Abstract
Dendritische cellen (DCs) zijn professionele antigeen presenterende cellen hoofdzakelijk verantwoordelijk voor het verkrijgen, verwerken en presenteren van antigenen op antigeenpresenterende moleculen aan T-cellen gemedieerde immuniteit te initiëren. Dendritische cellen kunnen worden gescheiden in verschillende fenotypisch en functioneel heterogene subgroepen. Drie belangrijke subsets van milt dendritische cellen zijn plasmacytoide, CD8a Pos en CD8a Neg cellen. De plasmacytoïde DCs natuurlijke producenten van type I interferon en zijn belangrijk voor antivirale T cel immuniteit. De CD8a Neg DC deelverzameling is gespecialiseerd voor MHC klasse II antigeen presentatie en is centraal betrokken in priming CD4 T-cellen. De CD8a Pos DCs zijn primair verantwoordelijk voor cross-presentatie van exogene antigenen en CD8 T-cel priming. De CD8a Pos DC aangetoond efficiënt bij de presentatie glycolipide antigenen door CD1d moleculen om een specifieke T cell bevolking bekend als onveranderlijk natural killer T (iNKT) cellen. Toediening van Flt-3-ligand verhoogt de frequentie van migratie van dendritische cellen uit beenmerg progenitoren uiteindelijk resulteert in het vergroten van dendritische cellen in perifere lymfoïde organen in muizenmodellen. We hebben dit model aangepast aan grote aantallen functionele dendritische cellen te zuiveren voor gebruik in celoverdracht experimenten ter vergelijking in vivo vaardigheid van verschillende DC subsets.
Introduction
Dendritische cellen (DC) werden ontdekt bijna veertig jaar geleden als "grote stervormige (Griekse dendron) cel" in lymfoïde organen 1. Vele studies hebben aangetoond dat DCs de enige antigeen presenterende cellen die effectief naïeve T-cellen 2 kunnen stimuleren. Een belangrijke functie van deze cellen is de opname en presentatie van antigenen en de efficiënte verwerking en het laden van deze op antigeen presenterende moleculen. In muis milt, kan DC worden gescheiden in plasmacytoide en conventionele subsets. De plasmacytoide DCs worden gekenmerkt door lage expressie van CD 11 c en een hoog niveau van de B220 en Gr-1. Ze zijn ook positief voor de oppervlakte marker mPDCA1 en scheiden type I interferon in reactie op toll-like receptor 9 (TLR9) liganden. De conventionele DC's zijn hoog voor CD11c en MHC klasse II expressie. Zij kunnen worden verdeeld in drie subgroepen op basis van de oppervlakte-expressie van fenotypische merkers zoals CD4, CD8a, DEC205, CD11b en dendritische celtherapie remmende receptor 2 (DCIR2, erkend door de 33D1-antilichaam) eiwitten 3,4. De CD8a Pos DCs worden ook wel CDC1, zijn positief voor DEC205, maar negatief voor myeloïde merkers zoals CD11b en 33D1. De CD8a Neg DC's, ook wel cdc2, zijn positief voor 33D1, CD11b en CD4, maar gebrek aan DEC205. De dubbele negatieve subgroep (dwz negatief voor zowel CD4 en CD8a) is relatief zeldzaam, en is negatief voor DEC205 en 33D1. Het de minst gekarakteriseerde subgroep en kunnen minder gedifferentieerde vorm van CD8a Neg gelijkstroom.
Fenotypische verschillen in de verschillende DC subsets worden uitgebreid tot de in vivo functies. De CD8a Neg DCs sterk fagocytische en men denkt dat exogeen antigen zetten vooral via MHC klasse II aan CD4 T-cellen 3. In tegenstelling, de CD8a Pos DCs zijn gespecialiseerd voor het aanbrengen van oplosbaar eiwit antigeen op MHC klasse Ieen mechanisme genaamd cross-presentatie. Het resultaat van cross-presentatie is afhankelijk van de activeringsstatus van deze DCs 5, en kan zowel leiden tot uitbreiding van cytotoxische T-cellen (CTL's) of de ontwikkeling van regulerende T-cellen 6 2,7. Targeting van antigeen aan CD8a Pos DCs met behulp van anti-DEC205-antilichaam-gemedieerde levering resultaten grotendeels in de verwijdering van T-cellen 8, terwijl de presentatie van de antigenen afkomstig van geïnfecteerde apoptotische cellen een sterke CTL-respons 9 induceert.
Naast herkenning van peptide-antigenen is het immuunsysteem van zoogdieren ontwikkeld om lipide en glycolipide antigenen herkennen. Deze antigenen worden door CD1 moleculen, die MHC klasse I-achtige celoppervlakte-eiwitten die bestaan in verschillende verwante vormen in diverse zoogdieren. In muizen, één soort sterk geconserveerde CD1 molecuul genaamd CD1d is verantwoordelijk voor de presentatie glycolipide antigenen 10. De burgemeester populatie van T-cellen die CD1d / glycolipide complexen herkennen heet invariante NKT cellen (iNKT cellen). Deze cellen brengen een semi-invariante T-celreceptor (TCR), bestaande uit een invariant TCRα keten die is gekoppeld aan TcR ketens met een beperkte diversiteit 11. In tegenstelling tot conventionele T-cellen die moeten groeien en te differentiëren tot geactiveerde effector-T-cellen, iNKT cellen bestaan als een effector bevolking en begint snel te reageren na glycolipide toediening 12. Identificatie van fysiologisch relevante lipide antigeenpresenterende cellen is een actief gebied van onderzoek en een aantal verschillende celtypes zoals B-cellen, macrofagen en DC's zijn voorgesteld voor deze functie. Er werd aangetoond dat de CD8a Pos subset van DC is de primaire cel medieert opname en presentatie van lipide antigenen muizen- iNKT cellen 13 en glycolipide gemedieerde cross-priming van CD8 T-cellen 14.
ove_content "> Om de efficiëntie van antigeenpresentatie vergelijken met andere antigeenpresenterende cellen, een eenvoudige aanpak is om verschillende gezuiverde APCs gepulst met equivalente hoeveelheden van antigeen in naïeve gastheer. celoverdracht experimenten van dit type worden vaak uitgevoerd voor immunologische studies te dragen. echter, het uitvoeren van overdracht studies ex vivo antigeen behandelde DCs uitdaging, aangezien deze cellen bestaan zeldzame populaties in lymfoïde organen, waar ze minder dan 2% van de totale cellen 15 vormen. daarom moet de ontwikkeling van deze cellen in donordieren verbeteren de efficiëntie van isolatie protocollen te verhogen.Het is bekend dat de gemeenschappelijke lymfoïde en myeloïde voorlopercellen gemeenschappelijke, die nodig zijn voor het genereren van pDC, CD8 en CD8 Pos Neg DC subsets, express fms-gerelateerde tyrosine kinase receptor 3 (Flt-3). Bij het in vivo Flt-3-ligand (Flt-3L) administratie, emigration van Flt-3 tot expressie stamcellen uit beenmerg wordt verhoogd, leidt tot een toegenomen zaaien van perifere lymfoïde organen en de uitbreiding van de rijpe DC 16 nageslacht. Expressie van Flt-3 is verloren tijdens betrokkenheid bij de B, T of NK-celdifferentiatie paden. Daarom worden slechts minimale veranderingen waargenomen in deze cellen op Flt-3L administratie. Vertaald expansie DC populaties waargenomen in muizen die tumoren opgewekt door implantatie van B16-melanoom cellijn afscheidende muis Flt-3L, welke een eenvoudige en economische methode voor het verschaffen van langdurige systemische niveaus van Flt-3L 17,18 bepaalt. Met deze benadering hebben we een protocol gebaseerd op de implantatie van B16-melanoom cellen die Flt-3L de uitbreiding van alle normale DC subsets in muismilt stimuleren, waardoor aanzienlijke verhoging van de opbrengst van deze cellen kunnen worden geïsoleerd voor verdere experimenten ontwikkeld . We consequent vinden dat binnen 10 - 14 dagen na subcutane implantage van de Flt-3 afscheidende tumor, muizen ontwikkelen splenomegalie met duidelijke verrijking van DC tot 40 vormen - 60% van de totale miltcellen. Uit deze milt kunnen verschillende DC subsets worden geïsoleerd met hoge zuiverheid met behulp van standaard in de handel verkrijgbare cel zuivering kits die subgroep-specifieke fenotypische markers in dienst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven worden gedaan in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van de institutionele dierlijke zorg en gebruik commissie (IACUC). Alle procedures die de steriliteit worden uitgevoerd in een bioveiligheid kast.
1. Implantatie van B16.Flt3L Melanoma in Muizen
- Cultuur de Flt-3 expressie brengende B16 melanoma cellijn T25 weefselkweek flessen in een dichtheid van 0,5 x 10 6 cellen / ml in compleet DMEM medium met 10% CO2 bij 37 ° C. Opgroeien tot de cellen te bereiken ~ 90% confluentie (~ 20 uur).
- Oogst de cellen door trypsine digestie. Zuig celcultuur media en was de hechtende cellen met PBS. Voeg 5 ml 0,05% trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Voeg 20 ml koud volledige DMEM medium (4 ° C) bevattende foetaal kalfsserum (FCS) voor de protease digestie blussen. Til de cellen uit door lichtjes op te tikken, gevolgd door voorzichtig en neer te pipetteren.
- Verzamel de cellen door centrifugeren bij 300xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde cellevensvatbaarheid teller. Resuspendeer tot een dichtheid van 10 8 cellen / ml in PBS.
- Implant muizen (C57BL / 6 of een andere histocompatibel stam) met tumorcellen subcutaan zoals beschreven door Machholz et al. 19 aan de basis van de hals met 100 ul celsuspensie (10 7 cellen).
- Laat de tumor te groeien tot voelbare of zichtbare (2-10 mm in diameter, gewoonlijk 7-12 dagen) voor dieren opgeofferd oogstbare organen.
2. Voorbereiding van de milt enkele celsuspensie van Tumor-dragende muizen
- Verdoven muizen met een overdosis van isofluraan (pas stroomsnelheid van isofluraan> 5% en verder exposure minstens 2 minuten na ademhaling stopt). Offer de Flt-3 melanoom tumor dragende muizen door cervicale dislocatie volgens de institutionele richtlijnen voor euthanasie.
- disinfect de huid met 70% ethanol en de oogst milt met behulp van aseptische techniek met behulp van een steriele schaar 20.
- Plaats de milt in een steriele petrischaal voor transport naar de bioveiligheid kast. Voer alle stappen vanaf nu onder steriele omstandigheden.
- Transfer milt om een nieuwe petrischaal en wassen met RPMI medium. Snijd de milt in kleine (~ 0,2 cm 2) delen met een scalpel. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met 10 ml collagenase / DNase oplossing.
- Giet het gedeeltelijk gedigereerde suspensie van miltweefsel op een 70 um cel zeef. Comprimeer het resterende weefsel fragmenten door de mazen van de zeef met een 5 ml spuit zuiger.
- Was het filter met 10 ml vers medium en gooi het filter. Centrifugeer de suspensie bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om de cellen te pelleteren.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 2 ml RBC lysis buffer. Incubeer bij kamertemperatuur fof 10 min. Quench RBC lysisbuffer door toevoeging van 10 ml van volledig RPMI medium.
- Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer in geschikte volume celdichtheid van 10 8 cellen / ml bereiken celsortering buffer (bijv MACS) bevattende 20 ug / ml Fc-block antilichaam (2.4G2).
3. Zuivering van plasmacytoïde DCs, CD8a Pos DCs en CD8a Neg DC's van de milt enkele celsuspensie
Opmerking: Isolatie van milt DC subsets van eencellige suspensie is een meerstaps werkwijze als geïllustreerd in figuur 1 Voer alle stappen met voorgekoelde buffer en een ijswaterbad op temperatuur houden 4 - 8 ° C.. Alle reagensvolumes in het volgende deel van het protocol worden berekend voor een eerste ingang van 200 pl milt celsuspensie bij 10 8 cellen / ml). Dit kan worden opgeschaald ofneer basis van uw probleem door het veranderen van het volume van celsuspensie (altijd in een dichtheid van 1 x 10 8 cellen / ml) en andere reagentia proportioneel in de eerste stap (3.1.1 en 3.2.1). Pas reagens volumes in alle latere stappen dienovereenkomstig. Als bijvoorbeeld beginnend met 100 pl milt celsuspensie bij 1 x 10 8 / ml, gebruikt helft vermelde reagensvolumes bij alle stappen.
- Isolatie van plasmacytoide DCs (PDC)
- Voeg 300 ul met biotine gemerkt antilichaam cocktail die in de plasmacytoide DC isolatie kit 200 gl celsuspensie milt.
- Meng goed en incubeer in ijs waterbad gedurende 15 min. Tik op de buis om de 3 minuten om de cellen in suspensie te houden, en om antilichamen te maximaliseren bindend.
- Voeg 12 ml celsortering buffer en pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Zuig supernatant om niet-gebonden gebiotinyleerde antilichamen te verwijderen.
- Resuspendeer de celpellet in 500 pl buffer celsortering. Voeg 300 gl anti-biotine antilichaam-geconjugeerde kralen. Herhaal stap 3.1.2 en 3.1.3.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 2 ml buffer celsortering. Voer alle stappen van dit punt bij KT met behulp van pre-gekoelde buffers.
- Plaats een nieuw magnetisch geactiveerde celsortering LS kolom in de magnetische stand. Was en equilibreren kolom met 5 ml buffer celsortering.
- Pipetteer de celsuspensie op de kolom, de toepassing voorzichtig naar het midden van het oppervlak van het kolombed. Verzamel de doorstroming.
- Was de kolom met 10 ml buffer celsortering. Verzamelen deze stroom door combineren met doorstroming uit stap 3.1.7. De pDCs zijn verrijkt in deze kolom doorstroom (FT1).
- Pellet de cellen van FT1 door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, resuspendeer in 2 ml celsortering buffer en laat de cellen door een nieuw LS columndoor herhalen van de stappen 3.1.6 - 3.1.8. Dit gebruik van twee opeenvolgende kolommen levert verbeterde zuiverheid van geïsoleerde cellen.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer met 2 ml compleet RPMI. Plaats op ijs totdat het nodig is.
- Isolatie van CD8a Pos en CD8a Neg DCs
Opmerking: De eerste stap in deze procedure depletie van B pDC, T- en NK-cellen.- Beginnend met het volledige milt celsuspensie (1 ml 10 8 cellen / ml verkregen in stap 2,8), voeg 100 ul met biotine geconjugeerd antilichaam cocktail die in de CD8a Pos DC isolatiekit.
- Meng goed en incubeer in ijs waterbad gedurende 15 min. Tik de buis voorzichtig elke 3 min binding van biotine-gelabelde antilichamen maximaliseren hun doelcellen.
- Voeg 12 ml celsortering buffer en pellet van de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. aspireren supernatant om niet-gebonden gebiotinyleerde antilichamen te verwijderen.
- Voeg 150 ul van celsortering buffer en 100 pl anti-biotine korrels die in de CD8a Pos DC isolatiekit. Meng goed en incubeer in ijs waterbad gedurende 15 min.
- Voeg 10 ml celsortering buffer en pellet van de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer cellen in 1 ml celsortering buffer en gaat over een nieuwe LS kolom volgens de procedure in de stappen 3.1.6 tot 3.1.8.
- Verzamel de ongelabelde stroom door 2 (FT2) en gooi de kolom retentaat. Dit ongelabelde fractie wordt verrijkt CD8a Pos en CD8a Neg DCs.
- Pellet de cellen in FT2 door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml celsortering buffer en voeg 200 pl anti-CD8a geconjugeerde magnetische korrels die in de CD8a Pos DC isolatiekit.
- Repeet stappen 3.2.2 tot 3.2.6. De doorstroom van de kolom wordt verrijkt CD8a Neg DCs en verarmd voor CD8a Pos DCs. Dit wordt aangeduid stroming door 3 (FT3).
- Elueerde het CD8a Pos DCs vastgehouden in de kolom, verwijder de kolom uit de magneet, voeg 5 ml celsortering buffer en zuiveren de kolommatrix met de plunjer voorzien van de LS kolom.
- Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig supernatant en resuspendeer in 1 ml celsortering buffer. Om de zuiverheid te verhogen, voert de geëlueerde cellen opnieuw door een nieuwe LS column van herhalen van de stappen 3.1.6 tot 3.1.8, met uitzondering gooi de stroom door en verzamel vastgehouden cellen als in 3.2.11.
- De CD8a Neg DCs zuivert van de FT3 suspensie pellet de FT3 door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer in 300 ul buffer celsortering.
- Voeg 100 ul van anti-CD 11 c magmagnetische kralen. Meng goed en incubeer in ijs waterbad gedurende 15 min.
- Voeg 10 ml celsortering buffer en pellet cellen door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Herhaal de stappen 3.1.5 tot 3.1.8. De CD8a Neg DCs positief geselecteerd met CD11c kralen en zijn gebonden aan de kolom. De doorstroming kan worden weggegooid.
- Elueer de cellen in de kolom vastgehouden zoals beschreven in stap 3.2.11 de gezuiverde CD8a Neg DCs verzamelen.
4. Pulsing APC's met antigenen en Cell Transfer
- Tel de levende cellen na zuivering met behulp van trypan blauw uitsluiting 21 tot levende en dode cellen te onderscheiden.
- Incubeer de cellen met het antigeen gekozen. Gebruik analogen glycolipide antigeen alfa-galactosyl ceramide (αGalCer) en 100 nM concentratie 13. Typisch, plaat 10 6 levensvatbare cellen / putje in compleet RPMI-medium met behulp van ultra-low Attachment U-bodem 96 wells platen op celhechting minimaliseren. Incubeer de cellen in een 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C gedurende 1-4 uur.
- Oogst cellen door enkele malen zachtjes pipetteren. Gebruik wijde boring pipet tips om celbeschadiging van dwarskrachten een minimum te beperken. Was de putjes met PBS en bundelen deze wasbeurten naar cel oogst te maximaliseren.
- Pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de gewenste dichtheid in PBS. Gewoonlijk Injecteer 1 miljoen cellen in 200 gl per ontvanger dier. Houd de cellen op ijs om de levensvatbaarheid voor de toediening te maximaliseren in gastheer dieren.
- Injecteren cellen intraveneus in muizen hetzij via de laterale staart ijdel en de retro-orbitale veneuze plexus 19. Gebruik een 27 G naald op een 1 ml injectiespuit, en injecteer een maximaal volume van 0,1 ml per muis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het resultaat van deze procedure is gebaseerd op de groei van DC subsets van murine Flt-3L door de geïmplanteerde melanoomcellen expressie. De B16.Flt3L tumor werd afgeleid van een C57BL / 6 muis en worden geïmplanteerd in dieren die stamachtergrond om falen van de tumor te vestigen door afstoting te voorkomen. In sommige gevallen kan het gewenst zijn genetisch gemodificeerde muizen om DCs met bekende defecten leiden in signaalwegen of receptoren van belang. Het is belangrijk om in gedachten dat de tumor kan ontwikkelen verschillende kinetiek bij dergelijke dieren te houden, dus is het belangrijk om te controleren tumorgroei gebaseerd op uiterlijk en palpatie op de inoculatie. In onze ervaring, zodra de tumor voelbaar, de B16.Flt3L tumordragende muizen consequent een duidelijke toename in de milt cellulariteit die correleert met uitbreiding van DC subsets (Figuur 2A) vertonen. We doorgaans een 2- tot 3-voudige increase het aantal totale splenocyten verkregen uit B16.Flt3L-melanoom-dragende muizen vergeleken met naïeve dieren. De toename van het aantal DC mede bijdraagt aan de schijnbare vermindering van de frequentie van B-cellen, terwijl er weinig of geen verandering in de absolute aantallen B-cellen. Interessant, terwijl een grote expansie (~ 15- tot 20-voudige toename in de absolute aantallen) wordt waargenomen voor conventionele DCs in deze muizen, er slechts een geringe toename (ongeveer 4-voudig) waargenomen in de plasmacytoide DC deelverzameling.
De gating strategie om verschillende DC subsets identificeren wordt getoond in figuur 2A en is gebaseerd op de expressie van B220, CD 11 b, CD 11 c en CD8a als subreeks-specifieke fenotypische merkers (Figuur 2B). Ook onderzocht DEC205, CD11b en mPDCA1 expressie volgende subsets zie figuur 2B. Dit toont het verwachte patroon, met mPDCA alleen op de pDC deelverzameling, terwijl december 205 is sterk uitgedrukt op CD8a Pos DCs en CD11b is het meest opvallend gedetecteerd op CD8a Neg DCs. We analyseerden ook de veranderingen in cel frequenties voor elk van de subgroepen gezuiverd bij elke stap van het protocol beschreven (samengevat in figuur 2C, gedetailleerde voorbeelden van de flowcytometrische gegevens in Figuur 3). De isolatie van de milt DC subsets beschreven in deze methode is een meerstaps procedure (figuur 1). Zuivering van plasmacytoïde DCs gebaseerd op negatieve selectie om deze cellen te verrijken na uitputting van alle ongewenste bevolkingsgroepen, zoals B, T, NK-cellen en conventionele DCs. Zuivering van de CD8a Pos DCs en CD8a Neg DCs wordt uitgevoerd door positieve selectie van deze cellen na depletie van T-, B- en NK-cellen. De hoge zuiverheid van elk van de DC subsets verkregen met deze werkwijze (meestal ~ 95%) wordt ook weergegeven in figuur 3.
ve_content. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Afhankelijk van de experimenten uit te voeren, kunnen deze cellen worden gepulseerd met een gewenst antigeen en overgebracht in histocompatibele muizengastheren voor immunologische studies Bovendien kunnen deze cellen ook worden gebruikt voor in vivo studies van stimulerende of regulerende activiteiten van fysiologische DC subsets. de cel opbrengst van de gezuiverde DC subsets per 2 x 10 7 splenocyten totaal ongeveer een miljoen pDCs, 2.000.000 CD8a Pos DCs en 4.000.000 CD8a Neg DCs.
Figuur 1. Isolatie van DCs. Een schematische illustratie van de verschillende stappen van het protocol voor isolatie van verschillende subgroepen van DCs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. >
Figuur 2. Analyse van de milt DC subsets in Muizen met B16.Flt3L Tumoren. A) Gating strategie wordt geïllustreerd aan de celpopulaties die overeenkomt met pDCs (R1), CD8a Pos DCs (R5) en CD8a Neg DCs (R6). B) Expressie van mPDCA1, 33D1, DEC205 en CD11b op verschillende subgroepen te identificeren. De cellen in poort R4 (een subset van lymfocyten, negatief voor B220, CD 11 c, CD 11 b) gebruikt als controlepopulatie zonder de expressie van deze markers C) Relatieve verrijking van DC en lymfocyten geïsoleerd uit de milten van muizen op dag. 14 na inoculatie van B16.Flt3L melanoomcellen wordt getoond in de linker grafiek als zwarte balken, terwijl de frequentie van deze celpopulaties in naïeve muizen wordt getoond als witte balken. De juiste plot toont dezelfde gegevens als mobiele nummers.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Analyse van de milt DC subsets Tijdens Enrichment Protocol. A) Verrijking van plasmacytoïde DCs (B220 High and Low CD11c, R1) van 10% in de uitgangspopulatie van splenocyten van B16.Flt3L tumordragende muizen ~ 95% zuiverheid kolom doorstromen 1. Merk op dat cellen geëlueerd uit deze kolom retentaat worden ontdaan van deze populatie. B) Verrijking van conventionele DCs (in CD11c hoge, mengsel van CD8a positieve en negatieve) van ~ 33% in de milt van B16.Flt3L melanoom-dragende muizen op dag 10 na tumor implantatie ~ 78% in de stroom door 2 fractie. In de kolom retentaat 2 percelen, de CD11c positieve populatie lijken parti te zijnally uitgeput, overeenkomend met de verwijdering van grote aantallen DCs tijdens negatieve selectie naar T, B- en NK-cellen te verminderen. Verdere fractionering van de stroom door 2 suspensie op met positieve selectie voor anti-CD8 bindende opbrengst> 95% zuiverheid van CD8a Pos DCs. De doorstroming van deze werd vervolgens onderworpen aan positieve selectie voor de binding van anti-CD 11 c, waardoor een populatie van> 95% zuiver CD8a Negatieve DC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dendritische cellen worden toegelaten tot de grootste professionele antigenpresenterende cellen betrokken bij het priming van T-cel responsen zijn. Hun belangrijkste functie is om het weefsel micro onderzoek van opnemen en verwerken van antigenen voor presentatie aan T-cellen. Om de functie van specifieke DC subsets bestuderen, moeten deze in voldoende aantallen te isoleren Daarbij moet misschien hun normale fenotype en functie handhaaft. De meeste protocollen vertrouwen op de isolatie van specifieke subgroep van DC naïeve muizen. Omdat deze cellen zijn zeldzaam, de isolatie procedures niet efficiënt en op lage aantallen cellen. 1.000.000 CD8 pos DC's, terwijl de meeste experimenten uitgevoerd met overdracht studies gebruiken in ieder geval dit aantal cellen per dier - bijvoorbeeld, zal men milt slechts ongeveer 0,5 opleveren. Dus een belangrijke beperking van de bestaande werkwijzen is het onvermogen om voldoende aantallen cellen te isoleren zonder zeer grote aantallen donor muizen en aanzienlijke volumesreagentia. Onze methode overwint deze problemen door in hoofdzaak bij muizen geïmplanteerd met een Flt-3L uitscheidende tumor bij de DC sterk uit te breiden, zodat zuivering van veel grotere aantallen drie welbekende DC subgroep via een aantal immunomagnetische zuiveringsstappen. De hier beschreven protocol verschaft derhalve een grote verbetering ten opzichte van bestaande werkwijzen qua opbrengst met ten minste enkele vouw.
Enkele restricties aanwezig voor het isoleren protocol beschreven. De belangrijkste beperking is dat de procedure voor de isolatie van deze cellen hun fenotype onbedoeld veranderen. DCs zijn uiterst gevoelig voor endotoxine verontreiniging en mechanische stimuli die kunnen leiden tot veranderingen in fenotype en functie. Een andere beperking van deze techniek is de afhankelijkheid van Flt-3L secretie DC subsets breiden. Dit leidt tot het gebrek aan groei in weefselkweek resident DC subsets die de Flt-3 receptor niet tot expressie brengen.
Deprotocol beschreven voert celverrijking gebruikmaking van commercieel verkrijgbare reagentia. De kit voor isolatie van cellen zuivering heeft een protocol dat de aanbevolen hoeveelheden reagentia bevat te gebruiken. De celsamenstelling van tumordragende muizen aanzienlijk verschilt van die van naïeve muizen (figuur 2C), en daarom hebben we de bedragen aangepast voor reagentia die bij onze techniek om een optimale cel zuiverheid te bereiken. De DCs hechtende cellen en kan niet-specifiek hechten aan de kolom matrix. Equilibratie van de kolom bed met buffer die EDTA minimaliseert celadhesie en het gebruik van seriële passage in twee opeenvolgende kolommen verbetert de cel verder zuiverheid.
DCs zijn zeer hechtende cellen en in vivo algemeen nauw geassocieerd met de extracellulaire weefselmatrix. Om de opbrengst te verhogen, is het zeer belangrijk om de miltweefsel verteren met collagenase en DNase voldoende time een maximaal aantal van deze cellen te extraheren. Het is ook belangrijk om te controleren of de milt weefselfragmenten volledig ondergedompeld in de collagenase / DNase I oplossing onder digestie ondergaan. Een ander kritisch kenmerk van DC isolatie strikte steriliteit en endotoxine-vrije omstandigheden te handhaven tijdens de isolatieprocedure, aangezien deze cellen zeer responsief endotoxine. Gebruik vers bereide reagentia van endotoxine-vrije voorraden, en filter steriliseren alle reagentia voor gebruik. Alle cel isolatie buffers en media moeten worden aangevuld met FCS, dat is gecertificeerd vrij van detecteerbare endotoxine te zijn. Deze cellen zijn ook zeer gevoelig voor mechanische stimuli en herhaalde mechanische stimulatie de maturatie stand van deze cellen verandert. Hoewel sommige mechanische kracht nodig is om het weefsel te dwingen door een cel zeef na collagenase digestie, dient deze zo voorzichtig mogelijk worden uitgevoerd. Bovendien moet krachtig pipetteren van de cellen zo veel mogelijk te bedienen vermedene en wijde boring pipetpunten worden gebruikt om afschuifkrachten te minimaliseren.
De adoptieve overdracht model is bruikbaar voor het onderzoek van antigen presentatie en T-cel priming door middel van specifieke subsets van DCs. Echter is aangetoond in andere studies die overdragen antigeen optreden door antigen gepulseerde DC's endogene DCs. Aldus kan de adaptieve immuunrespons op initiatief van antigeen gepulste cellen presentatie door endogene DCs die de "gevangen" antigeen en niet overgedragen APC weerspiegelen. Deze vorm van overdracht is exponentieel toegenomen als de geïsoleerde DC preparaten bevatten dode of stervende cellen. Daarom is het belangrijk zo snel mogelijk uit te voeren DC isolatie en transfer protocol, gebruik steriele omstandigheden met voorgekoelde buffers celoverleving verbeteren. We kozen voor een relatief korte pulsen antigeen gedurende 4 uur daarom, met incubatie bij lage bindingsaffiniteit celkweekplaten de celhechting tijdens minimaliserendeze stap. Bovendien kan verlengd kweekomstandigheid de maturatiestatus van gekweekte DC wijzigen en kunnen de resultaten van adoptieve overdrachtsexperimenten 22 beïnvloeden.
Samengevat, de dendritische cel biologie is een zeer actief gebied van onderzoek en ontwikkeling van een betrouwbare methode om DCs die een getrouw beeld geven van hun in vivo fenotypische en functionele divergentie biedt een enorme kans om deze cellen te bestuderen genereren. Dit wordt met name belangrijk voor studies met chemische stoffen die DC functies kan moduleren, maar kan niet systemisch worden toegediend in diermodellen. Behandelen van de geïsoleerde DC subsets plaats ex vivo met deze stoffen is een praktische en haalbare aanpak die kan helpen verhelderen de mechanistische gegevens van antigeenpresentatie trajecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH / NIAID subsidie AI45889 naar SAP Flowcytometrie studies met behulp van FACS kernfaciliteiten ondersteund door de Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) en het Center for AIDS Research (NIH / NIAID AI51519) werden uitgevoerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
