Abstract
수지상 세포 (DC가)를 취득 처리 및 T 세포 성 면역을 시작하는 분자를 제시 항원에 항원을 제시하는 주된 책임 전문 항원 제시 세포이다. 수지상 세포는 여러 표현형 기능적 이종 서브 세트들로 분리 될 수있다. 비장 수지상 세포의 세 가지 중요한 부분 집합은 CD8α 순위 및 CD8α NEG 세포 형질 있습니다. 형질 DC가 내가 인터페론 유형의 자연 생산자 및 항 바이러스 T 세포 면역에 중요하다. CD8α NEG DC의 부분 집합은 MHC 클래스 II 항원 제시를위한 전문 중앙 CD4 T 세포를 프라이밍에 참여하고있다. CD8α 순위 수지상 세포는 외래 항원과 CD8 T 세포 프라이밍의 크로스 프리젠 테이션 주로 책임이 있습니다. CD8α 순위 수지상는 전문 T의 CEL에 CD1d 분자에 의해 당지질 항원의 프레 젠 테이션에서 가장 효율적인 것으로 입증되었다불변 자연 살해 T (하여 iNKT) 세포로 알려진 리터 인구. FLT-3 리간드의 관리는 궁극적으로 쥐 모델에서 말초 림프 기관에 수지상 세포의 확장의 결과로, 골수에서 수지상 세포의 전구 세포의 이동의 빈도를 증가시킨다. 우리는 다른 DC 서브 세트의 생체 내 능력을 비교하는 셀 이전 실험에서 사용하기 위해 기능 수지상 세포 다수의 정제이 모델을 채택하고있다.
Introduction
은 "큰 별 모양 (그리스어 덴 드론) 셀은"림프 기관 (1)에서 발견 수지상 세포 (DC)는 거의 사십년 전에 발견되었다. 많은 연구 수지상 효과적으로 나이브 T 세포 (2)를 자극 할 수있는 유일한 항원 제시 세포 인 것으로 나타났다. 이러한 세포의 주요 기능은 항원 제시 분자 상에 흡수 및 항원 제시 및 효율적인 처리 및 이들의 로딩을합니다. 마우스 비장 DCS는 형질 종래의 서브 세트들로 분리 될 수있다. 형질 DC가이 중 CD11c의 낮은 표현과 B220 및 GR-1의 높은 수준을 특징으로한다. 또한 표면 마커 mPDCA1에 대한 긍정적 인 내가 수용체 9 (TLR9) 리간드와 같은 수신자에 대한 응답으로 인터페론 유형을 분비한다. 종래의 수지상 세포는 중 CD11c 및 MHC 클래스 II 표현 높다. 그들은 같은 CD4, CD8α, DEC205, CD 등의 표현형 마커의 표면 발현에 따라 세 가지 하위 집합으로 분할 할 수 있습니다(11B) 및합니다 (33D1 항체에 의해 인식 DCIR2) 수지상 세포 억제 수용체 2 단백질 3,4. CD8α 순위 DC가도 cDC1로 알려져 있습니다, 이러한 CD11b를하고 33D1 같은 골수 마커 DEC205 긍정적, 그러나 음. 또한 cDC2라는 CD8α NEG의 DC는, 33D1, CD11b를하고 CD4 양성하지만 DEC205이 부족하다. 이중 음의 부분 집합 (CD4 및 CD8α 모두 즉, 부정적)은 비교적 드문이며, DEC205 및 33D1에 대한 부정적이다. 그것은 최소한의 특성화 된 부분 집합이며 CD8α NEG DC의 덜 차별화 된 형태 일 수있다.
다양한 DC 부분 집합의 표현형 차이는 또한 생체 내 기능을 확장 할 수 있습니다. CD8α NEG DC가 매우 식세포하고 주로 CD4 T 세포 3 MHC 클래스 II를 통해 외래 항원을 제시하는 것으로 생각된다. 반대로 CD8α 순위 수지상은 MHC 클래스 I에 가용성 단백질 항원 제시를위한 전문화메커니즘의 크로스 발표했다. 크로스 프레젠테이션의 결과는 이러한 수지상 (5)의 작동 상태에 따라 달라지며, 세포 독성 T 세포 (CTL을) 또는 조절 T 세포를 6 2,7- 개발 확장을 초래할 수 있습니다. 감염된 세포 사멸 세포로부터 유래 된 항원 제시 강한 CTL 응답 (9)을 유도하는 반면, 주로 T 세포 (8)의 삭제에 방지 DEC205 항체 매개 배달 결과를 사용하여 CD8α 순위 수지상 세포에 항원의 타겟팅.
펩타이드 항원의 인식에 더하여, 상기 포유 동물의 면역 시스템은 지질 및 당지질 항원을 인식하도록 진화했다. 이 항원은 다양한 포유 동물에서 여러 관련 형태로 존재하는 MHC 클래스 I-같은 세포 표면 단백질 CD1 분자에 의해 제공됩니다. 쥐에 CD1d이라는 고도의 보존 CD1 분자의 단일 유형은 당지질 항원 (10)에 대한 책임이다. 주요 CD1d / 당지질 복합체를 인식하는 T 세포 집단이 불변 NKT 세포 (하여 iNKT 세포)라고한다. 이들 세포는 11 다양성이 제한된 TCRβ 쇄와 결합하는 불변 사슬 TCRα 이루어지는 반 불변 T 세포 수용체 (TCR)를 표현한다. 증식 및 활성화 효과기 T 세포가 분화 할 필요가 종래의 T 세포를 달리하여 iNKT 세포 이펙터 집단으로 존재 당지질 12 투여 후 신속하게 응답을 시작한다. 생리 학적으로 중요한 지질 항원 제시 세포의 확인은 연구의 활성 영역이며, 이러한 B 세포, 대 식세포 및 수지상 세포와 같은 여러 독특한 세포 유형이이 기능을 수행하기 위해 제안되었다. 그러나, 수지상의 CD8α 순위 서브 세트 마우스 인 iNKT 세포 (13) 및 CD8 T 세포 14 당지질 매개로 프라이밍 간 지질 흡수 및 항원 제시를 매개하는 주요 세포 인 것으로 입증되었다.
다른 항원 제시 세포에 의해 항원 제시의 효율성을 비교하기 위해 "> ove_content, 간단한 접근 방식은 이러한 종류의 세포 전달 실험 종종 면역 시험 수행된다 나이브 호스트로 항원 당량으로 펄싱. 정제 된 장갑차의 종류를 전달하는 것이다. 이러한 세포들은 전체 셀 (15)의 2 % 미만을 구성하는 림프 기관에서 희귀 집단이 존재하기 때문에, 생체의 항원 처리 된 수지상 세포로 전달 연구를 수행하는 것은 어려운 것이다. 이는 공여 동물에서 이들 세포의 발달을 향상시킬 필요가있다 분리 프로토콜의 효율을 증가시키기 위해.이는 알려져있다 PDC, CD8 순위 및 CD8 NEG DC 서브 세트 명시 FMS 관련된 수용체 티로신 키나아제 3 (FLT-3)의 생성에 필요한 공통 림프 및 골수 조상 공통. 생체 FLT-3 리간드시 (FLT-3L) 관리, emigratFLT-3 골수 전구 세포를 발현 이온 말초 림프 기관의 증가 된 시드 및 성숙 DC 자손 (16)의 팽창의 결과로 증가된다. FLT-3의 발현은 B, T 또는 NK 세포 분화 경로에 헌신하는 동안 손실됩니다. 따라서, 최소한의 변경은 FLT-3L의 투여시 이들 세포에서 관찰된다. DC 집단에 비슷한 확장 FLT-3L (17, 18)의 지속적인 전신 수준을 제공하기위한 간단하고 경제적 인 방법을 제공한다 뮤린 FLT-3L를 분비 B16 흑색 종 세포주의 주입에 의해 생성 된 종양을 갖는 마우스에서 관찰된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 따라서 크게 후속 실험에서 분리 될 수있는 이러한 세포의 수율을 증가시킨다 마우스 비장 모두 정상적인 DC 서브 세트의 확장을 자극하기 위해 FLT-3L 분비 B16 흑색 종 세포의 이식에 기초하는 프로토콜을 개발 . 십사일 피하 메신저 다음 - 우리는 일관되게 (10) 내에 발견총 비장 세포의 60 % - FLT-3 분비 종양의 농장은, 마우스 (40)를 구성하는 수지상 세포의 현저한 농축과 비장 비대 개발한다. 이 비장에서 다른 DC의 부분 집합은 고순도의 표준을 일부 특정 표현형 마커를 사용 시중에서 판매하는 세포 정제 키트를 이용하여 분리 할 수있다.
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Protocol
동물 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에서 승인 된 지침에 따라 수행됩니다. 불임을 필요로하는 모든 절차는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행된다.
마우스의 B16.Flt3L 흑색 종의 1 주입
- 배양 37 ° C에서 10 % CO 2 완전 DMEM 배지에서 0.5 × 106 세포 / ml의 밀도로 T25 조직 배양 플라스크에서 FLT-3 발현 B16 흑색 종 세포주. 세포가 도달 할 때까지 ~ 90 %의 합류 (~ 20 시간)을 성장.
- 트립신 분해 된 세포를 수확. 흡 인물 세포 배양 배지와 PBS로 부착 세포를 세척 하였다. 0.05 % 트립신 5 ML을 추가하고 37 ℃에서 5 분 동안 품어. 프로테아제 소화 급냉 차가운 20 ㎖를 완전 DMEM 배지 소 태아 혈청 (FCS)을 함유하는 (39 ° C)를 추가한다. 가볍게하여 세포를 리프트는 부드럽게 피펫 팅 아래 다음 탭핑.
- (300)에서 원심 분리하여 세포를 수집4 ℃에서 10 분 동안 XG. 혈구 또는 자동화 된 세포 생존 계수기를 사용하여 세포를 카운트. PBS에서 108 세포 / ml의 밀도로 재현 탁.
- 피하 주사하여 종양 세포를 이식 마우스 (C57BL / 6 또는 다른 조직 적합성 균주)를 세포 현탁액 100 ㎕ (107 세포)와 목의 기부에 Machholz 외. (19)에 의해 설명 된 바와 같이.
- 수확 기관에 대한 동물을 희생 전 (12 일 - - 직경 10mm, 일반적으로 7 2) 종양이 만져 또는 볼 때까지 성장 할 수 있습니다.
종양 베어링 마우스에서 비장 단일 세포 현탁액 2. 준비
- 이소 플루 란의 과다 복용 (> 5 % 이소 플루 란의 유량을 조정하고 정지 호흡 후 노출 적어도 2 분 계속)와 마우스를 마취. 안락사에 대한 제도적 지침에 따라 자궁 전위에 의해 FLT-3 흑색 종 종양 베어링 마우스를 희생.
- 디멸균 가위 (20)의 도움으로 무균 기술을 이용하여 70 % 에탄올과 수확 비장 피부 sinfect.
- 바이오 안전성 캐비닛에 전송을위한 멸균 페트리 접시에 비장를 놓습니다. 무균 조건 하에서 여기에서 모든 단계를 수행합니다.
- 신선한 페트리 접시에 비장을 전송하고 RPMI 배지로 세척한다. 메스를 사용하여 소형 (~ 0.2 cm 2) 조각으로 비장을 잘라. 콜라게나 제 / DNase의 용액 10 ㎖로 37 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션.
- 70 μm의 셀 스트레이너에 비장 조직의 부분적으로 소화 정지를 따르십시오. 5 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너의 메쉬를 통해 나머지 조직편 압축.
- 새로운 배지 10 ml의 메쉬 필터를 세척하고 필터를 버리십시오. 세포 펠렛 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 현탁액을 원심 분리기.
- 상층 액을 흡인 및 RBC 용해 완충액 2 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁. RT F에서 품어또는 10 분. 완전한 RPMI 배지 10 ㎖를 첨가하여 RBC 용해 완충액을 해소.
- 4 ℃에서 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠렛. 적절한 부피의 재현 탁 된 Fc는 블록 항체 (2.4G2) 20 ㎍ / ml를 함유하는 세포를 선별 완충액 (예, MACS)에 108 세포 / ml의 세포 밀도를 달성한다.
비장 단일 세포 현탁액에서 형질 DC가, CD8α 순위 수지상 및 CD8α NEG 수지상 3. 정제
. 단일 세포 현탁액으로부터 비장 DC 서브 세트의 분리는도 1에 도시 된 바와 같이 여러 단계의 과정 4에서 온도를 유지하기 위해 사전 - 냉각 완충액 및 빙수 조를 이용하여 모든 단계를 수행 - 8 °의 C를 참고. 프로토콜의 다음 섹션에서 모든 시약의 양이 108 세포 / ㎖)로 비장 세포 현탁액을 200 μL의 초기 입력에 대해 계산된다. 이 확장 할 수 있습니다 또는아래 비례 초기 단계 (3.1.1 및 3.2.1) 기타 시약 (항상 1 X 108 세포 / ㎖의 밀도) 세포 현탁액의 양을 변경하여 필요에 따라. 따라서 이후의 모든 단계에서 시약의 볼륨을 조정합니다. 예를 들어,는, 1 × 10 8 / ㎖에서 비장 세포 현탁액 100 ㎕로 시작하는 모든 단계에서 시약 절반 바와 볼륨을 사용한다.
- 형질 수지상 세포의 분리 (PDC)
- 비장 세포 현탁액 200 μL에 형질 DC 절연 키트에 비오틴 표지 항체 칵테일 300 μl를 추가합니다.
- 철저하게 혼합하고 15 분 동안 얼음 수조에서 부화. 일시 중단 된 세포를 유지하고, 항체 결합을 극대화하기 위해 튜브마다 3 분을 누릅니다.
- 39 ° C에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리하여 세포를 선별 완충액 12 ml를 세포 펠렛을 추가. 대기음 뜨는는 언 바운드 비오틴 항체를 제거합니다.
- 세포를 재현 탁셀 정렬 버퍼 500 μL에 펠렛. 안티 - 비오틴 항체 - 복합 비즈 300 μl를 추가합니다. 단계를 반복 3.1.2과 3.1.3.
- 뜨는을 취소하고 셀 정렬 버퍼의 2 ml의 세포 펠렛을 resuspend. 미리 냉각 된 버퍼를 사용하여 실온에서이 시점에 모든 단계를 수행합니다.
- 자기 스탠드 LS 열을 정렬 신선한 자기 활성화 된 셀을 놓습니다. 세척 및 세포 정렬 버퍼의 5 ㎖로 열 평형.
- 칼럼 상에 세포 현탁액을 피펫 칼럼 베드의 표면의 중심으로 부드럽게 도포. 을 통해 흐름을 수집합니다.
- 셀 정렬 버퍼의 10 ml의 컬럼을 씻으십시오. 통해이 흐름을 수집하고 단계 3.1.7에서를 통해 흐름을 결합한다. 올라가고은 (FT1)을 통해이 열 흐름에 충실.
- 2 ml의 세포 정렬 버퍼에 4 ° C,에 resuspend에서 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FT1에서 세포 펠렛과 신선한 LS 칼럼을 통해 세포를 전달3.1.8 - 3.1.6 단계를 반복하여. 이 순차적으로 열 사용은 분리 된 세포의 향상된 순도를 산출한다.
- 2 ml의 완전한 RPMI 4 ° C에서 5 분 300 XG에 원심 분리하고, 재현 탁하여 펠렛 세포. 필요할 때까지 얼음에 놓습니다.
- CD8α 순위 및 CD8α NEG 수지상 세포의 분리
참고 :이 절차의 첫 번째 단계는 B, PDC, T와 NK 세포의 고갈이다.- 전체 비장 세포 현탁액 (단계 2.8에서 얻은 10 8 세포 / ml의 1 ml)로부터 CD8α 순위 DC 절연 키트에 바이오틴 결합 된 항체 칵테일 100 μl를 추가합니다.
- 잘 섞어서 15 분 동안 얼음 수조에서 부화. 그들의 표적 세포에 비오틴 표지 항체의 결합을 극대화하기 위해 튜브를 부드럽게 매 3 분을 누릅니다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 버퍼를 정렬 12 ml의 세포를 추가하고 펠렛. 기음 슈퍼언 바운드 비오틴 항체를 제거 natant.
- 셀 정렬 버퍼 150 μL와 CD8α 순위 DC 분리 키트에서 제공하는 안티 - 비오틴 구슬의 100 μl를 추가합니다. 잘 섞어서 15 분 동안 얼음 수조에서 부화.
- 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 버퍼를 정렬 10 ml의 세포를 추가하고 펠렛.
- 재현 탁의 1 ml의 세포 정렬 버퍼에 세포 단계 3.1.8을 통해 3.1.6의 절차에 따라 새로운 LS 열을 통해 전달합니다.
- 2 (FT2)를 통해 레이블이없는 흐름을 수집 및 열 잔류 물을 버린다. 이 레이블이없는 부분은 CD8α 순위 및 CD8α NEG DC에 대한 충실.
- 4 ℃에서 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 FT2에서 세포 펠렛.
- 1 ml의 세포 정렬 버퍼에있는 세포를 재현 탁하고 CD8α 순위 DC 절연 키트에 방지 CD8α 복합 자석 구슬 200 μl를 추가합니다.
- 대표3.2.6 단계를 3.2.2을 먹는다. 컬럼을 통해 흐름은 CD8α NEG DC에 대한 풍부하고 CD8α 순위 DC에 대한 고갈된다. 이것은 3 (FT3)을 통해 흐름을 표시합니다.
- CD8α 순위 수지상 컬럼에 유지 용출, 자석으로부터 열을 제거 세포 선별 완충액 5 mL를 추가하고 LS 열에 구비 플런저를 사용하여 열을 제거 행렬.
- 4 ℃에서 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠렛. 1 ml의 세포 정렬 버퍼의 대기음 뜨는 및에 resuspend. 을 통해 흐름을 버리고 3.2.11에서와 같이 유지 세포를 수집 제외하고, 순도를 증가 3.1.8에 단계 3.1.6를 반복하여 신선한 LS 칼럼을 통해 다시 용출 세포를 실행합니다.
- FT3 현탁액에서 CD8α NEG 수지상 세포를 정화하기 위해, 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FT3 펠렛 세포 정렬 버퍼 300 μL에 재현 탁.
- 안티의 CD11c 잡지의 100 μl를 추가네틱 비즈. 잘 섞어서 15 분 동안 얼음 수조에서 부화.
- 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 10 ml의 세포 정렬 버퍼와 펠렛 세포를 추가합니다.
- 반복 3.1.8을 통해 3.1.5 단계를 반복합니다. CD8α NEG DC가 긍정적하는 CD11c 구슬로 선택하고 열 바인딩됩니다. 흐름을 통해 폐기 될 수있다.
- 정제 CD8α NEG 수지상 세포를 수집하는 단계 3.2.11에 기재된 컬럼에 유지 된 세포를 용출.
항원 및 셀 전송 4. 펄싱 장갑차
- 정화 라이브와 죽은 세포를 구별하는 트리 판 블루 배제 (21)를 사용한 후 살아있는 세포를 계산합니다.
- 선택의 항원과 세포를 품어. 100 nM의 농도 (13)에 당지질 항원이라는 알파 - 갈 락토 실 세라마이드 (αGalCer)의 유사체를 사용합니다. 일반적으로, 매우 낮은 ATTAC를 사용하여 106 생존 세포 / 웰의 완전한 RPMI 매체를 판hment U-바닥 96 웰 플레이트 세포 부착을 최소화합니다. 4 시간 - 1 37 ℃에서 5 % CO 2 분위기에서 세포를 인큐베이션.
- 부드럽게 여러 번 피펫 팅하여 수확 세포. 전단력에서 세포 손상을 최소화하기 위해 넓은 구멍 피펫 팁을 사용합니다. PBS로 우물을 세척하고 세포 수확을 극대화하기 위해 이러한 세척 수영장.
- 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 펠렛은 세포와 PBS에서 원하는 농도로 재현 탁. 일반적으로받는 동물 당 200 μL에 100 만 세포를 주입. 호스트 동물에 투여 전에 생존 능력을 극대화하기 위해 얼음에 세포를 유지합니다.
- 정맥 마우스로 두 측면 꼬리 헛된 또는 레트로 - 궤도 정맥 얼기 (19)을 통해 세포를 주입한다. 1 ML의 주사기에 27 G 바늘을 사용하여 마우스 당 0.1 ML의 최대 볼륨을 주입.
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Representative Results
이 절차의 결과는 주입 된 흑색 종 세포에서 발현 뮤린 FLT-3L 의해 DC 서브 세트의 확장에 의존하고있다. B16.Flt3L 종양은 C57BL / 6 마우스에서 유래하고, 거부로 인해 설립 될 수있는 종양의 실패를 방지하기 위해 그 변형 배경으로 동물에 이식한다. 경우에 따라서는 경로 또는 관심 수용체 시그널링에 공지 결함 수지상 세포를 유도 유전자 변형 마우스를 사용하는 것이 바람직 할 수있다. 이 종양은 다른 동물 동역학으로 개발할 수 명심해야이므로 접종 부위 모양 촉진에 기초하여 종양 성장을 모니터하는 것이 중요하다. 종양이 만져되면 우리의 경험에서, 마우스 베어링 B16.Flt3L 종양은 지속적으로 모든 DC의 부분 집합 (그림 2A)의 확장과 상관 비장 세포 수의 현저한 증가를 보여줍니다. 우리는 일반적으로 2 ~ 3 배의 increas 참조나이브 동물에 비해 흑색 B16.Flt3L 담 마우스로부터 얻은 전체 비장 세포 수의 전자. B 세포의 절대 수에 변화가 거의 존재하면서 부분 DC의 수의 증가는, B 세포의 주파수에서 명백한 감소에 기여한다. 큰 확장 (~ 15 절대 숫자가 20 배 증가)이 생쥐에서 기존의 수지상 세포 관찰하면서 흥미로운의 형질 DC 서브 세트에서 관찰 만 소폭 증가 (약 4 배)가있다.
다른 DC 서브 세트를 식별 할 게이팅 전략은도 2a에 도시되고, 서브 세트 - 특정 표현형 마커 (도 2b)로서 B220,는 CD11b, CD11c 양성 및 CD8α의 발현에 기초한다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, 우리는 이러한 서브 세트에 DEC205, CD11b를 mPDCA1 및 발현을 조사 하였다. 이것은 단지 PDC 부분 집합에 mPDCA와 예상되는 패턴을 보여줍니다 12월 반면, (205)는 CD8α 순위 DC에서 높은 표현과 CD11b를가 CD8α NEG DC에서 가장 눈에 띄게 검출된다. 또한 프로토콜의 각 단계에서 정제 된 서브 세트의 각 셀의 주파수의 변화를 분석 하였다 (도 3의 유세포 데이터의 상세한 실시 예로,도 2c에 정리) 여기에서 설명했다. 이 방법에 기재된 비장 DC 서브 세트의 분리는 다단계 과정 (도 1)이다. 형질 수지상의 정제 B, T, NK 세포와 기존의 수지상 등 모든 바람직하지 않은 집단의 고갈 후이 세포를 풍부하게 음의 선택에 의존한다. CD8α 순위 수지상 및 CD8α NEG 수지상 정제 T, B 및 NK 세포의 고갈 후에 이들 세포의 포지티브 선택에 의해 수행된다. 직류 서브 세트의 각각의 고순도 (전형적으로 ~ 95 %)도도 3에 도시 된 절차를 이용하여 얻어.
ve_content. "FO : 킵 together.within 페이지 ="1 "> 수행되는 실험에 따라 이들 세포는 원하는 항원 감작 및 면역학 연구를위한 조직 적합성 뮤린 호스트로 전송 될 수있다 또한, 이들 세포는 수 생리 DC의 부분 집합의 자극 또는 규제 활동의 생체 내 연구에 사용. 2 × 10 (7) 총 비장 세포 당 정제 DC 하위 집합의 세포 수율은 약 백만 올라가고, 200 만 CD8α 순위의 DC와 400 만 CD8α NEG DC가 있습니다.
그림 수지상 1. 격리. 수지상 세포의 다른 부분 집합의 분리를위한 프로토콜의 다양한 단계를 나타낸 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. >
B16.Flt3L 종양 마우스의 비장 DC 하위 집합의 그림 2. 분석. A) 게이팅 전략은 올라가고 (R1), CD8α 순위 수지상 세포 (R5) 및 CD8α NEG DC가 (R6). B) 다른 부분 집합에 mPDCA1, 33D1, DEC205와 CD11b를 발현에 해당하는 세포 집단을 식별하기 위해 도시되어있다. 게이트 R4에 함유되는 세포 (림프구의 서브 세트, B220, 중 CD11c, CD11b를 마이너스)은. 날 마우스의 비장으로부터 분리 이들 마커 C) DC 상대 농축 림프구 서브 세트의 발현이 부족한 제어 인구로서 사용 순진 생쥐에서 이러한 세포 집단의 주파수가 흰색 막대로 표시되는 동안 B16.Flt3L 흑색 종 세포의 접종 후 14, 검은 색 막대로 왼쪽 그래프에 표시됩니다. 오른쪽 그래프는 세포 수와 같은 데이터를 표시합니다.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
농축 프로토콜 동안 지라 DC 하위 집합의 그림 3. 분석. 마우스 베어링 B16.Flt3L 종양에서 비장 세포의 시작 인구의 10 %에서 형질 수지상 세포 (B220 높은과의 CD11c 저, R1)의 A) 농축은 ~ 열에서 95 %의 순도는이 칼럼에서 용출 세포를 보유 1. 주를 통과하는 의 비장에서 ~ 33 %에서이 인구. B)의 CD11c 높은에서 기존의 수지상 세포의 농축 (CD8α 긍정과 부정의 혼합물)의 고갈 B16.Flt3L 흑색 종 - 베어링에서 ~ 78 %에 종양 이식 후 10 일째에 마우스를 이 분획 플로우 스루. 열 잔류 물이 플롯에서의 CD11c 긍정적 인 인구는 이상적 상대 것으로 보인다아군 T, B 및 NK 세포를 고갈 음성 선별 중에 수지상 상당수의 제거에 대응하여 고갈. CD8α 순위 수지상 세포의> 95 % 순도 안티 CD8 결합 수익률에 대한 긍정적 인 선택을 사용하여 2 서스펜션을 통해 흐름의 추가 분류. 이에서를 통해 흐름은 다음> 95 % 순수 CD8α NEG 수지상 세포의 인구를 방지하는 CD11c의 결합 산출을위한 긍정적 인 선택 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
수지상 세포는 T 세포 반응의 프라이밍 관련된 제시 세포 주요 전문 항원 것으로 받아 들여진다. 이들의 주요 기능은 T 세포에 프리젠 테이션을 위해 항원을 복용하고 처리하여 조직의 미세 환경을 조사하는 것입니다. 특정 DC 서브 세트의 기능을 연구하기 위해, 이들은 정상적인 표현형 및 기능을 유지하는 방식을 사용하여 충분한 수 격리 될 필요가있다. 대부분의 프로토콜은 순진 생쥐의 특정 DC의 부분 집합의 분리에 의존하고 있습니다. 이들 세포는 드물기 때문에, 분리 과정은 비효율적이고 세포의 낮은 숫자를 얻었다. 전송 연구 수행 대부분의 실험 동물 세포 당 적어도이 값을 사용하는 반면, 1 백만 CD8 포스 수지상 - 예를 들어, 비장 약 0.5을 수득한다. 따라서, 기존의 방법의 중요한 한계는 공여 쥐 상당한 양의 매우 큰 숫자를 사용하지 않고 충분한 세포 수를 분리 할 수 없다는이며시약. 우리의 방법은 실질적으로 면역 자기 정화 일련의 단계를 사용하여 세 개의 잘 인식 DC 서브 세트 훨씬 더 많은 수의 정화를 허용 크게 수지상 세포를 확장하는 FLT-3L 분비 종양 이식 마우스를 이용하여 이러한 문제점을 극복한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 따라서 적어도 몇 배 수율 측면에서 기존의 방법에 비해 큰 향상을 제공합니다.
몇 가지주의 사항이 여기에 설명 된 격리 프로토콜이 존재한다. 주요 제한 절차가 실수로 자신의 표현형을 변경할 수 있습니다 이러한 세포를 분리에 사용되는 것입니다. 수지상 세포는 독소 오염과 표현형 및 기능의 변화로 이어질 수 기계적 자극에 정교하게 민감하다. 이 기술의 또 다른 한계는 DC의 하위 집합을 확장 FLT-3L 분비에 대한 의존도입니다. 이 FLT-3 수용체를 발현하지 않는 조직 상주 DC 하위 집합의 확장의 부족을 초래한다.
그만큼여기에 설명 된 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하여 세포 농축에 의존한다. 세포 정화의 분리를위한 키트는 사용되는 시약의 권장 볼륨을 포함하는 프로토콜이 제공됩니다. 마우스 담 종양 세포 조성물 나이브 마우스 (도 2c)과는 다른 극적이며, 따라서 우리는 최적의 세포의 순도를 달성하기 위해 우리의 방법에 사용되는 시약에 대한 금액을 변경했습니다. 수지상 세포가 부착되고 컬럼 매트릭스에 비특이적으로 부착 할 수있다. EDTA를 함유하는 완충액으로 칼럼 베드의 평형화는 세포 부착을 최소화하고, 두 개의 연속적인 열을 통한 직렬 통로의 사용은 상기 세포의 순도를 향상시킨다.
DC가 매우 부착 세포이며, 생체 내에서 일반적으로 밀접하게 세포 조직 행렬과 연결되어 있습니다. 수율을 높이기 위해서는, 충분한 팀을위한 콜라 게 네이즈와 DNase를 가진 비장 조직을 소화하는 것이 매우 중요전자는 이러한 세포의 최대 개수를 추출한다. 소화를 진행하면서 비장 조직 파편이 완전히 콜라게나 / DNase의의 I 솔루션에 빠져들되어 있는지 확인하는 것도 중요하다. 이들 세포는 고도로 독소 반응이기 때문에 DC 분리의 또 다른 중요한 특징은, 분리 과정 동안 엄격한 멸균 및 내 독소가없는 상태를 유지하는 것이다. 독소가없는 주식에서 새로 제조 한 시약을 사용하여 필터를 사용하기 전에 모든 시약을 소독. 모든 세포 분리 버퍼와 미디어가 검출 독소의 자유를 인증 FCS로 보충해야한다. 이 세포는 기계적 자극 이러한 세포의 성숙 상태를 변경할 수 반복 기계적 자극에 매우 민감하다. 일부 기계 힘이 콜라겐 분해 후 셀 스트레이너를 통해 조직을 강제 할 필요가 있지만,이 같은 부드럽게 가능한 수행해야합니다. 또한, 세포의 격렬한 피펫 팅이 possibl만큼 피해야전자, 넓은 구멍 피펫 팁은 전단력을 최소화하기 위해 사용되어야한다.
입양 전송 모델은 수지상 세포의 특정 부분 집합에 의해 항원 제시 및 T 세포 프라이밍의 조사에 유용합니다. 그러나, 내인성 항원을 수지상 세포에 대한 수지상에서 발생할 수있는 항원 전달 다른 연구에서 증명되었다. 따라서, 항원 펄스 세포에 의해 유발 적응 면역 반응은 "캡처"항원이 아니라 그 이전 APC의 제시 내생 DC에 의한 프리젠 테이션을 반영 할 수있다. 고립 된 DC 준비가 죽었거나 죽어가는 세포를 포함하는 경우 전송이 종류는 기하 급수적으로 증가한다. 이 세포 생존을 향상시키기 위해 미리 냉각 버퍼 멸균 조건을 사용하여, 가능한 빨리 DC 차단 및 전송 프로토콜을 수행하는 것이 중요하다. 우리 동안 세포 부착을 최소화하기 위해 낮은 결합 세포 배양 플레이트에서 배양하여,이 때문에 4 시간의 비교적 짧은 항원 펄스주기를 선택이 단계. 또한, 확대 배양 조건은 배양하여 수지상 세포의 성숙 상태를 변경할 수 있고, 양자 전송 실험 22의 결과에 영향을 미칠 수있다.
요약하면, 수상 세포 생물학 충실히 생체 표현형을 반영 기능적 차이는 이들 세포를 연구 할 수있는 기회를 제공 엄청난 수지상 세포를 생성하는 매우 활발한 연구 분야 및 신뢰할 수있는 방법의 개발이다. 이것은 DC 기능을 조절 할 수 있지만 동물 모델에 체계적으로 관리 할 수없는 화학 물질을 포함하는 연구에 특히 중요합니다. 이러한 화학 물질에 관심 생체의 절연 DC의 하위 집합을 처리하여 항원 제시 경로의 기계적인 세부 사항을 명료하게 도움을 줄 수있는 실용적이고 실현 가능한 접근 방법이다.
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Acknowledgments
연구는 에이즈 연구를위한 아인슈타인 암 센터 (NIH / NCI CA013330) 및 센터 (NIH / NIAID AI51519)에 의해 지원 FACS 코어 기능을 사용하여 수행 하였다 세포 계측법이 작품은 SAP 흐름에 NIH / NIAID 보조금 AI45889에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
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