Abstract
תאי דנדריטים (DCS) הם תאים מקצועיים מציגי אנטיגן אחראים בעיקר על רכישה, עיבוד והצגת אנטיגנים על אנטיגן הצגת מולקולות ליזום חסינות T-cell בתיווך. ניתן להפריד תאים דנדריטים לכמה תת phenotypically והטרוגנית מבחינה תפקודית. שלושה תת חשוב של תאים דנדריטים הטחול הם plasmacytoid, CD8α קופה CD8α נג תאים. הקל DCS plasmacytoid מפיק טבעי מסוג שאני אינטרפרון חשוב חסין תא T אנטי ויראלית. תת CD8α נג DC מתמחה בגין הצגת אנטיגן הכיתה MHC II ומעורב מרכזי תחול תאי CD4 T. קל DCS Pos CD8α אחראים בעיקר עבור צולבות הצגת אנטיגנים אקסוגניים תחול תא CD8 T. קל DCS Pos CD8α הוכח להיות יעיל ביותר על הצגת אנטיגנים glycolipid ידי מולקולות CD1d על cel T מיוחדהאוכלוסייה l המכונה T קטלניים טבעי משתנה (iNKT) תאים. מינהל של ליגנד FLT-3 מגביר את תדירות הגירה של אבות תאים דנדריטים ממח העצם, בסופו של דבר וכתוצאה מכך הרחבה של תאים דנדריטים באיברים הלימפה היקפי במודלים Murine. אנחנו צריכים להתאים את המודל הזה לטהר מספר גדול של תאים דנדריטיים פונקציונלי לשימוש בניסויים תא העברה להשוות in vivo מיומנות של תת DC שונים.
Introduction
תאי דנדריטים (DC) נתגלו לפני כמעט ארבעים שנה כמו "stellate הגדול (Dendron היוונית) התא" נמצא באיברי הלימפה 1. מחקרים רבים הראו כי DCs הם אנטיגן רק תאי מציגים שיכולים לעורר נאיביים בתאי T 2 ביעילות. תפקידה העיקרי של תאים אלה הוא ספיג והצגת אנטיגנים והעיבוד היעיל שלהם וטעינה של אלה על מולקולות מציגי אנטיגן. טחול עכבר, DCS ניתן לחלק plasmacytoid לבין תת-קונבנציונלי. הקל DCS plasmacytoid מאופיין ביטוי הנמוך של CD11c ורמות גבוהות של B220 ו Gr-1. הם גם חיוביים עבור mPDCA1 סמן משטח ומפרישים מסוג I אינטרפרון בתגובה האגרה כמו 9 קולטן (TLR9) הליגנדים. הקל DCS הקונבנציונלי גבוה עבור CD11c והביטוי השני בכיתת MHC. הם יכולים להיות מחולקים לשלוש קבוצות משנה נבדלים זה מזה המבוססים על ביטוי השטח של סמנים פנוטיפי כגון CD4, CD8α, DEC205, CD11b ו קולטן 2 מעכבות תאים דנדריטים (DCIR2, מוכר על ידי נוגדן 33D1) חלבונים 3,4. קל DCS Pos CD8α ידועים גם בשם cDC1, הן חיוביות עבור DEC205, אבל שלילי עבור סמנים מיאלואידית כגון CD11b ו 33D1. CD8α נג DCS, המכונה גם cDC2, הן חיוביות עבור 33D1, CD11b ו CD4, אך עדיין חסר DEC205. תת שלילי כפול (כלומר, שלילי עבור שניהם CD4 ו CD8α) היא נדירה יחסית, והוא שלילי DEC205 ו 33D1. זהו משנה לפחות מאופיין ועלול להיות צורה פחות מובחנת של CD8α נג DC.
הבדלים פנוטיפי של תת DC השונה גם להאריך לפונקציות in vivo שלהם. קל DCS נג CD8α הם phagocytic מאוד נחשבים להציג אנטיגן אקסוגניים בעיקר דרך רמה MHC II לתאי CD4 T 3. לעומת זאת, DCs Pos CD8α מתמחים בגין הצגת אנטיגן חלבון מסיס על דיוק I MHCבמנגנון הנקרא-מצגת צלב. התוצאה של הצגת צלב תלוי את מצב ההפעלה של DCs אלה 5, והוא יכול גם להוביל להרחבת תאי T ציטוטוקסיים (תאי-ההרג) או התפתחותם של תאי רגולטוריים T 6 2,7. מיקוד של אנטיגן כדי CD8α Pos DCs באמצעות תוצאות משלוח אנטי DEC205-נוגדן בתיווך בעיקר את המחיקה של תאי T 8, ואילו הצגת אנטיגנים שמקורם בתאי אפופטוטיים נגועים גורמת לתגובת CTL חזקה 9.
בנוסף להכרה אנטיגנים פפטיד, המערכת החיסונית היונקת התפתחה להכיר שומנים אנטיגנים glycolipid. אנטיגנים אלה מוצגים על ידי מולקולות CD1, אשר הם חלבונים פני התא אני- כמו בכיתה MHC הקיימים בצורות הקשורות מרובים אצל יונקים שונים. בעכברים, סוג אחד של המולקולה CD1 שמור ביותר בשם CD1d אחראי הצגת אנטיגנים glycolipid 10. העיקרי אוכלוסיית תאי T שמזהים מתחמי CD1d / glycolipid נקראת תאי NKT משתנים (תאי iNKT). תאים אלה מבטאים קולטן תא T למחצה משתנה (TCR) מורכבת שרשרת TCRα משתנה כי היא זיווג עם שרשראות TCRβ שיש להם מוגבלות המגוון 11. שלא כמו תאי T קונבנציונליים שצריכים להתרבות להבדיל להפוך לתאי T מפעיל מופעלים, תאי iNKT להתקיים בתור אוכלוסייה מפעיל ולהתחיל להגיב במהירות לאחר מתן glycolipid 12. זיהוי של תאים מציגי אנטיגן השומנים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הוא אזור פעיל של מחקר, וכמה סוגי תאים ברורים, כגון תאי B, מקרופאגים DCs הוצעו כדי לבצע את התפקיד הזה. עם זאת, זה הודגם כי משנה Pos CD8α של DCs הוא התא הראשוני בתיווך ספיג והצגת אנטיגנים שומנים לתאי העכבר iNKT 13 ו בתיווך glycolipid-יחול צלב של תאי CD8 T 14.
ove_content "> כדי להשוות את היעילות של מצגת אנטיגן על ידי הצגת תאי אנטיגן שונים, גישה פשוטה היא להעביר סוגים שונים של נגמ"שים מטוהרים פעמו עם כמויות מקבילות של אנטיגן לתוך מארחיהם תמימים. ניסויי תא העברה מסוג זה מבוצעים לעתים קרובות ללימודים אימונולוגית. עם זאת, ביצוע מחקרי העברה עם אנטיגן vivo לשעבר DCs מטופל הוא מאתגר, שכן התאים הללו קיימים אוכלוסיות נדירות כמו באיברים הלימפה, שם הם מהווים פחות מ -2% של תאים הכוללים 15. לכן, יש לחזק את הפיתוח של תאים אלה בחי תורם כדי להגביר את היעילות של פרוטוקולי בידוד.זה ידוע כי הלימפה המשותף ואת אבות מיאלואידית משותפים, אשר נדרשים עבור דור של PDC, CD8 קופת CD8 נג DC תת, המפורש FMS הקשורות טירוזין קינאז קולטן 3 (FLT-3). עם in vivo FLT-3 ליגנד (FLT-3L) הממשל, emigratיון של FLT-3 להביע ובתאים ממח עצם הוא גדל, וכתוצאה מכך הזריעה של איברי הלימפה פריפריה גדלה והרחבת צאצאי DC הבוגרת שלהם 16. ביטוי של FLT-3 הוא אבד במהלך מחויבות B, T או NK מסלולי התמיינות תאים. לכן, שינויים מינימליים בלבד הם נצפו בתאים אלה על הממשל FLT-3L. התרחבות דומה באוכלוסיות DC הוא ציין בעכברי נושאי גידולים שנוצרו על ידי השתלת קו תא B16-מלנומה מפריש FLT-3L בעכברים, אשר מספקת שיטה פשוטה וחסכונית למתן רמות מערכתיות מתמשכות של המשפט פרם-3L 17,18. בגישה זו, פתחנו פרוטוקול מבוסס על השתלת תאי B16-מלנומה מפריש FLT-3L כדי לעורר את הרחבת כל תת DC הנורמלי טחול עכבר, ולכן מאוד הגדלת התשואות של תאים אלה שיכולים להיות מבודדים לניסויים הבאים . אנחנו מוצאים בעקביות כי תוך 10 - 14 ימים לאחר im תת עוריתמטע של הגידול והסתרתו FLT-3, עכברים לפתח splenomegaly עם העשרה ניכר של DCs להוות 40 - 60% של תאי טחול הכולל. מ spleens אלה, תת DC שונה יכול להיות מבודד עם טוהר גבוה באמצעות תקן זמינה מסחרי ערכות טיהור תא המעסיקות סמנים פנוטיפי משנה ספציפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים נעשים בהתאם להנחיות שאושרו מועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC). כל הנהלים המחייבים עקר מבוצעים בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
1. השרשה של מלנומה B16.Flt3L עכברים
- התרבות FLT-3 להביע שורת תאים B16 מלנומה צלוחיות בתרבית רקמה T25 בצפיפות של 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום מלאה DMEM עם 10% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לגדול עד שהתאים להגיע ~ 90 מפגש% (~ 20 שעות).
- קציר התאים על ידי טריפסין העיכול. תרבית תאי תקשורת לשאוב ולשטוף את התאים החסידים עם PBS. הוסף 5 מ"ל של טריפסין 0.05% ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף קר 20 מ"ל להשלים בינוני DMEM (4 ° C) המכילה סרום העובר עגל (FCS) כדי להרוות את העיכול פרוטאז. הרם את התאים את ידי קלות הקשה אחריו בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300XG במשך 10 דקות ב 4 °. ספירת התאים באמצעות hemocytometer או דלפק כדאי תא אוטומטי. Resuspend צפיפות של 10 מ"ל 8 תאים / PBS.
- עכברים שתל (C57BL / 6 או אחר זן histocompatible) עם תאים סרטניים על ידי הזרקה תת עורית כפי שתואר על ידי Machholz et al. 19 בבסיס הצוואר עם 100 μl של השעיה תא (10 7 תאים).
- אפשר הגידול לגדול עד מוחשיים או גלויים (2 - 10 מ"מ קוטר, בדרך כלל 7 - 12 ימים) לפני להקריב חיות עבור קצירת איברים.
2. הכנת תרחיף תא בודד טחול מעכברי נושאות גידולים
- להרדים עכברים עם ממנת יתר של isoflurane (להתאים את קצב זרימת isoflurane ל> 5% ולהמשיך לפחות 2 דקות חשיפה לאחר שנשמו עצירות). להקריב את עכבר נושאת גידול של מלנומה FLT-3 על ידי נקע בצוואר רחם בהתאם להנחיות מוסדיות להמתת חסד.
- disinfect העור עם 70% אתנול ו טחול קציר באמצעות טכניקה מזוהמת בעזרת מספריים סטריליות 20.
- מניח את הטחול לתוך צלחת פטרי סטרילית לתחבורה לקבינט הבטיחות הביולוגי. ביצוע כל הצעדים מכאן ולהבא בתנאים סטריליים.
- עבר טחול כדי בצלחת פטרי טריה ולשטוף עם מדיום RPMI. חותכים את הטחול לתוך קטן (~ 0.2 ס"מ 2) חתיכות באמצעות אזמל. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 10 מ"ל של תמיסת collagenase / DNase.
- יוצקים את ההשעיה מעוכל חלקית של רקמת הטחול על מסננת תא 70 מיקרומטר. לדחוס את שברי הרקמה הנותרת מבעד לרשת של מסננת באמצעות הבוכנה מזרק 5 מ"ל.
- שטפו את המסנן רשת עם 10 מ"ל של מדיום חדש וזורקים את המסנן. צנטריפוגה ההשעיה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C עד גלולת התאים.
- לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל של חיץ תמוגה RBC. לדגור על RT fאו 10 דקות. להרוות למאגר תמוגה RBC על ידי הוספת 10 מ"ל של מדיום RPMI מלאה.
- גלולת התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. Resuspend בנפח המתאימה להשגת צפיפות התאים של 10 מ"ל 8 תאים / חיץ מיון התא (לדוגמא, MACS) המכיל 20 מיקרוגרם / מ"ל של נוגדן Fc-בלוק (2.4G2).
טיהור 3. Plasmacytoid DCS, CD8α Pos DCS ו CD8α נג DCs מ תרחיף תא בודד הטחול
הערה: בידוד של תת DC טחול מן השעית תא בודדת הוא הליך רב שלבים כפי שמודגם באיור 1 בצע את כל השלבים באמצעות חיץ טרום מקוררת באמבט מי קרח כדי לשמור על טמפרטורת 4 - C ° 8.. כל הכרכים מגיב בסעיף הבא של פרוטוקול מחושבים עבור קלט ראשוני של 200 μl של השעיה תא הטחול ב 10 8 תאים / מ"ל). זה יכול להיות scaled למעלה אולמטה בהתאם לצורך שלך על ידי שינוי עוצמת הקול של השעיה תא (תמיד בצפיפות של 1 X 10 8 תאים / מ"ל) ריאגנטים אחרים יחסי בשלב הראשוני (3.1.1 ו 3.2.1). התאם כרכים מגיבים בכל השלבים מאוחר יותר בהתאם. לדוגמה, אם מתחילים עם 100 μl של ההשעיה תא הטחול ב 1 x 10 8 / מ"ל, להשתמש במחצית כרכים מגיב כאמור בכל השלבים.
- בידוד של Plasmacytoid DCS (PDC)
- הוספת 300 μl של קוקטייל של נוגדנים שכותרתו ביוטין המסופק בערכה בידוד DC plasmacytoid 200 μl של ההשעיה תא הטחול.
- מערבבים היטב דגירה באמבט מי קרח במשך 15 דקות. קש הצינור כל 3 דקות כדי לשמור על התא המושעה, וכדי למקסם נוגדן מחייב.
- להוסיף 12 מ"ל מיון התא חיץ גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב g 300 x 5 דקות ב 4 ° C. לשאוב supernatant להסיר נוגדני biotinylated מאוגדים.
- Resuspend התאגלולה ב 500 μl של חיץ מיון התא. הוספת 300 μl של חרוזים מצומדות נוגדן אנטי ביוטין. חזור על שלב 3.1.2 3.1.3.
- בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל של חיץ מיון התא. ביצוע כל הצעדים מנקודה זו ואילך ב RT באמצעות מאגרים מראש מקורר.
- מניח תא מגנטי טרי מיון מופעל עמודת LS בדוכן המגנטי. לשטוף לאזן העמודה עם 5 מ"ל של חיץ מיון התא.
- פיפטה השעית התא על הטור, וליישם אותו בעדינות למרכז של פני השטח של מיטת העמודה. אסוף את הזרימה דרך.
- לשטוף את העמודה עם 10 מ"ל של חיץ מיון התא. אסוף זרימה זו דרך ולשלב עם זרם דרך משלב 3.1.7. PDCs מועשרים בתזרים הטור הזה דרך (FT1).
- גלולת התאים מן FT1 על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend ב 2 מיליליטר מיון תא חיץ ולהעביר את התאים דרך עמודת LS טריהעל ידי חזרה על שלבים 3.1.6 - 3.1.8. שימוש זה של שתי עמודות רציפי מניב טוהר משופרת של תאים מבודדים.
- תאים גלולה ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו resuspend עם 2 מ"ל RPMI להשלים. מניחים על קרח עד הצורך.
- בידוד של Pos CD8α ו CD8α נג DCs
הערה: השלב הראשון בהליך זה הוא דלדול של B, PDC, תאי T ו- NK.- החל ההשעיה הטחול התא כולו (1 מ"ל של 10 מ"ל 8 תאים / שהושגו בשלב 2.8), להוסיף 100 μl של קוקטייל נוגדן ביוטין מצומדות המסופק בערכה בידוד CD8α Pos DC.
- מערבבים היטב דגירה באמבט מי קרח במשך 15 דקות. הקש על הצינור בעדינות כל 3 דקות על מנת למקסם מחייב של נוגדנים שכותרתו ביוטין לתאי היעד שלהם.
- להוסיף 12 מ"ל מיון התא חיץ גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C. סופר לשאובשׂוֹחֶה להסיר נוגדני biotinylated מאוגדים.
- להוסיף 150 μl של מיון התא חיץ 100 μl של חרוזים אנטי ביוטין המסופק בערכה בידוד CD8α Pos DC. מערבבים היטב דגירה באמבט מי קרח במשך 15 דקות.
- הוסף 10 מ"ל מיון התא חיץ גלולה התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- תאי Resuspend במאגר מיון 1 מיליליטר תא לעבור על עמודת LS טריה על פי נוהל בצעדים 3.1.6 דרך 3.1.8.
- אסוף את הזרימה ללא תווית באמצעות 2 (FT2) וזורק את retentate העמודה. חלק תווית זה מועשר עבור CD8α קופה CD8α נג DCs.
- גלולת התאים ב FT2 על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
- Resuspend התאים חיץ מיון תא 1 מ"ל ולהוסיף 200 μl של חרוזים מגנטיים מצומדות אנטי CD8α המסופק בערכה בידוד CD8α Pos DC.
- נציגלאכול צעדים 3.2.2 דרך 3.2.6. את הזרימה דרך של הטור הוא מועשר עבור CD8α נג DCS ו מדולדל עבור CD8α Pos DCs. זה מסומן זרימה דרך 3 (FT3).
- כדי elute קל DCS Pos CD8α שמר בעמודה, להסיר את העמודה מן מגנט, להוסיף 5 מ"ל של חיץ מיון התא ולטהר את מטריצת עמודה באמצעות הבוכנה מסופק עם טור LS.
- גלולת התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. supernatant ו resuspend לשאוב ב 1 מ"ל תא חיץ מיון. כדי להגדיל את הטוהר, לתפעל את תאי eluted שוב דרך עמודת LS טריה ידי חזרה על שלבי 3.1.6 עד 3.1.8, למעט וזורק את הזרימה דרך ולאסוף תאי עודפים ב 3.2.11.
- כדי לטהר את DCs נג CD8α מן ההשעיה FT3, גלולה FT3 על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C ו resuspend ב 300 μl של חיץ מיון התא.
- הוספת 100 μl של mag אנטי CD11cחרוזים מגנטיים. מערבבים היטב דגירה באמבט מי קרח במשך 15 דקות.
- הוסף 10 מיליליטר מיון תא תאי חיץ גלול ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- חזור על שלבים 3.1.5 דרך 3.1.8. הקל DCS נג CD8α נבחר באופן חיובי עם חרוזי CD11c וכפופים לעמודה. את זרימת דרך יכולה להיות מושלכת.
- Elute התאים העודפים בעמודה כמתוארת בשלב 3.2.11 לאסוף את DCs נג CD8α המטוהר.
4. פועם נגמ"שים עם אנטיגנים תא העברה
- ספירת תאים חיים לאחר טיהור באמצעות הרחקה trypan כחול 21 להבחין בין תאים חיים ומתים.
- דגירת התאים עם האנטיגן של בחירה. השתמש אנלוגים של ceramide שנקרא glycolipid אנטיגן אלפא-galactosyl (αGalCer) ב 100 ננומטר ריכוז 13. בדרך כלל, צלחת 10 6 תאים קיימא / היטב שלם בינוני RPMI באמצעות attac אולטרה-נמוכהhment U-bottom 96 צלחות גם למזער מצורף התא. דגירה התאים באווירה 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 - שעה 4.
- קציר תאים על ידי pipetting מספר פעמים בעדינות. השתמש בעצות פיפטה נשא רחב כדי למזער נזק לתאים מפני כוחות גזירה. לשטוף את הבארות עם PBS וברכת שטיפות אלה על מנת למקסם את קציר תא.
- גלולת תאי XG ב 300 דקות 5 ב 4 ° C ו resuspend לצפיפות רצויה PBS. בדרך כלל, להזריק 1 מיליון תאים ב 200 μl לכל חיה הנמען. שמור את התאים על קרח כדי למקסם כדאי לפני מתן לתוך חיים מארחים.
- להזריק תאים לווריד לעכברים או דרך לשווא הזנב לרוחב או מקלעת ורידית רטרו מסלולית 19. שימוש במחט 27 G על מזרק 1 מ"ל, להזריק נפח מרבי של 0.1 מ"ל לכל עכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאה של הליך זה מסתמכת על ההרחבה תת DC ידי murine FLT-3L שהביעה תאים מלנומה מושתל. גידול B16.Flt3L נגזר עכבר C57BL / 6, וצריך להיות מושתל לתוך חיים עם שרקע הזן כדי למנוע כשל של הגידול להתבסס עקב דחייה. במקרים מסוימים, זה עשוי להיות רצוי להשתמש בעכברים מהונדסים גנטית לגזור DCs עם פגמים ידועים מסלולי איתות או קולטנים של עניין. חשוב לזכור כי הגידול עלול להתפתח עם קינטיקה שונה בחיות כאלה, ולכן חשוב לעקוב אחר גדילת גידול על בסיס המראה ומישוש באתר החיסון. מניסיוננו, לאחר הגידול הוא מוחשי, הגידול B16.Flt3L נושאות עכברים מראים בעקביות גידול ניכר ב cellularity הטחול כי בקורלציה עם הרחבת כל תת DC (איור 2 א). אנחנו בדרך כלל רואים ועליית 2 עד פי 3דואר במספר splenocytes הכולל שהתקבלו בעכברים B16.Flt3L נושאות מלנומה בהשוואה לבעלי חיים תמימים. הגידול במספר DC חלקית תורם לצמצום הניכר בשכיחות תאי B, בעוד שיש לא מעט על מנת לשנות את המספרים המוחלטים של תאי B. מעניין לציין כי בעוד התרחבות גדולה (~ 15 עד עלייה של פי 20 במספרים המוחלטים) הוא ציינה עבור DCs הקונבנציונלי בעכברים אלו, יש רק עלייה מתונה (כ פי 4) שנצפתה משנת DC plasmacytoid.
האסטרטגיה gating לזהות תת שונים DC מוצג באיור 2A והיא מבוססת על הביטוי של B220, CD11b, CD11c ו CD8α כסמנים פנוטיפי משנה ספציפי (איור 2 ב). אנחנו גם נחקר DEC205, CD11b וביטוי mPDCA1 על תת אלה כפי שמוצג באיור 2B. זה מציג את הדפוס הצפוי, עם mPDCA רק על קבוצת משנת PDC, ואילו דצמבר 205 מבוטא בכמות גבוהה DCs CD8α קופת CD11b המזוהה ביותר בהבלטה על CD8α נג DCs. גם ניתחנו את שינויים התא תדרים לכל אחת תת מטוהרים בכל שלב של פרוטוקול המתואר כאן (שהעיקריים בהם פורטו איור 2C, עם דוגמאות מפורטות של נתונים תזרים cytometric באיור 3). בידודו של תת DC הטחול מתואר בשיטה זו הוא הליך רב שלבים (איור 1). טיהור של DCs plasmacytoid מסתמך על סלקציה שלילית להעשיר תאים אלה לאחר דלדול של כל אוכלוסיות לא רצויות כמו B, T, תאי NK ו DCs קונבנציונאלי. טיהור של DCs Pos CD8α, ו CD8α נג DCs מבוצע על ידי סלקציה חיובית של תאים אלה לאחר דלדול של T, תאי B ו- NK. הטוהר הגבוה של כל אחת תת DC שהושג באמצעות הליך זה (בדרך כלל ~ 95%) באו לידי ביטוי גם באיור 3.
ve_content. "FO: keep-together.within-page =" 1 "> בהתאם הניסויים שיבוצעו, ניתן פעמו תאים אלה עם אנטיגן הרצוי ומועברים לתוך המארחים murine histocompatible ללימודי אימונולוגיים בנוסף, תאים אלה יכולים גם לשמש מחקרים in vivo של פעילויות גירוי או רגולטורית של תת DC פיזיולוגיים. התשואות התא עבור תת DC מטוהרים לכל 2 x 10 7 splenocytes בסך הכל הם כמיליון pDCs, 2 מיליון DCs Pos CD8α ו -4 מיליון CD8α נג DCs.
איור 1. בידוד של DCs. סכימטי לתאר את השלבים השונים של הפרוטוקול לבידוד תרמי של קבוצות משנה שונות של DCs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. >
ניתוח איור 2. של קבוצות משנה טחול DC בעכברים עם גידולי B16.Flt3L. א) אסטרטגית Gating מודגמת לזהות אוכלוסיות התאים המתאימות pDCs (R1), DCS Pos CD8α (R5) ו CD8α נג DCS (R6). ב) ביטוי של mPDCA1, 33D1, DEC205 ו CD11b על תת שונה. התאים הכלולים שער R4 (קבוצת משנה של לימפוציטים; שליל B220, CD11c, CD11b) משמשים כאוכלוסייה מלאה חסרת הביטוי של הסמנים אלה C) העשרה יחסית של DC ו תת הלימפוציטים המבודדים מן spleens של עכברים בכל יום. 14 לאחר החיסון של תאים מלנומה B16.Flt3L מוצג עלילת השמאל כמו פסים שחורים, בעוד התדר של אוכלוסיות תאים אלה בעכברים תמימים מוצג פסים לבנים. העלילה השמאלית מציגה את הנתונים זהים מספרים סלולריים.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ניתוח איור 3. תת הטחול DC במהלך העשרה פרוטוקול. א) העשרה של DCs plasmacytoid (גבוהה B220 ו CD11c נמוך, R1) החל מ -10% באוכלוסייה התחלתי של splenocytes מן הגידול B16.Flt3L נושאות עכברים ~ 95 טוהר% בטור לזרום 1. שים לב retentate תאים eluted מעמודה זו מתרוקנים של אוכלוסייה זו. ב) העשרה של DCs הקונבנציונלי (ב High CD11c, תערובת של CD8α חיובי ושלילי) מ ~ 33% הטחול של B16.Flt3L מלנומה נושאות עכברים ביום 10 לאחר השתלת גידול ~ 78% ב את הזרימה דרך 2 חלק. בחלקות retentate 2 טור, האוכלוסיות החיוביות CD11c להיראות Partiברית מדולדלת, מתאים להסרת מספרים משמעותיים של DCs במהלך סלקציה שלילית כדי לרוקן T, תאי B ו- NK. חלוקה נוספת של הזרימה דרך 2 השעיה באמצעות סלקציה חיובית עבור תשואות מחייבות אנטי CD8> 95 טוהר% של CD8α Pos DCs. את הזרימה דרך מכך הייתה נתונה אז לברירה חיובית לכריכה של CD11c אנטי, מניב אוכלוסייה> 95% טהור CD8α נג DCs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאי דנדריטים מתקבלים להיות אנטיגן המקצועי הגדול הצגת תאי המעורבים יחולו התגובות של תאי T. הפונקציה העיקרית שלהם היא לסקור את microenvironment הרקמות על ידי תופס ועיבוד אנטיגנים להגשה תא T. על מנת ללמוד את הפונקציה של תת-מערכות ספציפיות DC, אלה צריכים להיות מבודדים בכמות מספקת באמצעות גישה מקיימת הפנוטיפ והתפקוד התקינים שלהם. רוב הפרוטוקולים להסתמך על הבידוד של תת DC ספציפי מעכברים נאיביים. מאז תאים אלה הם נדירים, נהלי הבידוד אינם יעילים להניב כמויות נמוכות של תאי. לדוגמא, טחול אחד יניב רק כ -0.5 - 1 מיליון DCs pos CD8, בעוד רוב הניסויים שבוצעו עם מחקרים העברה להשתמש לפחות המספר הזה של תאים לכל בעלי חיים. לפיכך, מגבלה עיקרית של השיטות קיימות היא חוסר היכולת לבודד מספרים סלולריים מספיק מבלי להשתמש במספרים גדולים מאוד של עכברים תורמים כרכים משמעותייםשל חומרים כימיים. השיטה שלנו באופן משמעותי מתגברת על בעיות אלה באמצעות עכברים מושתלים עם גידול מפריש FLT-3L להרחיב את DCs מאוד, המאפשר טיהור של מספרים הרבה יותר משלוש המשנה המוכרת היטב DC באמצעות שורה של צעדי טיהור immunomagnetic. הפרוטוקול המתואר כאן ולכן מספק שיפור גדול על פני שיטות קיימות מבחינת תשואות על ידי קיפול כמה לפחות.
אזהרות מעטים נמצאות עבור פרוטוקול הבידוד המתואר כאן. המגבלה העיקרית היא כי ההליך המשמש לבידוד תאים אלה עשויים לשנות הפנוטיפ שלהם בטעות. DCs הם רגישים במיוחד לזיהום רעלן פנימי ו גירויים מכניים שעשויים להביא לשינויים פנוטיפ ותפקודם. מגבלה נוספת של טכניקה זו היא ההסתמכות על הפרשת FLT-3L להרחיב תת DC. זו התוצאה של חוסר התרחבות תת תושב רקמות DC כי אינם מבטאים את הקולטן FLT-3.
ההפרוטוקול המתואר כאן מסתמך על העשרת התא באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית. ההערכה לבידוד תרמי של טיהור תא מגיעה עם פרוטוקול המכיל את הכרכים המומלצים של ריאגנטים לשמש. רכב התא של גידול נושאות עכברים שונה באופן ניכר מזו של עכברים נאיביים (איור 2 ג), ולכן יש לנו שונה הסכומים עבור חומרים כימיים המשמשים הטכניקה שלנו על מנת להשיג טוהר תא אופטימלי. הקל DCS הם תאים חסידים ועשוי לצרף את מטריצת העמודה שאינה ספציפי. איזון של מיטת העמודה עם מאגר המכיל EDTA ממזער דבקות תא, והשימוש מעבר סדר על שתי עמודות רצופות משפר את טוהר תא נוסף.
DCs הם מאוד תאים חסידים ובחי הם בדרך כלל מזוהה עם מטריקס רקמת התאי. על מנת להגדיל את התשואה, חשוב מאוד לעכל את רקמת הטחול עם collagenase ו DNase לטים מספיקדואר לחלץ מספר מקסימאלי של תאים אלה. כמו כן, חשוב להיות בטוח כי שברי רקמת הטחול הם שקועים לחלוטין בתוך הפתרון שאני collagenase / DNase בזמן שעברו עיכול. תכונה נוספת קריטית של בידוד DC היא לשמור על סטריליות קפדנית תנאים חינם-אנדוטוקסין במהלך הליך הבידוד, מאז תאים אלה הם מאוד רעלן פנימי תגובה. השתמש ריאגנטים מוכן טרי מן המניות רעלן פנימי ללא, ולסנן לעקר כל ריאגנטים לפני השימוש. כל מאגרי בידוד תא ומדיה צריכים להיות בתוספת FCS כי הוא מאושר להיות חופשי של רעלן פנימי לזיהוי. תאים אלה הם גם רגישים מאוד לגירויים מכאניים גירוי מכאני חוזרות כנראה לשנות את מצב ההבשלה של תאים אלה. למרות שחלק בכוח מכני יש צורך לכפות על רקמת דרך מסננת התא לאחר עיכול collagenase, זה צריך להיעשות בעדינות ככל האפשר. בנוסף, pipetting נמרצת של תאים יש להימנע ככל possiblדואר, ו פיפטה נשא רחב טיפים יש להשתמש כדי למזער כוחות גזירה.
מודל העברת המאמצת שימושי לחקירה של מצגת אנטיגן יחול תא T על ידי תת-מערכות ספציפיות של DCs. עם זאת, הוכח במחקרים אחרים מעבירים של אנטיגן עלול להתרחש מ DCs פעם אנטיגן כדי DCs אנדוגני. לכן, התגובה החיסונית אדפטיבית מווסתת על ידי תאים פעם אנטיגן עשויה לשקף מצגת ידי DCs אנדוגני הצגת אנטיגן "נתפס" ולא של עבירת APC. סוג של העברה זו גדל באופן אקספוננציאלי אם הכנות DC המבודדות מכילות תאים מתים או גוססים. לכן חשוב לבצע את פרוטוקול בידוד והעברת DC במהירות האפשרית, תוך שימוש בתנאים סטריליים עם מאגרים מראש מקורר כדי לשפר הישרדות התא. בחרנו תקופה קצרה יחסית אנטיגן פועם של 4 שעות מסיבה זו, עם דגירת צלחות תרבית תאים נמוכות מחייבת כדי למזער את הקובץ מצורף התא במהלךשלב זה. בנוסף, מצב התרבות מורחבת עשוי לשנות את מצב ההבשלה של DCs התרבותי, ועלול להשפיע על תוצאות ניסויי העברת מאמצת 22.
לסיכום, ביולוגיה של התא הדנדריטי הוא אזור מאוד פעיל של מחקר, ופיתוח של שיטה אמינה ליצור DCs המשקפים פנוטיפי in vivo ו סטייה תפקודית שלהם בנאמנות מספק הזדמנות עצומה ריבויים. זה הופך להיות חשוב במיוחד עבור מחקרים שכללו חומרים כימיים עלולים לווסת פונקציות DC אבל לא יכול להיות מערכתי לתוך מודלים של בעלי חיים. טיפול תת DC המבודד עניין vivo לשעבר עם כימיקלים אלה היא גישה מעשית ריאלית שיכול לעזור להבהיר את הפרטים מכניסטית של מסלולי מצגת אנטיגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי AI45889 מענק NIH / NIAID כדי SAP תזרים cytometry מחקרים בוצעו באמצעות מתקני הגרעין FACS נתמך על ידי מרכז הסרטן איינשטיין (NIH / NCI CA013330) ואת המרכז לחקר האיידס (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
