Abstract
Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-представляющих клеток, прежде всего, ответственные за сбора, обработки и представления антигенов на антиген-представляющих молекул для инициирования Т-клеточного иммунитета. Дендритные клетки могут быть разделены на несколько фенотипически и функционально разнородных подмножеств. Три важных подмножества селезеночных дендритных клеток плазмоцитов, CD8α Pos и CD8α Neg клетки. В плазмоцитов бездисковые натуральные производители типа интерферона и имеют важное значение для противовирусного Т-клеточного иммунитета. Подмножество CD8α отр DC специализирован для MHC класса II презентации антигена и центрально участвует в грунтования CD4 Т - клеток. CD8α Pos контроллеры домена в первую очередь ответственны за кросс-презентации экзогенных антигенов и клеток грунтования CD8 Т. В CD8α Pos РС были продемонстрированы наиболее эффективным на презентации антигенов гликолипидов молекулами CD1d специализированному Т CELл население известный как инвариант естественных киллеров Т (iNKT) клеток. Введение Flt-3 лиганд увеличивает частоту миграции дендритных клеток-предшественников клеток из костного мозга, в конечном счете, приводит к расширению дендритных клеток в периферических лимфоидных органах в мышиных моделях. Мы адаптировали эту модель , чтобы очистить большое количество функциональных дендритных клеток для использования в экспериментах по передаче клеток для сравнения знания в естественных условиях различных подмножеств DC.
Introduction
Дендритные клетки (ДК) были обнаружены почти сорок лет назад как "большой звездчатые (греческий дендрон) клетка" находится в лимфоидных органах 1. Многие исследования показали , что контроллеры домена являются единственными антиген - представляющих клеток , которые могут эффективно стимулировать наивные Т - клетки 2. Основная функция этих клеток является поглощение и презентацию антигенов и их эффективную обработку и загрузку их на антиген-представляющих молекул. В селезенке мыши, контроллеры домена могут быть разделены на плазмоцитов и обычных подмножеств. В плазмоцитов ДК характеризуются низкой экспрессии CD11c и высоких уровней B220 и Gr-1. Они также являются позитивными для поверхностного маркера mPDCA1 и секретируют типа интерферона в ответ на Толл-подобные рецепторы 9 (TLR9) лигандов. Обычные контроллеры домена являются высокими для CD11c и экспрессии МНС класса II. Они могут быть разделены на три отдельные подмножества на основе поверхностной экспрессии фенотипических маркеров, таких как CD4, CD8α, DEC205, компакт-диск11b и дендритных клеток ингибирующий рецептор 2 (DCIR2, распознается антителом 33D1) белки 3,4. В CD8α Pos контроллеры домена также известны как cDC1, являются позитивными для DEC205, но отрицательный результат для миелоидных маркеров , таких как CD11b и 33D1. CD8α отр контроллеры домена, называемый также Cdc2, являются положительными для 33D1, CD11b и CD4 , но не имеют DEC205. Двойное отрицание подмножество (т.е. отрицательный как для CD4 и CD8α) относительно редко, и является негативной для DEC205 и 33D1. Это наименее отличающееся подмножество и может быть менее дифференцированными форма CD8α Neg DC.
Фенотипические различия в различных подмножеств DC также распространяются на их функции в естественных условиях. CD8α отр контроллеры домена обладают высокой фагоцитарной и , как полагают , чтобы представить экзогенный антиген в основном через МНС класса II к CD4 Т - клеток 3. В противоположность этому , CD8α Pos контроллеры домена специализированы для представления растворимого белкового антигена на MHC класса Iв механизме называется кросс-презентации. Результаты перекрестной презентации зависит от состояния активации этих контроллеров домена 5, и может привести либо к расширению цитотоксических Т - клеток (CTL) или развитие регуляторных Т - клеток , 6 2,7. Нацеливание антигена CD8α Pos ГЦ с использованием анти-DEC205-антителоопосредуемый результатами доставки в основном к удалению Т - клеток , 8, в то время как презентация антигенов , полученных из инфицированных апоптотических клеток индуцирует сильный CTL - ответ 9.
В дополнение к признанию пептидных антигенов, иммунной системы млекопитающих эволюционировала распознавать липидный и гликолипидов антигены. Эти антигены представлены молекулами CD1, которые являются MHC класса I, как белки клеточной поверхности, которые существуют в нескольких связанных форм в различных млекопитающих. У мышей, один тип высококонсервативной молекулы CD1 называется CD1d отвечает за представление гликолипида антигенов 10. Основным популяция Т-клеток, которые распознают CD1d / гликолипидов комплексы называют инвариантными клетки НКТ (iNKT клетки). Эти клетки экспрессируют полуинвариантом Т - клеточного рецептора (TCR) , состоящий из инвариантной TCRα цепи, которая в паре с TCR & beta ; цепи , которые имеют ограниченное разнообразие 11. В отличие от обычных Т - клеток , которые должны размножаться и дифференцироваться , чтобы стать активированные эффекторные Т - клетки, клетки iNKT существуют как эффекторной популяции и начинают быстро отвечать на запросы после введения гликолипидов 12. Идентификация физиологически соответствующих липидный антигенпрезентирующих клеток является активной областью исследований, а также несколько различных типов клеток, таких как В-клетки, макрофаги и ДК было предложено выполнить эту функцию. Тем не менее, было показано , что CD8α Pos подмножество ГЦ является первичной ячейкой опосредовать поглощение и представление липидных антигенов мыши iNKT клетки 13 и гликолипидов опосредованного перекрестного примирования CD8 Т - клеток 14.
ove_content "> Для сравнения эффективности презентации антигена с помощью различных антиген-представляющих клеток, простой подход состоит в передаче различных типов очищенных АРС импульсными с эквивалентными количествами антигена в наивных хозяев. Эксперименты клеточного переноса этого типа часто выполняются для иммунологических исследований. Тем не менее, проведение исследований переноса с экс виво антиген обработанного ГЦ является сложной задачей, так как эти клетки существуют как редкие популяции в лимфоидных органах , где они составляют менее 2% от общего количества клеток 15. поэтому необходимо усилить развитие этих клеток в животных - доноров для повышения эффективности протоколов изоляции.Известно , что общий лимфоидной и миелоидной общие клетки - предшественники, которые необходимы для генерации Pdc, CD8 и Pos подмножеств CD8 отр DC, экспресс - FMS связанных с рецепторной тирозинкиназы 3 (Flt-3). При в естественных условиях Flt-3 лиганд (Flt-3L) введение, emigratион Flt-3 , экспрессирующих клеток - предшественников костного мозга увеличивается, что приводит к увеличению обсеменения периферических лимфоидных органах и расширение их зрелого потомстве DC 16. Выражение FLT-3 теряется во время приверженности B, T или NK путей дифференцировки клеток. Таким образом, лишь минимальные изменения наблюдаются в этих клетках при введении Flt-3L. Подобное расширение в популяциях постоянного тока наблюдается у мышей , несущих опухоли путем имплантации клеточной линии В16-меланома , секретирующих мышиный FLT-3L, который обеспечивает простой и экономичный способ обеспечения устойчивые системные уровни FLT-3L 17,18. Используя этот подход, мы разработали протокол, основанный на имплантации B16-клеток меланомы, секретирующих Flt-3L, чтобы стимулировать расширение всех нормальных подмножеств DC в селезенке мышей, тем самым значительно увеличивая урожаи этих клеток, которые могут быть выделены для последующих экспериментов , Мы последовательно находим, что в течение 10 - 14 дней после подкожного внутримышечноплантация опухоли, секретирующие Flt-3, мыши развивают спленомегалия с выраженным обогащением контроллеров домена составлять 40 - 60% от общего количества клеток селезенки. Из этих селезенке, различные подмножества DC могут быть выделены с высокой степенью чистоты с использованием стандартных коммерчески доступных наборов очистки клеток, которые используют подмножество специфических фенотипических маркеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных проводятся в соответствии с утвержденными руководящими принципами от институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC). Все процедуры, требующие стерильности выполняются в кабинете биологической безопасности.
1. Имплантация B16.Flt3L Меланома у мышей
- Культура Flt-3 экспрессирующих меланомы В16 линию клеток в колбы Т25 для культуры ткани при плотности 0,5 × 10 6 клеток / мл в полной среде DMEM с добавлением 10% СО 2 при 37 ° С. Расти, пока клетки не достигают ~ 90% слияния (~ 20 ч).
- Сбора клеток путем усвоением трипсина. Аспирируйте среды для культивирования клеток и мыть прилипшие клетки с PBS. Добавьте 5 мл 0,05% трипсина и инкубировали в течение 5 мин при 37 ° С. Добавить холодную 20 мл полной среды DMEM (4 ° С), содержащую фетальной телячьей сыворотки (FCS), чтобы погасить перевариванию протеазы. Поднимите клетки от легким постукиванием с последующим осторожно пипеткой вверх и вниз.
- Собирают клетки центрифугированием при 300XG в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Граф клеток с использованием гемоцитометра или автоматического счетчика жизнеспособности клеток. Ресуспендируют до плотности 10 8 клеток / мл в PBS.
- Имплантаты мышей (C57BL / 6 или другой гистосовместимого штамм) с опухолевыми клетками путем подкожной инъекции , как описано Machholz и др. , 19 у основания шеи с помощью 100 мкл суспензии клеток (10 7 клеток).
- Разрешить опухоль расти до осязаемых или видимых (2 - 10 мм в диаметре, обычно 7 - 12 дней) перед жертвоприношением животных для извлечения органов.
2. Получение селезеночной одноклеточной суспензии от опухоли мышей, несущих
- Обезболить мышей с передозировкой изофлуран (отрегулировать скорость потока изофлуран к> 5% и по-прежнему экспозиции по крайней мере, через 2 мин после остановки дыхания). Жертвуют Flt-3 опухоли меланома мыши подшипника шейки дислокации в соответствии с ведомственным руководящим принципам для эвтаназии.
- диsinfect кожу с 70% этанола и урожая селезенки с использованием асептической техники с помощью стерильных ножниц 20.
- Поместите селезенку в стерильную чашку Петри для транспортировки в шкафу биологической безопасности. Выполните все шаги от здесь в стерильных условиях.
- Передача селезенку в свежую чашку Петри и промывают RPMI средой. Вырезать селезенку на мелкие (~ 0,2 см 2) части , используя скальпель. Инкубировать в течение 30 мин при температуре 37 ° С с 10 мл коллагеназы / ДНКазы раствора.
- Налейте частично переваренной суспензии ткани селезенки на клеточный фильтр 70 мкм. Сжать оставшиеся фрагменты ткани через сетку сетчатого фильтра с помощью шприца 5 мл.
- Промыть сетчатый фильтр с 10 мл свежей среды и выбросить фильтр. Центрифуга суспензии при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов. Инкубировать при RT Fили 10 мин. Гасят буфер для лизиса эритроцитов путем добавления 10 мл полной среды RPMI.
- Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют в соответствующем объеме для достижения плотности клеток 10 8 клеток / мл в буфере сортировки клеток (например, MACS) , содержащей 20 мкг / мл Fc-блока антитела (2.4G2).
3. Очистка плазмоцитов, контроллеры домена CD8α Pos ГЦ и CD8α Neg контроллеры домена от селезеночной одноклеточной суспензии
Примечание: Выделение селезеночной подмножеств DC от одной клеточной суспензии является процедура многоступенчатая , как показано на рисунке 1 Выполните все шаги с использованием предварительно охлажденного буфера и водяной бане лед для поддержания температуры на 4 - 8 ° C.. Все объемы реагента в следующем разделе протокола рассчитаны на первоначальный ввод 200 мкл суспензии клеток селезенки в 10 8 клеток / мл). Это может быть увеличен илипонижаться в зависимости от Вашей потребности путем изменения объема клеточной суспензии (всегда при плотности 1 х 10 8 клеток / мл) и другие реагенты пропорционально на начальном этапе (3.1.1 и 3.2.1). Отрегулируйте объемы реагентов во всех последующих этапах соответственно. Например, если , начиная с 100 мкл суспензии клеток селезенки при напряжении 1 х 10 8 / мл, используют половину объемов реагентов , указанных на всех этапах.
- Выделение плазмоцитов контроллеров домена (PDC)
- Добавьте 300 мкл меченных биотином коктейль антител можно найти в комплекте изоляции плазмоцитов DC к 200 мкл суспензии клеток селезенки.
- Тщательно перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин. Нажмите пробирку каждые 3 мин, чтобы держать клетки приостановленных и максимизировать связывание антитела.
- Добавить 12 мл буфера сортировки клеток и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Отберите супернатант для удаления несвязанных биотинилированных антител.
- Ресуспендируют клеткиосадок в 500 мкл буфера для сортировки клеток. Добавьте 300 мкл анти-биотин антитела конъюгированные с бусинами. Повторите шаг 3.1.2 и 3.1.3.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера сортировки клеток. Выполните все шаги, начиная с этого момента при комнатной температуре с использованием предварительно охлажденный буферов.
- Поместите свежий магнитный активированный сортировки клеток колонку LS в магнитном стенде. Промыть и уравновешивают колонку с 5 мл буфера сортировки клеток.
- Пипетировать клеточной суспензии на колонку, применяя его осторожно к центру поверхности слоя колонны. Собирают поток через.
- Промыть колонку с 10 мл буфера сортировки клеток. Собирают этот поток через и объединить с потоком через с этапа 3.1.7. В PDCs обогащены в этом потоке через колонку (FT1).
- Гранул клетки из FT1 центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С, в Ресуспендируют 2 буфере сортировочного мл клеток и проходят клетки через свежий колонки LSповторяя шаги 3.1.6 - 3.1.8. Это использование двух последовательных колонках дает повышенную чистоту изолированных клеток.
- Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют с 2 мл полной RPMI. Место на льду, пока не понадобится.
- Выделение CD8α Pos и CD8α Neg ГЦ
Примечание: Первым шагом в этой процедуре является истощение B, Pdc, Т и NK-клеток.- Начиная со всей суспензии клеток селезенки (1 мл 10 8 клеток / мл , полученной на стадии 2.8), добавляют 100 мкл биотин-конъюгированные смесь антител можно найти в комплекте изоляции CD8α Поз DC.
- Хорошо перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин. Нажмите трубу на мягко через каждые 3 мин, чтобы максимизировать связывание меченного биотином антитела к их клетки-мишени.
- Добавить 12 мл буфера сортировки клеток и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Отберите суперплавучий для удаления несвязанных биотинилированных антител.
- Добавьте 150 мкл буфера сортировки клеток и 100 мкл анти-биотин шариков , предусмотренных в комплекте изоляции CD8α Pos DC. Хорошо перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин.
- Добавляют 10 мл буфера сортировки клеток и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
- Ресуспендируют клеток в буфере сортировки 1 мл клеток и перейти на свежую колонку LS в соответствии с процедурой, описанной в шагах 3.1.6 через 3.1.8.
- Соберите немеченого поток через 2 (FT2) и удалите столбец ретентата. Эта непомеченная фракция обогащена для CD8α Pos и CD8α Neg контроллеры домена.
- Гранул клетки в FT2 центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
- Ресуспендируют клеток в буфере сортировки 1 мл клеток и добавляют 200 мкл анти-CD8α конъюгированных магнитных шариков можно найти в комплекте изоляции CD8α Pos DC.
- репседят шаги 3.2.2 через 3.2.6. Поток через колонку обогащена CD8α Neg контроллеров домена и обедненного для CD8α Pos контроллеров домена. Это помечена поток через 3 (FT3).
- Для элюирования CD8α Поз контроллеры домена сохраняется в колонке, удалить столбец из магнита, добавляют 5 мл буфера сортировки клеток и очистить матрицу столбцов , используя поршень , снабженный колонки LS.
- Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Отберите супернатант и ресуспендируют в буфере сортировки 1 мл клеток. Для повышения чистоты, запустить элюированный клетки снова через свежий колонки LS, повторяя шаги 3.1.6 на 3.1.8, за исключением того, отбросить поток через и собирают нераспределенной клетки как в 3.2.11.
- Для очистки CD8α Neg контроллеры домена из FT3 подвески, осаждени FT3 центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 300 мкл буфера для сортировки клеток.
- Добавьте 100 мкл анти-CD11c МАГмагнитные шарики. Хорошо перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин.
- Добавить 10 мл буфера сортировки клеток и гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
- Повторите шаги 3.1.5 через 3.1.8. CD8α отр ДК положительно выбраны с CD11c бус и привязаны к колонке. Поток через может быть отброшен.
- Элюируйте клетки , сохраняемых в колонке , как описано в шаге 3.2.11 для сбора очищенного CD8α Neg ДКБ.
4. Пульсирующий БТРы с антигенами и Cell Transfer
- Подсчитывают живые клетки после очистки с использованием трипанового синего 21 , чтобы отличить живых и мертвых клеток.
- Инкубируйте клетки с антигеном выбора. Используйте аналоги гликолипида антигена называется альфа-галактозил керамиды (αGalCer) при концентрации 100 нМ 13. Как правило, пластина 10 6 жизнеспособных клеток / лунку в полной среде RPMI с использованием ультра-низким АТТАКhment U-дном 96-луночные планшеты для минимизации прикрепление клеток. Инкубацию клеток в атмосфере 5% СО 2 при 37 ° С в течение 1 - 4 ч.
- Урожай клетки осторожно пипеткой несколько раз. Используйте широкие подсказки отверстие пипетки, чтобы минимизировать повреждения клеток от поперечных сил. Вымойте скважин с PBS и объединить эти промывок, чтобы максимизировать урожай клеток.
- Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют до желаемой плотности в PBS. Как правило, вводят 1 миллион клеток в 200 мкл на животного-реципиента. Держите клетки на льду, чтобы максимизировать жизнеспособность перед введением в животных-хозяев.
- Вводят клетки внутривенно мышам либо через латеральную хвостовую напрасными или ретро-орбитального венозного сплетения 19. С помощью 27 г иглы на шприц емкостью 1 мл, и вводят максимальный объем 0,1 мл на мышь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результатом этой процедуры зависит от расширения подмножеств DC мышиным Flt-3L, выраженной имплантированных клеток меланомы. Опухоль B16.Flt3L была получена из C57BL / 6 мышей, и должны быть имплантированы животным с этим штаммом фон для того, чтобы избежать выхода из строя опухоли укоренились, из-за отказа. В некоторых случаях может быть желательным использование генетически модифицированных мышей для получения ОДК известными дефектами сигнальных путей или рецепторов, представляющих интерес. Важно иметь в виду, что опухоль может развиваться с различной кинетикой в таких животных, поэтому важно следить за рост опухоли на основе внешнего вида и пальпации на месте прививки. По нашему опыту, как только опухоль ощутима, опухоль B16.Flt3L мышей , несущих последовательно показывают заметное увеличение селезеночного клеточности , что коррелирует с расширением всех подмножеств постоянного тока (рис 2А). Как правило, мы видим 2-х до 3-кратного повые числа общих спленоцитов, полученных от B16.Flt3L меланомой мышей, несущих по сравнению с наивных животных. Увеличение числа DC частично способствует явное снижение частоты В-клеток, в то время как имеется практически нет изменение абсолютного числа В-клеток. Интересно, что в то время как значительное расширение (~ 15- до 20-кратного увеличения в абсолютных цифрах) наблюдается для обычных ГЦ у этих мышей, есть только небольшое увеличение (около 4 раза) наблюдается в плазмоцитов подмножества DC.
Стратегия стробирования для идентификации различных подмножеств DC показана на рисунке 2А и основана на экспрессию B220, CD11b, CD11c и CD8α как подмножество конкретных фенотипических маркеров (рис 2В). Мы также исследовали DEC205, CD11b и экспрессию mPDCA1 на этих подмножеств , как показано на рисунке 2B. Это показывает ожидаемую картину, с mPDCA только на подмножестве Pdc, в то время как DEC 205 выражается высоко на CD8α Pos РС и CD11b обнаруживается наиболее заметно на CD8α Neg контроллеры домена. Мы также проанализировали изменения в частотах клеток для каждого из подмножеств очищенных на каждом шаге протокола , описанного здесь (схематично представлены на рисунке 2С, с подробными примерами данных проточной цитометрии на рисунке 3). Выделение селезеночной подмножеств DC , описанных в этом методе является процедура многоступенчатая (Рисунок 1). Очистка плазмоцитов контроллеров домена зависит от негативной селекции для обогащения этих клеток после истощения всех нежелательных групп населения, таких как B, T, NK-клетки и обычные контроллеры домена. Очистка CD8α Pos РС, и CD8α Neg контроллеров домена осуществляется позитивной селекции этих клеток после истощения Т, В и NK - клеток. Высокая чистота каждого из подмножеств DC , полученный с помощью этой процедуры (обычно ~ 95%) также показано на фиг.3.
ve_content. "ВОК: Keep-together.within-страницы =" 1 "> В зависимости от экспериментов, которые будут выполнены, эти клетки могут быть импульсным с желаемым антигеном и переносили в гистосовместимого мышиных хозяев для иммунологических исследований Кроме того, эти клетки могут также использоваться для исследований в естественных условиях стимулирующих или регуляторной деятельности физиологических подмножеств DC. Выход клеток для очищенных подмножеств DC на 2 х 10 7 общих спленоцитов приблизительно один миллион PDCs, 2 миллиона CD8α Pos контроллеры домена и 4 миллиона CD8α отр контроллеры домена.
Рисунок 1. Выделение контроллеров домена. Схема , иллюстрирующая различные этапы протокола для выделения различных подмножеств контроллеров домена. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. >
Рисунок 2. Анализ селезеночной DC подмножествах у мышей с B16.Flt3L опухолям. А) стратегия Gating показана для выявления клеточных популяций соответствующих PDCs (R1), CD8α Pos РС (R5) и CD8α Neg контроллеров домена (R6). B) Выражение mPDCA1, 33D1, DEC205 и CD11b на различных подмножеств. Клетки , содержащиеся в затворе R4 (подмножество лимфоцитов , а отрицательные для B220, CD11c, CD11b) используются в качестве контрольной популяции , лишенного экспрессию этих маркеров C) относительное обогащение DC и субпопуляций лимфоцитов , выделенных из селезенки мышей в день. 14 после прививки B16.Flt3L клеток меланомы показана на левом графике в виде черных полос, в то время как частота этих клеточных популяций в наивных мышей показано в виде белых баров. Правый график отображает те же данные, что и числа клеток.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Анализ селезеночной DC подмножествах При обогащении протокола. А) Обогащение плазмоцитов РС (B220 High и Low CD11c, R1) с 10% в исходной популяции спленоцитов от опухоли B16.Flt3L мышей , несущих до ~ 95% чистоты в колонке потока через 1. Обратите внимание , что ретентат клетки , элюированные из колонки истощаются этой популяции. B) Обогащение обычных контроллеров домена (в CD11c High, смесь CD8α положительных и отрицательных) от ~ 33% в селезенке B16.Flt3L меланому мышей , несущих на 10 -й день после имплантации опухоли до ~ 78% в поток через 2 фракции. В столбце ретентат 2 участков, то CD11c положительные популяции, как представляется, партисоюзницей истощены, что соответствует удалению значительного числа контроллеров домена во время отрицательного отбора истощать T, B и NK-клетки. Дальнейшее фракционирование потока через 2 подвески с использованием позитивной селекции для анти-CD8 связывания выходов> 95% чистота CD8α Pos ГЦ. Поток через от этого затем подвергали позитивной селекции для связывания анти-CD11c, получая популяцию> 95% чистого CD8α отр ДКБ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дендритные клетки принимаются быть основным профессиональным антигенпрезентирующая клеток, участвующих в грунтования Т-клеточных ответов. Их основная функция состоит в обследовании микросреду тканей путем принятия и обработки антигенов для презентации Т-клеткам. Для изучения функции специфических подмножеств DC, они должны быть выделены в достаточном количестве, используя подход, который поддерживает их нормальный фенотип и функции. Большинство протоколов полагаться на изоляцию конкретного подмножества постоянного тока от наивных мышей. Так как эти клетки являются редкими, изоляции процедур не являются эффективными и дают низкие количества клеток. Например, один селезенка будет давать лишь около 0,5 - 1 миллион CD8 поз ОХН, в то время как большинство экспериментов , выполненных с исследованиями передачи используют , по меньшей мере такое количество клеток на животное. Таким образом, основным ограничением существующих методов является невозможность выделить достаточное количество клеток без использования очень большого числа мышей-доноров и значительных объемовреагентов. Наш метод по существу преодолевает эти проблемы с помощью мыши, имплантируются с секретирующей опухолью Flt-3L значительно расширить контроллеры домена, что позволяет очистку гораздо большего числа трех хорошо узнаваемым подмножества DC с использованием ряда иммуномагнитных стадий очистки. Таким образом, протокол, описанный здесь, обеспечивает значительное улучшение по сравнению с существующими методами с точки зрения доходности, по крайней мере, в несколько раз.
существует несколько предостережений для протокола изоляции, описанной здесь. Основным недостатком является то, что процедура, используемая для выделения этих клеток может непреднамеренно изменить их фенотип. Контроллеры домена изысканно чувствительны к загрязнению эндотоксина и механические раздражители, которые могут привести к изменениям в их фенотипа и функции. Другим ограничением этой методики является опора на секрецию Flt-3L расширить DC подмножеств. Это приводит к отсутствию расширения в резидентных ткани DC подмножеств, которые не экспрессируют рецептор Flt-3.
Протокол, описанный здесь, основан на обогащении клеток с использованием коммерчески доступных реагентов. Набор для выделения очистки клеток поставляется с протоколом, который содержит рекомендуемое объемы реагентов, используемых. Состав клеток опухоли мышей , несущих резко отличается от таковой простых мышей (фиг.2С), и , следовательно , мы модифицировали суммы для реагентов , используемых в нашей методике , с тем , чтобы достичь оптимальной чистоты клеток. ДКС являются прилипшие клетки и могут прикрепить к матрице столбца неспецифически. Уравновешивание слой колонки с буфером, содержащим ЭДТА минимизирует присоединение клеток, а также использование последовательного прохождения в течение двух следующих друг за другом столбцов улучшает чистоту клеток далее.
Контроллеры домена являются весьма прилипшие клетки и в естественных условиях , как правило , тесно связаны с матрицей внеклеточной ткани. Для повышения урожайности, что очень важно для переваривания ткани селезенки с коллагеназой и ДНКазой в течение достаточного Тимуе извлечь максимальное число этих клеток. Важно также, чтобы убедиться, что фрагменты ткани селезенки полностью погружены в раствор коллагеназы / ДНКазы I, подвергаясь пищеварение. Еще одна важная особенность изоляции DC является поддержание строгой стерильности и эндотоксина условия во время процедуры изоляции, так как эти клетки обладают высокой эндотоксина отзывчивыми. Используйте свежеприготовленные реагенты из эндотоксина запасов и фильтр стерилизовать все реагенты перед использованием. Все буферы выделения клеток и средства массовой информации должны быть дополнены FCS, сертифицированном быть свободным обнаруживаемого эндотоксина. Эти клетки также очень чувствительны к механическим стимулам и многократного механического раздражения может привести к изменению состояния созревания этих клеток. Хотя некоторые механическая сила требуется, чтобы заставить ткани через сито клеток после коллагеназы, это должно быть сделано как можно более осторожно. Кроме того, энергичные пипетирования клеток следует избегать, насколько possiblе, и с широким отверстием для пипеток следует использовать для минимизации сил сдвига.
Модель усыновитель передачи полезна для исследования антигена и клеточного примирования Т специфическими подмножеств ГЦ. Тем не менее, это было продемонстрировано в других исследованиях, что передача антигена может происходить из антигенов импульсно ГЦ к эндогенным ГЦ. Таким образом, адаптивный иммунный ответ спровоцирована антиген импульсно клеток может отражать презентацию эндогенных ГЦ, представляющих "захваченный" антиген и не то, что перенесенной APC. Этот вид передачи экспоненциально возрастает, если отдельные препараты звена постоянного тока содержат мертвые или умирающие клетки. Поэтому важно осуществлять изоляцию и протокол передачи постоянного тока как можно быстрее, используя стерильные условия с предварительно охлажденный буферов для повышения выживаемости клеток. Мы выбрали относительно короткий период антиген пульсацию 4 ч по этой причине, при инкубации в низких пластин связывания клеточных культур, чтобы минимизировать прикрепление клеток во времяэтот шаг. Кроме того, расширенные условия культивирования могут изменить статус созревания культурных ГЦ, и может повлиять на исход приемными экспериментов 22 передачи.
Таким образом, дендритные клетки биологии является очень активной областью исследований, а также разработка надежного метода для создания контроллеров домена , которые точно отражают их фенотипические в естественных условиях и функциональная дивергенция дает огромные возможности для изучения этих клеток. Это становится особенно важным для исследований, связанных с химическими веществами, которые могут модулировать функции постоянного тока, но не может быть введен системно в моделях на животных. Лечение выделенных подмножеств DC интересов экс естественных условиях с этими химикатами является практическим и осуществимый подход , который может помочь пролить свет на механистические детали презентации антигена путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH / NIAID грант AI45889 к сокодвижение цитометрии исследования проводились с использованием основных объектов FACS при поддержке онкологического центра Эйнштейна (NIH / NCI CA013330) и Центра исследований СПИДа (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
