率を増加させます。それは、共通のpDC、CD8 POSおよびCD8 Negの DCサブセットの生成に必要とされるリンパ系および骨髄系共通前駆細胞、明示FMS関連受容体チロシンキナーゼ3（FLT-3）ことが知られています。 in vivoでのFlt-3リガンド（FLT-3L）投与、emigrat時に骨髄からのFlt-3を発現する前駆細胞のイオンは、末梢リンパ器官の増加播種およびそれらの成熟DCの子孫16の膨張を生じ、増加されます。 FLT-3の発現はB、TまたはNK細胞の分化経路へのコミットメントの間に失われます。したがって、最小限の変更は、FLT-3Lの投与の際に、これらの細胞で観察されます。 DC集団において同様の拡大はFLT-3L 17,18の持続的な全身レベルを提供するための簡単で経済的な方法を提供するマウスのFlt-3Lを、分泌B16メラノーマ細胞株の注入によって生成された腫瘍を有するマウスで観察されます。このアプローチを使用して、我々は大幅その後の実験のために単離することができ、これらの細胞の収量を増加させる、マウス脾臓中のすべての通常のDCサブセットの拡大を刺激するのFlt-3Lを分泌B16黒色腫細胞の移植に基づくプロトコルを開発しました。 14日間皮下イムを次の - 私たちは常に10内にいることを見つけます総脾臓細胞の60％ - FLT-3分泌腫瘍のプランテーションは、マウス40を構成するDCの著しい富化と脾腫発症します。これらの脾臓から、異なるDCサブセットは、サブセット特異的な表現型マーカーを用いる標準的な市販の細胞精製キットを用いて高純度で単離することができます。
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Protocol
動物実験は、制度的動物飼育と使用委員会（IACUC）から承認されたガイドラインに従って行われています。無菌性を必要とするすべての手順は、生物学的安全キャビネットの中で行われています。
マウスにおけるB16.Flt3L黒色腫の1移植
- 培養物を37℃で10％CO 2で、完全DMEM培地中0.5×10 6細胞/ mlの密度でT25組織培養フラスコ中でFLT-3を発現するB16黒色腫細胞株。細胞は〜90％コンフルエンス（〜20時間）に到達するまでに成長。
- トリプシン消化することによって細胞を採取します。吸引し、細胞培養培地およびPBSで付着細胞を洗浄します。 0.05％トリプシンの5 mlを加え、37℃で5分間インキュベートします。プロテアーゼ消化をクエンチ冷20 mlのを完全DMEM培地ウシ胎児血清（FCS）を含有する（4℃）を加えます。軽く優しく上下にピペッティングし、続いてタップすることで細胞を持ち上げ。
- 300での遠心分離により細胞を回収4℃で10分間XG。血球計数器または自動化された細胞生存率カウンターを用いて細胞を数えます。 PBS中の10 8細胞/ mlの密度に再懸濁します。
- 100μlの細胞懸濁液（10 7細胞）で首の基部にMachholz ら 19によって記載されるように、皮下注射により腫瘍細胞と移植したマウス（C57BL / 6または他の組織適合性株）。
- 臓器を採取するために動物を犠牲にする前に（12日 - - 直径10ミリメートル、通常7 2）腫瘍が触知可能または可視になるまで成長することを可能にします。
腫瘍を有するマウスからの脾臓単一細胞懸濁液の調製
- イソフルランの過剰摂取（> 5％のイソフルランの流量を調整し、停止を呼吸した後、露光、少なくとも2分を続ける）でマウスを麻酔。安楽死のための制度ガイドラインに従って、頚椎脱臼によりFLT-3黒色腫腫瘍を有するマウスを生け贄に捧げます。
- ディ滅菌はさみ20の助けを借りて、無菌技術を使用して、70％エタノールと収穫脾臓で皮膚sinfect。
- バイオセーフティキャビネットへの輸送のための滅菌ペトリ皿に脾臓を置きます。無菌条件下で、ここからすべての手順を実行します。
- 新鮮なペトリ皿に脾臓を移し、RPMI培地で洗浄します。メスを用いて、小さな（〜0.2センチメートル2）個に脾臓をカット。コラゲナーゼ/ DNase溶液10mlで37℃にて30分間インキュベートします。
- 70μmのセルストレーナーに脾臓組織の部分的に消化されたサスペンションを注ぎます。 5ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、ストレーナのメッシュを通して残りの組織片を圧縮します。
- 新鮮な培地10mlのメッシュフィルターを洗浄し、フィルターを廃棄します。細胞をペレット化するために4℃で10分間300×gで懸濁液を遠心。
- 上清を吸引し、RBC溶解緩衝液2ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 RT fでインキュベートまたは10分。完全RPMI培地10mlを加えることによってRBC溶解緩衝液をクエンチしました。
- 4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。適切な体積の再懸濁は、Fcブロック抗体（2.4G2）20μg/ mlを含む細胞選別緩衝液（ 例えば、MACS）に10 8細胞/ mlの細胞密度を達成します。
脾臓単一細胞懸濁液からの形質のDC、CD8α 順位 DCおよびCD8αNegの DCの3精製
注： 図1に示すように単一細胞懸濁液からの脾臓DCサブセットの単離は、多段階の手順ですべての予め冷却した緩衝液を用いてステップ4の温度を維持するために氷水浴実行- 8°Cを。プロトコルの次のセクション内のすべての試薬 容量）が10 8細胞/ mlで脾臓細胞懸濁液200μlの初期入力するために計算されます。これは、スケールアップすることができますかダウン最初のステップ（3.1.1及び3.2.1）に比例して細胞懸濁液の体積（常に1×10 8細胞/ mlの濃度で）および他の試薬 を変更することにより、ニーズに基づきます。それに応じて、すべての後のステップで試薬容量を調整します。 1×10 8 / mlの脾臓細胞懸濁液の100μlで始まる場合、たとえば、すべてのステップで半分に述べた試薬容量を使用します。
- 形質DCの単離（PDC）
- 脾臓細胞懸濁液の200μlに形質DCアイソレーションキットで提供ビオチン標識抗体カクテルを300μlを追加します。
- 十分に混合し、15分間、氷水浴中でインキュベートします。浮遊細胞を維持するために、および抗体結合を最大化するためにチューブを3分毎にをタップします。
- バッファを選別12 mlのCellを加え、4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。未結合ビオチン化抗体を除去するために上清を吸引。
- 細胞を再懸濁し細胞選別緩衝液500μlにペレット。抗ビオチン抗体結合ビーズを300μlを追加します。繰り返しステップ3.1.2と3.1.3。
- 上清を捨て、細胞選別の緩衝液2ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁します。 RTで予備冷却されたバッファを使用して、この時点から、すべての手順を実行します。
- 磁気スタンドにLSカラムをソートする新鮮な磁気活性化細胞を置きます。バッファを細胞選別5mlでカラムを洗浄し、平衡化します。
- カラムベッドの表面の中央に静かにそれを適用し、カラムに細胞懸濁液をピペットで。フロースルーを収集します。
- セルソーティング緩衝液10mlでカラムを洗浄します。この流れを収集し、ステップ3.1.7からのフロースルーと結合。 pDCには（FT1）を介して、このカラム流量に富んでいます。
- 4°C、2ミリリットルのセルソーティングバッファで再懸濁で5分間、300×gで遠心分離することによってFT1から細胞をペレット化し、新鮮なLSカラムに通して細胞を渡します3.1.8 - 、手順3.1.6を繰り返すこと。 2つの連続する列の使用は、単離された細胞の強化された純度をもたらします。
- ペレットを4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞、および2ミリリットルの完全RPMIで再懸濁します。必要になるまで氷上に置きます。
- CD8αPOSおよびCD8αNegの樹状細胞の単離
注：この手順の最初のステップは、B、pDCに、TおよびNK細胞の枯渇です。- 全脾臓細胞懸濁液（ステップ2.8で得られた10 8細胞/ mlの1ミリリットル）で開始し、CD8α 順位 DCアイソレーションキットで提供ビオチン結合抗体カクテルの100μlを添加します。
- よく混ぜ、15分間、氷水浴中でインキュベートします。それらの標的細胞へのビオチン標識抗体の結合を最大化するために、穏やかに3分毎にチューブをタップします。
- バッファソートを12mlセルを追加し、4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。吸引し、スーパー未結合ビオチン化抗体を除去するための浮遊性の。
- セルソーティング緩衝液150μlとCD8α 順位 DC分離キットで提供される抗ビオチンビーズを100μlを加えます。よく混ぜ、15分間、氷水浴中でインキュベートします。
- バッファソート10mLの細胞を加え、4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
- 再懸濁し、1ミリリットルセルソーティングバッファ内のセルとステップ3.1.8を介して3.1.6の手順に従って、新鮮なLSカラム上を通過。
- 2（FT2）を介して、非標識の流れを収集し、カラムの保持物を捨てます。この標識されていない画分はCD8αPOSおよびCD8αNegの DCに濃縮されています。
- 4℃で5分間、300×gで遠心分離することによってFT2で細胞をペレット化。
- 1ミリリットルセルソーティングバッファ内の細胞を再懸濁し、CD8α 順位 DC分離キットで提供される抗CD8α共役磁気ビーズを200μlを追加します。
- 代表ステップ3.2.6を介して3.2.2を食べます。カラムのフロースルーはCD8αNegの樹状細胞について濃縮し、CD8α 順位のDCのために枯渇しています。これは、3（FT3）を通る流れをラベル付けされています。
- CD8α 順位 DCはカラムに保持溶出するために、磁石から列を削除し、セルソーティング緩衝液5mlを追加し、LSカラムを備えたプランジャーを使用して、列の行列をパージします。
- 4℃で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。 1ミリリットルセルソーティングバッファ内の上清を吸引および再懸濁。純度を高めるために、手順を繰り返して、新鮮なLSカラムに通して再び溶出細胞を実行すると、フロースルーを廃棄し、3.2.11のように保持された細胞を収集除いて、3.1.8に3.1.6。
- FT3懸濁液からCD8αNegの DCを精製するために、4℃で5分間、300×gの遠心分離によってFT3をペレット化し、細胞選別緩衝液300μlで再懸濁。
- 抗CD11cのMAGの100μLを加えます磁ビーズ。よく混ぜ、15分間、氷水浴中でインキュベートします。
- 4℃で5分間、300×gでの遠心分離によってバッファー、ペレット細胞を選別10mLの細胞を加えます。
- 繰り返しは、3.1.8を介して3.1.5を繰り返します。 CD8αNegの DCは積極たCD11cビーズで選択され、カラムに結合されています。フロースルーを廃棄することができます。
- ステップ3.2.11で説明したように精製されたCD8αNegの DCを収集するために、カラムに保持された細胞を溶出させます。
抗原およびセル転送4.パルシングのAPC
- 生細胞と死細胞を区別するためにトリパンブルー排除21を使用して精製した後、生細胞を数えます。
- 選択した抗原で細胞をインキュベートします。 100 nMの濃度13でアルファガラクトシルセラミド（αGalCerの）と呼ばれる糖脂質抗原の類似体を使用してください。一般的に、プレート10 6生細胞/ウェルの完全RPMI培地中の超低ATTACを使用して、hment U底96ウェルプレートは、細胞接着を最小限にします。 4時間- 1、37℃で5％CO 2雰囲気中で細胞をインキュベートします。
- 静かに数回ピペッティングすることにより細胞を回収します。剪断力から細胞の損傷を最小限に抑えるために広い口径のピペットチップを使用してください。 PBSでウェルを洗浄し、細胞の収穫を最大化するために、これらの洗浄をプール。
- 4℃で5分間、300×gで細胞をペレット化し、PBS中で所望の濃度に再懸濁します。一般的に、レシピエント動物あたり200μlの100万個の細胞を注入します。宿主動物への投与前に生存能力を最大化するために、細胞を氷上に保管してください。
- マウスに静脈内のいずれかの側尾無駄や眼窩後静脈叢19を介して細胞を注入します。 1mlシリンジに27 G針を使用し、マウス当たり0.1ミリリットルの最大容量を注入します。
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Representative Results
この手順の結果は、移植された黒色腫細胞によって発現されるマウスのFlt-3LによるDCサブセットの拡大に依存しています。 B16.Flt3L腫瘍は、C57BL / 6マウス由来し、拒絶反応のために設立さになるように、腫瘍の失敗を避けるために、その株のバックグラウンドを持つ動物に移植する必要があります。場合によっては、関心のある経路または受容体シグナル伝達の既知の欠陥を有するDCを導出するために遺伝的に改変されたマウスを使用することが望ましいです。腫瘍は、そのような動物では異なる反応速度で発症することが心に留めておくことは重要であるので、接種部位での外観と触診に基づいて腫瘍の成長を監視することが重要です。腫瘍が触診可能になると我々の経験では、マウスを保有B16.Flt3L腫瘍は一貫して、すべてのDCサブセット（ 図2A）の拡大と相関脾臓細胞充実性の顕著な増加を示しました。当社は通常、2〜3倍のincreasを参照してください。ナイーブ動物と比較しB16.Flt3Lメラノーマを有するマウスから得た全脾細胞の数の電子。 B細胞の絶対数の変化なしにはほとんど存在しながら部分におけるDCの数の増加は、B細胞の頻度の明らかな低減に寄与する。大規模な拡張が（〜15-絶対数で20倍の増加に）これらのマウスにおける従来のDCのために観察しながら興味深いことに、形質DCサブセットで観察されたわずかな増加（約4倍）があります。
異なるDCサブセットを識別するためのゲーティング戦略は、 図2Aに示されており、サブセット特異的な表現型マーカー（ 図2B）としてB220、のCD11b、CD11cのとCD8αの発現に基づいています。 図2（b）に示すように、我々はまた、これらのサブセットにDEC205、CD11bおよびmPDCA1発現を調べました。これは、PDCのみのサブセットにmPDCAと予想されるパターンを示し、12月のに対し、 205はCD8αNegの DC上で最も顕著に検出されたCD8α 順位 DCおよびCD11bの上に高度に発現されます。我々はまた、プロトコルの各ステップで精製したサブセットのそれぞれについて、セル周波数の変化を分析した（ 図3のフローサイトメトリーデータの具体例で、 図2Cに要約）ここで説明します。この方法に記載脾臓DCサブセットの単離は、多段階の手順（ 図1）です。形質DCの精製はB、T、NK細胞と従来のDCのようなすべての望ましくない集団の枯渇した後、これらの細胞を豊かにする負の選択に依存しています。 CD8α 順位 DCの精製、およびCD8αNegの DCはT、BおよびNK細胞の枯渇した後、これらの細胞の正の選択によって行われます。 DCサブセットのそれぞれの高純度（典型的には、〜95％）も、図3に示されているこの手順を使用して得られました。
ve_content。 "FO：キープtogether.withinページ=" 1 ">実行される実験に応じて、これらの細胞は、所望の抗原でパルスし、免疫学的研究のための組織適合性のマウス宿主に転送することができるほかに、これらの細胞はまた、缶生理的なDCサブセットの刺激や規制活動のin vivo試験のために使用すること。2×10 7合計脾細胞あたりの精製されたDCサブセットのための細胞収量は約100万のpDC、200万CD8α 順位 DCと400万CD8αNegの DCにあります。
DCの図1.単離 DCの異なるサブセットを単離するためのプロトコルの様々な工程を模式的に示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 >
B16.Flt3L腫瘍を有するマウスにおける脾臓DCサブセットの図2.分析。 A）ゲーティング戦略は、pDCに（R1）、CD8α 順位のDC（R5）とCD8αNegの樹状細胞（R6）。B）異なるサブセット上mPDCA1、33D1、DEC205とのCD11bの発現に対応する細胞集団を識別するために例示されています。ゲートR4（リンパ球のサブセット; B220用負、のCD11c、CD11bの）中に含まれる細胞は、これらのマーカーの発現を欠く対照集団として使用されているC）日目にマウスの脾臓から単離したDCおよびリンパ球サブセットの相対的濃縮。ナイーブマウスにおけるこれらの細胞集団の頻度は、白色バーとして示されているB16.Flt3Lメラノーマ細胞の接種後14は、黒色のバー、左のプロットに示されています。右のプロットは、細胞数と同じデータが表示されます。https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
濃縮プロトコルの間に脾臓DCサブセットの図3.分析。 A）形質のDC（B220 高およびCD11c 低 、R1）の濃縮は10％から脾臓細胞の出発集団でB16.Flt3L腫瘍から、このカラムから溶出した細胞を保持液1.ノートを通じてカラム流量で〜95％の純度に担持マウスこの集団が枯渇している。B）従来のDCの濃縮は（）のCD11c 高 、正と負のCD8αの混合物でB16.Flt3Lメラノーマを有するマウスの脾臓中の33％〜から10日目に腫瘍移植後〜78％でに2流出画分。カラム保持液2プロットでは、のCD11c陽性の集団はパルティように見えます同盟国は、T、BおよびNK細胞を枯渇させるために、負の選択時にDCの相当数の除去に対応し、枯渇します。 CD8α 順位 DCの> 95％の純度抗CD8結合利回りのための正の選択を使用して2サスペンションを通る流れのさらなる分画。このからのフロースルーはその後、> 95％純粋CD8αNegの DCの集団を、抗CD11cのの結合降伏のための正の選択を行った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
樹状細胞は、T細胞応答のプライミングに関与する細胞を提示する主要なプロフェッショナル抗原であることが受け入れられています。彼らの主な機能は、T細胞に提示するための抗原を取り込み、処理することにより、組織微小環境を調査することです。特定のDCサブセットの機能を研究するために、これらは、それらの正常な表現型および機能を維持する方法を使用して、十分な数の単離する必要があります。ほとんどのプロトコルはナイーブマウスからの特定のDCサブセットの分離に依存しています。これらの細胞は稀であるので、単離手順は効率的ではない、細胞の低い数字が得られます。転送の研究で行われ、ほとんどの実験は動物あたり細胞の少なくともこの番号を使用しながら、100万CD8 posのDCを -例えば、1脾臓は約0.5が得られます。したがって、既存の方法の主な制限は、ドナーマウスの極めて多数の実質的なボリュームを使用することなく、十分な細胞数を単離することができないことです試薬の。我々の方法は、実質的に大幅に免疫精製工程の一連を使用して、3つのよく認識DCサブセットの非常に大きい数の精製を可能にする、DCを拡大するのFlt-3Lを分泌する腫瘍を移植したマウスを使用することによって、これらの問題を克服します。したがって、ここで説明するプロトコルは、少なくとも数倍の収率の観点から、既存の方法に比べて大幅に改善されました。
いくつかの注意事項は、ここで説明した単離プロトコールのために存在します。主な制限は、これらの細胞を単離するために使用される手順が誤ってそれらの表現型を変化させ得ることです。 DCは、エンドトキシン汚染とその表現型および機能の変化につながる可能性があり、機械的刺激に絶妙に敏感です。この技術の他の制限は、DCサブセットを拡大するのFlt-3Lの分泌に依存しているということです。これは、FLT-3受容体を発現しない組織常駐DCサブセットの拡大の欠如をもたらします。
ザここで説明するプロトコルは、市販の試薬を用いて細胞濃縮に依存しています。細胞精製単離するためのキットは、使用する試薬の推奨ボリュームを含むプロトコルが付属しています。腫瘍担持マウスの細胞組成物は、未処理マウス（ 図2C）とは劇的に異なっているので、我々は、最適な細胞の純度を達成するために我々の技術で使用される試薬のための量を変更しました。 DCは、接着細胞であり、非特異的カラムマトリックスに付着することができます。 EDTAを含む緩衝液でカラム床の平衡化は、細胞接着を最小限に抑え、連続する2つの列シリアルオーバー通路の使用は、細胞の純度を向上させます。
DCは非常に接着性細胞であり、 生体内で一般に密接に細胞外組織マトリックスと関連しています。収率を高めるためには、十分なティムのためにコラゲナーゼおよびDNアーゼで脾臓組織を消化することが非常に重要ですEは、これらの細胞の最大数を抽出します。消化を受けながら、脾臓組織断片が完全にコラゲナーゼ/ DNアーゼI溶液中に沈めていることを確認するためにも重要です。これらの細胞は非常にエンドトキシン応答性であるため、DC絶縁のもう一つの重要な特徴は、単離手順の間に厳密な無菌性およびエンドトキシンフリーの状態を維持することです。エンドトキシンフリーのストックから新たに調製した試薬を使用し、フィルターは使用前に全ての試薬を殺菌。すべての細胞分離バッファとメディアは、検出可能なエンドトキシンを含まないことが保証されているFCSを添加する必要があります。これらの細胞はまた、機械的刺激に対して非常に敏感であり、繰り返される機械的刺激は、これらの細胞の成熟状態を変化させることができます。いくつかの機械的な力がコラゲナーゼ消化後の細胞ストレーナーを通して組織を強制するために必要とされるが、これはできるだけ穏やかに行われるべきです。また、細胞の激しいピペッティングをpossiblな限り避けるべきですE、およびワイドボアピペットチップは、剪断力を最小限にするために使用されるべきです。
養子伝達モデルは、DCの特定のサブセットによる抗原提示とT細胞プライミングの調査のために有用です。しかし、抗原の移送は、抗原パルスされたDCから内因性DCに発生する可能性がある他の研究で実証されています。このように、抗原パルスされた細胞によって扇動適応免疫応答は、「捕獲さ」は、抗原とないその転送APCのを提示する内因性のDCによるプレゼンテーションを反映することができます。絶縁型DCの準備が死亡または瀕死の細胞が含まれている場合、転送のこの種は、指数関数的に増大します。細胞の生存を増強するために予め冷却した緩衝液と、無菌条件を用いて、できるだけ迅速にDCの単離および転送プロトコルを実行することが重要です。我々は、中に細胞の付着を最小限に抑えるために低い結合細胞培養プレート中でインキュベートして、この理由のために4時間の比較的短い抗原パルス期間を選択しましたこのステップ。また、拡張された培養条件は、培養されたDCの成熟状態を変化させてもよいし、養子移入実験22の結果に影響を及ぼし得ます。
要約すると、樹状細胞生物学は、研究の非常に活発な領域であり、かつ信頼性の高い方法の開発が忠実にそれらのインビボ表現型および機能的な相違は、これらの細胞を研究する巨大な機会を提供反映DCを生成します。これは、DC機能を調節することができるが、動物モデルに全身投与することができない化学物質を含む研究のために特に重要になります。これらの化学物質に関心の絶縁型DCサブセットex vivoでの治療は、抗原提示経路のメカニズムの詳細を解明することができ、実用的かつ実現可能なアプローチです。
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Acknowledgments
研究はアインシュタインがんセンター（NIH / NCI CA013330）とエイズ研究センター（NIH / NIAID AI51519）でサポートされているFACSコア設備を用いて実施したサイトメトリーこの作品は、SAPの流れにNIH / NIAIDの助成金AI45889によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
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