Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Glaucoma de inducir en un Procedimiento Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

Abstract

El glaucoma es una enfermedad del sistema nervioso central que afecta a las células ganglionares de la retina (CGR). RGC axones que forman el nervio óptico llevan la información visual al cerebro para su percepción visual. El daño a la CGR y sus axones conduce a la pérdida de la visión y / o ceguera. Aunque la causa específica del glaucoma es desconocido, el principal factor de riesgo para la enfermedad es una presión intraocular elevada. procedimientos de inducción de glaucoma en modelos animales son una herramienta valiosa para los investigadores que estudian el mecanismo de la muerte de CGR. Dicha información puede conducir al desarrollo de tratamientos neuroprotectores eficaces que podrían ayudar en la prevención de la pérdida de la visión. El protocolo en este documento se describe un método para inducir el glaucoma - al igual que las condiciones en un modelo de rata in vivo en 50 l de 2 M de solución salina hipertónica se inyecta en el plexo venoso epiescleral. El blanqueo de los vasos indica inyección con éxito. Este procedimiento provoca la pérdida de la CGR para simular el glaucoma. Un mes siguienteinyección, los animales son sacrificados y los ojos son removidos. A continuación, la córnea, el cristalino y vítreo se retiran para hacer una ojera. La retina se desprende entonces de la parte posterior del ojo y inmovilizó en placas de Sylgard con agujas de cactus. En este punto, las neuronas de la retina se pueden teñir para su análisis. Los resultados de esta práctica de laboratorio muestran que aproximadamente el 25% de la CGR se pierden dentro de un mes del procedimiento en comparación con los controles internos. Este procedimiento permite el análisis cuantitativo de la muerte de células ganglionares de la retina en un modelo de rata in vivo glaucoma.

Introduction

El glaucoma es un grupo de enfermedades oculares que afectan a las neuronas de la retina, en concreto, las células ganglionares de la retina 1-2. Los axones de estas células convergen para convertirse en el nervio óptico lleva la información visual al cerebro donde se percibe la visión. El daño a la CGR y sus axones, por tanto, causa defectos visuales.

Las características principales asociados con trastornos de glaucoma son RGC degeneración y la muerte, aumento de la presión intraocular (IOP), y cupping disco óptico y atrofia. Estas características conducen a la pérdida del campo visual o completa, la ceguera irreversible. En la actualidad, el glaucoma ha causado la ceguera en 70 millones de personas en el mundo 3. Como tal, es la tercera mayor causa mundial de ceguera 4.

Se desconoce el mecanismo exacto de la muerte de CGR en el glaucoma. Muchas investigaciones se han hecho para resolver el misterio. Se sabe, sin embargo, que el principal factor de riesgo de glaucoma es un aumento in de la presión intraocular debido a la circulación irregular de humor acuoso (AH) en la cámara anterior del ojo. AH actúa como reemplazo transparente e incoloro para la sangre en la cámara anterior avascular del ojo. Nutre las células circundantes, elimina los productos de desecho secretados a partir de los procesos metabólicos, transporta los neurotransmisores, y permite la circulación de drogas y células inflamatorias dentro del ojo durante los estados patológicos 1.

El mantenimiento de la circulación del humor acuoso implica el cuerpo ciliar y la malla trabecular. El humor acuoso es producido por el cuerpo ciliar. A continuación, fluye en la cámara anterior para mantener la salud general del tejido ocular. 75 a 80% de salida de humor acuoso es secretado activamente a través de epitelio ciliar no pigmentario cuando el fluido se filtra a través de tres capas de tejido esponjoso en el músculo ciliar. Las salidas de fluido a través de la malla trabecular y a través del canal de Schlemm, que adelantarseIES en el sistema sanguíneo 5 .El restante 20 a 25% del flujo de salida pasa por la malla trabecular y se pasivamente secretadas por ultrafiltración y difusión a través de la vía uveo-escleral. Esta vía parece ser relativamente independiente de la presión intraocular 1.

Cuando la producción de humor acuoso y la salida están fuera de equilibrio, aumenta la presión dentro del ojo. Como se ha indicado, este aumento de la presión intraocular es el principal factor de riesgo en el desarrollo de glaucoma. Esta presión causa daño a las intrincadas capas de neuronas de la retina en la parte posterior del ojo. El daño a los axones de las células ganglionares de la retina del nervio óptico hace que el cerebro ya no recibe información visual precisa. Como resultado, la percepción de la visión se pierde y se puede producir ceguera completa.

Hasta la fecha, no existe una cura para el glaucoma. Existen diferentes métodos de tratamiento que principalmente tienen como objetivo reducir la presión intraocular. Estos incluyen la administración tópicaclases de medicamentos tales como bloqueadores de los receptores beta1-adrenérgicos, o análogos de las prostaglandinas tópicas. Los bloqueadores beta reducen la presión intraocular al disminuir la producción de humor acuoso 7. Las prostaglandinas función para reducir la PIO mediante el aumento del flujo de salida de humor acuoso 8-14. agonistas adrenérgicos alfa y los inhibidores de la anhidrasa carbónica se utilizan también como métodos secundarios de tratamiento. Agonistas alfa adrenérgicos aumentan flujo de salida a través de la vía uveoescleral 15-17. Inhibidores de la anhidrasa carbónica reducen la producción de AH por la inhibición enzimática 18. Mucho más procedimientos invasivos también están siendo utilizados para tratar el glaucoma. Trabeculoplastia láser se utiliza para aumentar el flujo de salida del humor acuoso 19. Otra terapia quirúrgica, llamada trabeculectomía, crea un sitio de drenaje alternativo para filtrar AH cuando la vía trabecular tradicional es bloqueado 20-21.

Estas opciones de tratamiento han sido conocidos por efcaz reducir la PIO. Sin embargo, hasta el 40% de los pacientes con glaucoma muestran niveles normales de PIO que indican una necesidad de procedimientos terapéuticos más completos. 22,23 Además, la muerte de células ganglionares de la retina se ve en el glaucoma es irreversible una vez que comienza y los tratamientos actuales no se detienen la progresión de la enfermedad 24-28. Esto ha puesto de relieve la necesidad de tratamientos neuroprotectores eficaces destinadas a la supervivencia de las neuronas mismas. Desarrollo de modelos de glaucoma es crucial para este desarrollo.

En este estudio estamos demostrando un método de inducir efectos glaucoma-como en ratas Long Evans adultas utilizando un procedimiento modificado descrito originalmente por Morrison 29. En este procedimiento, las inyecciones de 2 M de solución salina hipertónica en el plexo venoso episcleral induce condiciones glaucoma-como por la cicatrización de tejido para reducir la salida de humor acuoso en la malla trabecular que conduce a un aumento de la presión intraocular y una pérdida significativa de CGR wentro de un mes tras el procedimiento 30-31. procedimientos de inducción de glaucoma, tales como la descrita aquí, puede ser la clave para desbloquear los nuevos avances en los tratamientos para el glaucoma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los procedimientos que utilizan los sujetos animales han estado de acuerdo con las normas del Instituto de Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Western Michigan.

1. Los animales

  1. Usar ratas macho y hembra de 3 meses de edad en este estudio.
  2. Mantener a los animales en un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad, con acceso libre a comida y agua.

2. Preparación de KAX Cocktail para anestesia animales

  1. Disolver 50 mg de xilazina (20 mg / ml) en 5 ml de ketamina (100 mg / ml) con 1 ml de acepromazina (10 mg / ml) y 3 ml de agua destilada. Mezclar bien.
  2. Esterilizar con un filtro de jeringa y almacenar esta solución en una botella de suero de 10 ml.

3. Inyección KAX

  1. Pesar animales (g) y volver a la jaula hasta que esté listo para la inyección.
  2. Inyectar 0,1 ml KAX / 100 g de peso corporal de los animales por vía intraperitoneal, usando una jeringa de 1 ml de insulina con una aguja de 28 G.
  3. Permitirpara animales de pérdida de conocimiento. Compruebe reflejos pellizcando los pies y la cola.
  4. Mantenga todos los animales de forma segura en el laboratorio para la duración de la cirugía.
  5. Después de la cirugía, en lugar de los animales en sus jaulas y se mantiene cómodo en TA hasta que se recupere la conciencia. Sólo los animales regresar a las instalaciones cuando los animales se despiertan y reanudar un comportamiento normal.

4. Preparación para la cirugía y la Asamblea de Microneedle

  1. Hacer una solución estéril 2 M NaCl.
  2. Al usar un extractor de microelectrodos (Figura 1C) para tirar de un diámetro interior de 0,86 mm estándar de pulido pesado y tubo de borosilicato de pared fina en dos microagujas de vidrio finamente cónicos (Figura 1D, 1E Figura).
  3. Rellene una microaguja de la etapa anterior con 2 M de solución salina usando una aguja de jeringa de relleno y una jeringa de 1 ml (Figura 1B). Toque las burbujas de aire de la punta del electrodo.
  4. Llene una segunda jeringa de 1 ml con 2 MNaCl. Conectar una aguja de 18 G y luego coloque una longitud (aproximadamente 10 pulgadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Utilice el émbolo de la jeringa para llenar el tubo de polietileno con solución salina a través de la aguja.
  5. Cuando tanto la microaguja y el tubo se llena con solución salina, conecte cuidadosamente los dos. Eliminar el aire en la conexión entre ellos (Figura 2).
  6. Finamente biselar la punta de la microaguja raspando muy a la ligera a contrapelo de una toalla de papel por supuesto.
  7. Comprobar la resistencia de la microaguja empujando suavemente el émbolo de la jeringa hasta que un fino chorro de líquido se puede ver en la toalla de papel. La corriente de líquido no debe ser más ancha que 0,5 mm.

5. Preparación de los Animales

  1. Aplicar 1 - 2 gotas de anestesia tópica a la córnea (Proparacaína Solución Oftálmica clorhidrato, USP, 0,5%). Esperar hasta que se produzca ningún reflejo ocular.
  2. Recortar los bigotes con unas tijeras.
  3. Saturate un aplicador con punta de algodón con solución de betadine y el área hisopo alrededor del ojo experimental.
  4. Usando un microscopio, adjuntar una pinza hemostática para sujetar el párpado inferior para sobresalir del ojo, exponer la vena episcleral y restringir el movimiento de los ojos. (Figura 3, punta de flecha)

6. Glaucoma inductor de inyección de solución salina

  1. Cuando se preparan el conjunto de microagujas y el animal, comenzar las inyecciones.
  2. Cuando el animal se confirmó que no responden a la pizca pies / cola, perforar cuidadosamente la vena epiescleral con la microaguja al venir en un ángulo de entre 10 y 20 grados a la vena (Figura 3, flecha blanca). Una punción éxito en la vena es evidente cuando la sangre entra en la punta de la microaguja (Figura 3, flecha negro).
  3. Poco a poco y de forma manual inyectar aproximadamente 50 l de solución salina en la vena. Esto debe tomar aproximadamente 10 seg. Las venas se blanquean blanco como la sal circula excelentes referenciasuf la vasculatura (Figura 4, punta de flecha). Algunas regiones pueden mantener una apariencia de glóbulos rojos (Figura 4, flecha).
    1. Realizar una segunda inyección en la vena, frente al sitio de la primera, para asegurar daño en la retina a fondo para la capa de células ganglionares de la retina completa.
      Nota: En cuestión de minutos, uno debería ver un aspecto turbio distinta a través del iris del ojo como la sal circula a través del sistema vascular.
  4. Deje el ojo opuesto no tratada para su uso como un control interno.

7. Recuperación de Animales

  1. Retire la pinza hemostática.
  2. Use un hisopo de algodón para aplicar el ungüento antibiótico triple (bacitracina de zinc, sulfato de neomicina, sulfato de polymysin B) al sitio sujeta por la pinza hemostática y de los puntos de inyección. daño a los tejidos alrededor del ojo no se produce utilizando la pinza hemostática.
  3. > Poner a los animales anestesiados en sus jaulas en una manta de agua caliente que circula a prevla hipotermia ent. Mantener a los animales en observación hasta que la conciencia y el comportamiento normal se recuperaron. El transporte de animales despiertos de nuevo a la colonia de animales. Los animales permanecen en la colonia hasta el momento del sacrificio.

8. El sacrificio de animales y la eliminación de la retina

  1. Un mes después del procedimiento para inducir el glaucoma, los animales son sacrificados por asfixia con CO2 y la punción torácica secundaria.
    1. Colocar el animal en la cámara y poner la tapa en forma segura.
    2. Abrir las de CO 2 y el regulador de gas válvulas para permitir que el 20% de volumen / min CO2 desplazamiento de oxígeno en la cámara.
    3. Permitir cuatro a 5 min para el animal a punto de expirar.
    4. Desactivar las dos válvulas.
    5. Eliminar los animales de la cámara y realizar una punción torácica secundaria con un bisturí estéril.
  2. Después de la eutanasia, utilizar un bisturí para cortar el tejido conectivo en la cavidad orbital que rodea el ojo, being cuidado de no cortar en el propio globo ocular.
  3. Con cuidado, usar tijeras de borde curvado para cortar el nervio óptico y cualquier tejido restante para extraer el globo ocular intacta. Coloque globo ocular extraída en un 60 mm x 15 mm placa de Petri estéril desechable que contiene PBS fresca.
  4. Hacer una ojera del globo ocular. Para ello, hacer una pequeña incisión con el bisturí justo posterior a la frontera entre el iris y la esclerótica. Siga esta incisión alrededor de la circunferencia del ojo con pequeñas tijeras de primavera para eliminar el hemisferio corneal del globo ocular. El hemisferio conectado al nervio óptico permanece.
  5. Encuentra la retina muy fina de color rosa / amarillento dentro del ocular del animal sacrificado. Mantenga la capa pigmentada de la retina con unas pinzas de punta roma para estabilizar la ojera. Utilice otro par de pinzas cerradas para provocar muy suavemente toda la retina intacta fuera de la parte posterior del ojo. Evitar pellizcar, tirar o tirando de la retina directamente.
  6. Utilice pequeñas tijeras para cortar la primaveraárea donde el nervio óptico está todavía unido a la retina.
  7. Asegúrese de cortar la basura cualquier epitelio pigmentario residual o tejido de la esclerótica de la retina.
  8. Usando una pipeta de transferencia, transferir suavemente la retina aislada a una Sylgard recubierto limpia de 35 mm x 10 mm placa de Petri que contiene PBS fresca.

9. Todo el montaje Retina Preparación

  1. Una vez en el plato Sylgard, el uso de fórceps y una aguja de cactus para fijar la retina en su lugar. Mantener la capa de células ganglionares de la retina hacia arriba y hacia abajo del nervio óptico. forma hemisférica de la retina es notable, incluso después de la fijación. La curvatura de la retina se podrán curvar hacia el techo cuando la capa de células ganglionares de la retina está en la orientación deseada.
  2. Utilice pequeñas tijeras para cortar la retina en cuatro cuadrantes, haciendo la forma de un trébol de cuatro hojas que irradia de la cabeza del nervio óptico.
  3. Pin de los cuadrantes de la retina con agujas de cactus adicionales para que la retina lo más plana posible withoestiramiento ut (Figura 5).
  4. Fijar las retinas fijadas en el plato Sylgard con 3 ml de paraformaldehído al 4% O / N a temperatura ambiente.

10. tinción de anticuerpos de la Retina

Nota: retinas manchas fijas con anticuerpos primarios y secundarios para la visualización de las neuronas de la retina (Figura 6).

  1. Enjuague fijos, retinas montadas en plano tres veces durante 2 minutos cada uno en PBS.
  2. Permeabilizar las retinas con 1% de Triton X-100 con suero bovino fetal al 1% en PBS durante 60 min.
  3. Enjuague retinas tres veces, 2 minutos cada uno, en PBS.
  4. Enjuague dos veces con 0,1% Triton X-100 en PBS, 5 min por lavado.
  5. Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado.
  6. Incubar con 1% de Triton X-100 y suero bovino fetal al 1% en PBS a temperatura ambiente durante 45 min.
  7. Enjuague dos veces con 0,1% Triton X-100 en PBS, 5 min por lavado.
  8. Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado.
  9. Incubar cada retina en suero bovino fetal 3 ml 1% en PBScon el ratón purificado anti-CD90 de rata / ratón CD90.1 (dilución 1: 300) O / N a temperatura ambiente.
  10. Enjuague retinas una vez con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 5 min.
  11. Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado.
  12. Incubar cada retina en 3 ml de PBS (sin FBS) con secundario Alexa Fluor 594 de cabra anti-IgG de ratón (1: 300) O / N a TA.
  13. Lávese las retinas con PBS liberalmente.
  14. El uso de un microscopio de disección, retirar con cuidado las agujas de cactus de la retina.
  15. transferir suavemente retinas en portaobjetos de microscopio con una pipeta de transferencia. Asegúrese de mantener la orientación con la capa de células ganglionares de la retina frente al techo. forma hemisférica de la retina es notable, incluso después de la fijación. La curvatura de la retina se podrán curvar hacia el techo cuando la capa de células ganglionares de la retina está en la orientación deseada.
  16. Absorber cualquier exceso de PBS con KIMWIPE u otro material absorbente. Tenga cuidado de no absorber la retina.
  17. Añadir 5 gotas de glicerina y ½ ½ PBS en peso como AMmedios ontaje.
  18. Cubrir retina con cubreobjetos, evitando las burbujas de aire.
  19. cubreobjetos seguro utilizando esmalte transparente de uñas, pegamento u otro adhesivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Esta sección ilustra los componentes del aparato y el procedimiento utilizado para inducir condiciones glaucoma-como en una rata modelo de glaucoma in vivo. Mostramos las herramientas individuales y el equipo utilizado para realizar una inyección de solución salina hipertónica que provoca un aumento en la presión intraocular. Mostramos la inyección en el plexo venoso epiescleral con su característico efecto de blanqueo y el aspecto turbio de la cámara anterior que resulta. También se describe el proceso de eliminación de la retina y de montaje plana para el análisis de la CGR perdidos. Por último, se muestran los efectos de la inyección en la supervivencia de células ganglionares de la retina. Como la distribución de CGR es desigual en diferentes regiones de la retina de rata, las imágenes se obtienen a partir de cuatro 200 micras 2 regiones en cada retina, 4 mm de distancia del centro de la cabeza del nervio óptico. El número total de Thy 1.1 CGR marcadas en cada sección se cuentan, en promedio y en comparación experimental y en contr ol 31 retinas. Usando este método, los recuentos de CGR cambian de un promedio de 225 en una imagen de las condiciones de control no tratadas a 168 un mes después del procedimiento para inducir condiciones glaucoma-como (N = 30). Tomados en conjunto, los procedimientos descritos aquí se pueden seguir paso a paso para analizar la muerte de cuerpos de células ganglionares de la retina y los axones.

Figura 1
Figura 1. Componentes de microagujas. (A) La jeringa con tubo de polietileno utilizado para la inyección de solución salina. (B) de la jeringa de relleno utilizado para rellenar la microaguja de borosilicato. (C) Narishige electrodo extractor usado para hacer microagujas de borosilicato. (D) electrodos de vidrio de borosilicato antes y después de ser tirado en el electrodo extractor. (E) vista de la punta de la aguja microelectrodos Ampliada después de haber sido retirado.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Completo de Microneedle Asamblea. Microagujas conectada a un tubo de polietileno unida a la jeringa con solución salina hipertónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. El glaucoma inductores de Saline inyección en el plexo venoso episcleral. Imagen de la inyección de solución salina en la vena de un epiescleral vivo, anestesiado Long Evans rata. La punta de flecha indica la ubicación de la pinza hemostática utilizado a abultarse el ojo y evitar su movimiento. La flecha blanca indica la ubicación de la vena inyectada. La flecha muestra negro de nuevo la sangre que fluye en la punta de microagujas que indica éxito punción de la vena. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Efecto del escaldado inyección salina hipertónica. Imagen de ojo de rata que se inyecta con solución salina hipertónica. La punta de flecha muestra el efecto de blanqueo característico de solución salina en el plexo venoso epiescleral. La flecha indica una parte del plexo venoso epiescleral que aún no se ha blanqueado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

31 / 53831fig5.jpg "/>
Figura 5. Plano de montaje de rata Retina. Imagen de toda la retina montar retira del ojo rata y cubrió plana en un plato Sylgard el uso de agujas de cactus. La flecha indica el negro cabeza del nervio óptico. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. El daño a las células ganglionares retinianas después de la cirugía de glaucoma inductores. Comparación del control del ojo no tratado (A) para el ojo experimental (B) un mes después de recibir el glaucoma inducir la inyección de solución salina. Las retinas se marcaron con un anticuerpo contra el marcador de RGC, Thy 1.1 (CD90). flechas delgadas indican CGR individuales, tanto en el control y las condiciones experimentales. El procedimiento conduce a una reducción en el número de CGR, defasciculación de los axones de la principal haces de axones, y la distorsión de la circularidad de la CGR restantes. flechas de bloque indican los axones defasciculating característicos resultantes de la inyección de solución salina. La punta de flecha muestra un vaso sanguíneo dentro de la retina. De dos extremos de las flechas de la etiqueta haces de axones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este protocolo describe un método para inducir condiciones de glaucoma-como en un modelo de rata in vivo. Este procedimiento utiliza una inyección de solución salina hipertónica para inducir la formación de cicatrices en la malla trabecular 29, 32. El desarrollo de tejido de cicatriz ocluye el flujo de salida de humor acuoso que aumenta la presión en la cámara anterior. Con una disminución de flujo y la presión se acumulan, la lente está suspendido por ligamentos elásticos empuja de nuevo en la cámara vítrea. El humor vítreo a continuación, se aplica presión sobre la retina dañar las neuronas de la retina frágiles. Nuestros resultados usando este procedimiento muestran que el número de células ganglionares de la retina comienzan a disminuir a las 2 semanas con pérdida significativa de la pérdida de células ganglionares a 1 mes después de la intervención.

Este protocolo es sólo un método de inducir glaucoma en los roedores. Hay muchos otros modelos experimentales en los que el daño a las células ganglionares de la retina se lleva a cabo ya sea por un aumento de la presión intraocular o por da directamage en el nervio óptico 30. A menudo, estos métodos han sido desarrollados en animales más grandes y modificada para su aplicación a los ratones y las ratas 33. Las inyecciones intraoculares de toxinas tales como estaurosporina 34 y NMDA, el análogo de glutamato no hidrolizable 35 inducen la muerte rápida de las células ganglionares de la retina. Los estudios han demostrado, sin embargo, que tales toxinas siguen una curva de dosis-respuesta en los ratones y las células de efecto distintas de las células ganglionares de la diana 35. Además, el daño a las células ganglionares de la retina en este modelo es mucho más directo que la progresión gradual de glaucoma humano.

El daño directo al nervio óptico, también puede practicarse. Axotomía láser es una forma común de cortar los axones que forman el nervio óptico en ratones 36. Sin embargo, este método presenta algunas complicaciones. El pequeño tamaño de las órbitas de roedores hace que sea difícil de dañar el nervio óptico con precisión sin afectar el flujo de sangre a través de la arteria central de la retinay la vena. Para superar esto, algunos investigadores utilizan un enfoque más invasivo que implica la eliminación de una pequeña parte del cerebro a fin de proporcionar un mejor acceso al nervio óptico 37. modelos de aplastamiento del nervio óptico acceso al nervio óptico intraorbitalmente también. En este modelo, el nervio está dañado por una pinza de cierre automático y el flujo sanguíneo ocular no se vea comprometida. Este procedimiento da lugar a un insulto inmediata y la muerte síncrono de células ganglionares de la retina. Los estudios que utilizan este modelo muestran una pérdida significativa de la CGR 38. Sin embargo, hay quienes sostienen que puede inducir más daño que la causada por la elevación de la PIO solo 39. Además, el glaucoma se caracteriza por pérdida lenta asíncrono, crónica, de las células ganglionares de la retina 33, 39-42 .Por lo tanto, el curso temporal y el mecanismo subyacente del daño infligido con aplastamiento del nervio óptico puede ser bastante diferente de la que se produce en el glaucoma humano. En contraste, el modelo analizado en este documento evita la necesidad de acce directass en el nervio óptico, elimina cualquier disección de tejido cerebral, y permite el daño de las células ganglionares de la retina gradual.

modelos de oclusión de microperlas de uso glaucoma poliestireno o perlas magnéticas inyectadas en las cámaras anterior de ratas o ratones para elevar la presión intraocular. La mayor parte de este trabajo se ha realizado en ratones y muestran sólo un bajo a moderado nivel de daño en el nervio óptico, con amplia variación en los resultados y los datos inconsistentes 43-50. Cuando se utilizan ratas, la duración de la PIO elevada era demasiado corta como para causar suficiente daño a las células 48. Incluso con modificaciones al procedimiento, el modelo todavía causó graves daños en la corta duración que representa un modelo neuropático agudo en lugar de un modelo de glaucoma crónico 51. Smedowski et al 43 han desarrollado recientemente un procedimiento microbead modificado adicionalmente mediante un «perjuicio alta presión 'inicial adicional para lograr más largo elevación de la PIO con daño crónico que el DOE duraderas promesa de espectáculo. Más estudios que utilizan esta técnica son necesarias para validar aún más este modelo.

Modelos de la hipertensión ocular crónica tienen por objeto impedir la salida del humor acuoso. La fotocoagulación con láser de la venas epiesclerales y límbicas 52 y epiescleral oclusión venosa 53 son dos de tales métodos. Sin embargo, también se ha demostrado que las técnicas de ablación por láser sólo producen elevación de la PIO transitoria y un nivel moderado de la pérdida de células real 36, 54-55.

El glaucoma es una enfermedad crónica como resultado del daño y la pérdida de células ganglionares de la retina cuyos axones forman el nervio óptico. El mecanismo de esta pérdida es desconocido. Mientras que un aumento de la presión intraocular es el factor de riesgo sello, algunos han sugerido la participación de otros factores. Tales factores incluyen procesos inflamatorios, estrés oxidativo, irregularidades metabólicas, o las alteraciones del flujo sanguíneo 56-58. Con el fin de descubrir el mecanismo preciso de cell muerte en esta enfermedad, los investigadores necesitan formas simples, repetibles y funcionales que imitan con exactitud las condiciones que aparecen en el glaucoma humano. Sólo entonces podrán investigadores esperan encontrar una manera de proteger a las células ganglionares de la retina de la muerte. El procedimiento descrito en este documento utiliza una elevación de la PIO inducida artificialmente para producir una pérdida progresiva e irreversible de las células ganglionares de la retina similar a la observada en pacientes con glaucoma 31. El procedimiento es mínimamente invasivo. la pérdida de células ganglionares de la retina significativa se mide el plazo de un mes de la cirugía. Este método es una herramienta importante para el estudio de glaucoma. Una limitación potencial de este método es la inyección manual de la solución salina hipertónica. Debido a este método manual, es posible esperar un gran variabilidad en los resultados. Sin embargo, hemos identificado el efecto de blanqueo en la vena para ser un paso crítico. Si se produce palidez, pérdida de células ganglionares de la retina está siempre entre el 18 y el 29%. Para apoyar esto, todos los estudios futuros podrían modify el procedimiento para incluir mediciones de la PIO de rutina para asegurarse de que estas inyecciones conducen a un aumento medible de la PIO. 29,31. Tal vez este modelo de la muerte de CGR, dará lugar al desarrollo de un tratamiento neuroprotector más completa que combate la pérdida de la visión devastadora que afecta a millones de personas en todo el mundo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous Humor Dynamics: A Review. Open Ophthalmol. J. 4, 52-59 (2010).
  2. Thylefors, B., Negrel, A. D. The global impact of glaucoma. Bull. World Health Organ. 72 (3), 323-326 (1994).
  3. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bull. World Health Organ. 73 (1), 115-121 (1995).
  4. Roodhooft, J. M. Leading causes of blindness worldwide. Bull Soc. Belge. Ophtalmol. 283, 19-25 (2002).
  5. Sacca, S., Pulliero, A., Izzotti, A. The Dysfunction of the Trabecular Meshwork During Glaucoma Course. J. Cell. Physiol. 230 (3), 510-525 (2014).
  6. McKinnon, S. J., Goldberg, L. D., Peeple, P., Walt, J. G., Bramley, T. J. Current Management of Glaucoma and the Need for Complete Therapy. Am. J. Manag. Care. 14 (1 Suppl), S20-S27 (2008).
  7. Lee, D. A., Higginbotham, E. J. Glaucoma and its treatment: a review. Am. J. Health Syst. Pharm. 62, 691-699 (2005).
  8. Brandt, J. D., Vandenburgh, A. M., Chen, K., Whitcup, S. M. Bimatoprost Study Group. Comparison of once- or twice-daily bimatoprost with twice-daily timolol in patients with elevated IOP: a 3-month clinical trial. Ophthalmology. 108, 1023-1031 (2001).
  9. Camras, C. B. Comparison of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension and glaucoma: a six-month masked, multicenter trial in the United States. The United States Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 138-147 (1996).
  10. Netland, P. A., et al. Travoprost compared with latanoprost and timolol in patients with open-angle glaucoma or ocular hypertension. Am. J. Ophthalmol. 132, 472-484 (2001).
  11. Sherwood, M., Brandt, J. Bimatoprost Study Groups 1 and 2. Six-month comparison of bimatoprost once-daily and twice-daily with timolol twice-daily in patients with elevated intraocular pressure. Surv. Ophthalmol. 45 (Suppl 4), S361-S368 (2001).
  12. Watson, P., Stjernschantz, J. A six-month, randomized, double-masked study comparing latanoprost with timolol in open-angle glaucoma and ocular hypertension. The Latanoprost Study Group. Ophthalmology. 103, 126-137 (1996).
  13. Hedman, K., Alm, A., Gross, R. L. Pooled-data analysis of three randomized double-masked, six-month studies comparing intraocular pressure-reducing effects of latanoprost and timolol in patients with ocular hypertension. J. Glaucoma. 12 (6), 463-465 (2003).
  14. Schumer, R. A., Podos, S. M. The nerve of glaucoma! Arch. Ophthalmol. 112, 37-44 (1994).
  15. Tsai, J. C., Chang, H. W. Comparison of the effects of brimonidine 0.2% and timolol 0.5% on retinal nerve fiber layer thickness in ocular hypertensive patients: a prospective, unmasked study. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 21 (6), 475-482 (2005).
  16. Wilhelm, B., Ludtke, H., Wilhelm, H. The BRAION Study Group. Efficacy and tolerability of 0.2% brimonidine tartrate for the treatment of acute non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION): a 3-month, double-masked, randomised, placebo-controlled trial. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 244, 551-558 (2006).
  17. Fazzone, H. E., Kupersmith, M. J., Leibmann, J. Does topical brimonidine tartrate help NAION? Br. J. Ophthalmol. 87, 1193-1194 (2003).
  18. Harris, A., Arend, O., Kagemann, L., Garrett, M., Chung, H. S., Martin, B. Dorzolamide, visual function and ocular hemodynamics in normal-tension glaucoma. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 15, 189-197 (1999).
  19. Leahy, K. E., White, A. J. Selective laser trabeculoplasty: current perspectives. Clin. Ophthalmol. 11 (9), 833-841 (2015).
  20. Nesaratnam, N., Sarkies, N., Martin, K. R., Shahid, H. Pre-operative intraocular pressure does not influence outcome of trabeculectomy surgery: a retrospective cohort study. BMC Ophthalmol. 15 (1), 17 (2015).
  21. Cairns, J. E. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am. J. Ophthalmol. 66 (4), 673-679 (1968).
  22. Cheng, J. W., Cai, J. P., Wei, R. L. Meta-analysis of medical intervention for normal tension glaucoma. Ophthalomology. 116 (7), 1243-1249 (2009).
  23. Dielmans, I., Vingerling, J. R., Wolfs, R. C. W., Hofman, A., Grobbee, D. E., deJong, P. T. V. M. The prevalence of primary open-angle glaucoma in a population based study in The Netherlands: the Rotterdam Study. Ophthalmology. 101, 1851-1855 (1994).
  24. Lichter, P. R., et al. Interim clinical outcomes in the Collaborative Initial Glaucoma Treatment Study comparing initial treatment randomized to medications or surgery. Ophthalmology. 108 (11), 1943-1953 (2001).
  25. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1268-1279 (2002).
  26. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Arch. Ophthalmol. 120 (6), 701-713 (2002).
  27. Beidoe, G., Mousa, S. A. Current primary open-angle glaucoma treatments and future directions. Clin. Ophthalmol. 6, 1699-1707 (2012).
  28. Jeong, J. H., Park, K. H., Jeoung, J. W., Kim, D. M. Preperimetric normal tension glaucoma study: long-term clinical course and effect of therapeutic lowering of intraocular pressure. Acta. Ophthalmol. 92 (3), e185-e193 (2014).
  29. Morrison, J. C., Moore, C. G., Deppmeier, L. M., Gold, B. G., Meshul, C. K., Johnson, E. C. A Rat Model of Chronic Pressure-Induced Optic Nerve Damage. Exp. Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
  30. Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat Models for Glaucoma Research. Prog. Brain Res. 173, 285-301 (2008).
  31. Iwamoto, K., Birkholz, P., Schipper, A., Mata, D., Linn, D. M., Linn, C. L. A Nicotinic Acetylcholine Receptor Agonist Prevents Loss of Retinal Ganglion Cells in a Glaucoma Model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (2), 1078-1087 (2014).
  32. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal Microvasculature of the Rat Eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36 (3), 751-756 (1995).
  33. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse Models of Retinal Ganglion Cell Death and Glaucoma. Exp. Eye Res. 88 (4), 816-824 (2009).
  34. Maass, A., et al. Assessment of Rat and Mouse RGC Apoptosis Imaging in Vivo with Different Scanning Laser Ophthalmoscopes. Curr. Eye Res. 32 (10), 851-861 (2007).
  35. Li, Y., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Experimental induction of retinal ganglion cell death in adult mice. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 40 (5), 1004-1008 (1999).
  36. Gross, R. L., et al. A mouse model of elevated intraocular pressure: retina and optic nerve findings. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 101, 163-171 (2003).
  37. Cenni, M. C., Bonfanti, L., Martinou, J. C., Ratto, G. M., Strettoi, E., Maffei, L. Long-term survival of retinal ganglion cells following optic nerve section in adult bcl-2 transgenic mice. Eur. J. Neurosci. 8 (8), 1735-1745 (1996).
  38. Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol. Vis. 18, 2147-2152 (2012).
  39. Schlamp, C. L., Johnson, E. C., Li, Y., Morrison, J. C., Nickells, R. W. Changes in Thy1 gene expression associated with damaged retinal ganglion cells. Mol. Vis. 7, 192-201 (2001).
  40. Libby, R. T., et al. Susceptibility to neurodegeneration in a glaucoma is modified by Bax gene dosage. PLoS Genet. 1, 17-26 (2005).
  41. Yang, Z., et al. Changes in gene expression in experimental glaucoma and optic nerve transection: the equilibrium between protective and detrimental mechanisms. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (12), 5539-5548 (2007).
  42. Huang, W., Fileta, J., Guo, Y., Grosskreutz, C. L. Downregulation of Thy1 in retinal ganglion cells in experimental glaucoma. Curr. Eye Res. 31 (3), 265-271 (2006).
  43. Smedowski, A., Pietrucha-Dutczak, M., Kaarniranta, K., Lewin-Kowalik, J. A rat experimental model of glaucoma incorporating rapid-onset elevation of intraocular pressure. Sci. Rep. 4, 1-11 (2014).
  44. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp. Eye Res. 91 (3), 415-424 (2010).
  45. Pease, M. E., Cone, F. E., Gelman, S., Son, J. L., Quigley, H. A. Calibration of the TonoLab tonometer in mice with spontaneous or experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (2), 858-864 (2011).
  46. Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 99, 27-35 (2012).
  47. Frankfort, B. J., et al. Elevated intraocular pressure causes inner retinal dysfunction before cell loss in a mouse model of experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (1), 762-770 (2013).
  48. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  49. Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (7), 3847-3857 (2012).
  50. Cone-Kimball, E., et al. Scleral structural alterations associated with chronic experimental intraocular pressure elevation in mice. Mol. Vis. 19, 2023-2039 (2013).
  51. Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
  52. WoldeMussie, E., Ruiz, G., Wijono, M., Wheeler, L. A. Neuroprotection of retinal ganglion cells by brimonidine in rats with laser-induced chronic ocular hypertension. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42 (12), 2849-2855 (2001).
  53. Garcia-Valenzuela, E., Shareef, S., Walsh, J., Sharma, S. C. Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp. Eye Res. 61 (1), 33-44 (1995).
  54. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (10), 4314-4320 (2003).
  55. Ji, J., et al. Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells. Vision Res. 45 (2), 169-179 (2005).
  56. Flammer, J., et al. The eye and the heart. Eur. Heart J. 34 (17), 1270-1278 (2013).
  57. Gugleta, K., et al. Association between risk factors and glaucomatous damage in untreated primary open-angle glaucoma. J. Glaucoma. 22 (6), 501-505 (2013).
  58. Mozaffarieh, M., Flammer, J. New insights in the pathogenesis and treatment of normal tension glaucoma. Curr. Opin. Pharmacol. 13 (1), 43-49 (2013).

Tags

Medicina Número 109 rata glaucoma inyección, retina todo el montaje de montaje plana la neurociencia las células ganglionares de la retina la hipertensión ocular enfermedades de los ojos
Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,… More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter