Abstract
青光眼是一种影响视网膜神经节细胞（RGC）的中枢神经系统的疾病。研资局轴突组成视神经进行视觉输入到大脑的视觉感受。损害视网膜神经节细胞和它们的轴突导致视力丧失和/或失明。尽管青光眼的具体原因不明，为疾病的主要危险因素之一是升高的眼内压。在动物模型青光眼诱导过程是一个有价值的工具，研究人员在研究RGC死亡的机制。这样的信息可导致可能在预防视力丧失的有助于有效的神经保护治疗的发展。本文中的协议描述诱导的青光眼的方法-像，其中50微升2M的高渗盐水注入巩膜静脉丛在体内大鼠模型的条件。血管的热烫表示成功注入。此过程会导致视网膜神经节细胞的损失来模拟青光眼。一个月以下注射后，将动物处死，眼睛被除去。接着，角膜，晶状体和玻璃体被除去以使一个眼罩。视网膜然后从眼睛的后部剥离和钉扎到使用仙人掌针SYLGARD菜肴。在这一点上，在视网膜的神经元可染色进行分析。从这个实验结果表明，相对于内部控制时，视网膜神经节细胞的约25％是在过程的一个月内丢失。这个过程允许在体内大鼠青光眼模型的视网膜神经节细胞死亡的定量分析。
Introduction
青光眼是一组影响的神经元中的视网膜，具体而言，视网膜神经节细胞1-2眼疾。这些细胞的轴突收敛到成为视神经承载可视信息，其中视觉感知的大脑。因此损害视网膜神经节细胞和其轴突导致视觉缺陷。
与青光眼疾病相关的主要特征是RGC变性和死亡，增加的眼内压（IOP），并视盘拔罐和萎缩。这些特点导致视野丧失或完全，不可逆转的失明。目前，青光眼全球7000万人造成3失明。因此，它是世界上第三大致盲4的原因。
RGC死亡的青光眼的确切机制尚不清楚。许多研究已经完成，以解开这个谜。然而，已经知道的是，青光眼的主要危险因素之一是增加我Ñ眼压由于房水（AH）在眼睛的前房的不规则循环。 AH充当眼睛的缺血性前房无色透明的替代血液。它滋养周围的细胞，分泌删除废物从代谢过程，运输的神经递质，并允许在病理状态1的药物和眼内炎症细胞的循环。
房水流通的维护包括睫状体和小梁网。房水由睫状体产生的。然后，它流入前房维持眼组织的总体健康状况。 75 - 房水外流的80％时，流体通过在睫状肌海绵组织的三层过滤正在积极通过非颜料睫状体上皮分泌的。穿过小梁网并通过施累姆氏管其制止所述流体排出独立实体进入血液系统5。其余20 -流出的25％绕过小梁网和通过超滤和扩散通过uveo巩膜途径被动分泌。这一途径似乎是相对独立的眼压1。
当房水的生产和流出都失去平衡，压力增大眼内。如上所述，这种增加的眼内压是在青光眼的发展的主要危险因素。这种压力导致在眼睛的回视网膜神经元的复杂的层的损伤。损伤视神经的视网膜神经节细胞轴突导致大脑不再接收准确的视觉信息。其结果是，视觉的知觉丧失，并且可以发生完全失明。
到目前为止，还没有治愈青光眼。不同的治疗方法存在的主要目的是降低眼压。这些措施包括外用药物类，如β1的肾上腺素能受体阻断剂，或局部前列腺素类似物。 β阻滞剂通过减少房水的产生7的降低眼内压。前列腺素的作用，通过增加房水8-14外流以减少眼压。 α-肾上腺素能激动剂和碳酸酐酶抑制剂也可作为治疗的辅助方法。阿尔法肾上腺素受体 激动剂通过葡萄膜巩膜途径15-17加大流出。碳酸酐酶抑制剂，通过抑制酶的18降低生产AH的。更侵入性程序也被用于治疗青光眼。激光小梁成形术是用于增加房水19的流出。另一个手术疗法，称为小梁切除术，创建了一个另类的排水现场时，传统的小梁途径被阻断20-21过滤啊。
这些治疗方案已经知道EFFectively眼压降低。然而，青光眼患者的高达40％的正常显示眼压水平表明需要更完整的治疗方法。22,23此外，在青光眼看到视网膜神经节细胞的死亡是不可逆的，一旦开始，目前的治疗不停止疾病的进展24-28。这强调了靶向神经元本身的生存有效的神经保护治疗的需要。青光眼模型的发展是这一发展的关键。
在这项研究中，我们证明使用最初由莫里森29中概述的改性过程诱导成年龙Evans大鼠青光眼样作用的方法。在此过程中，2M的高渗盐水注射到巩膜静脉丛被瘢痕组织引起青光眼样的条件，以减少在小梁网，导致增加的眼内压和视网膜神经节细胞的w的显著损失水状液流出ithin程序30-31的一个月。青光眼诱导程序，如这里描述的，可能是关键解锁在青光眼治疗的新发展。
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Protocol
使用受试动物的所有程序已经按照动物护理和使用委员会（IACUC）在西密歇根大学研究所的标准。
1.动物
- 使用雄性和雌性大鼠3个月大了这项研究。
- 保持12小时光/暗周期动物自由获取食物和水。
2. KAX鸡尾酒动物麻醉的制备
- 在5ml氯胺酮（100毫克/毫升）与1ml乙酰丙嗪（10毫克/毫升）和3毫升蒸馏水溶解50mg的甲苯噻嗪（20毫克/毫升）的。调匀。
- 用注射器过滤消毒并存储该溶液到10ml血清瓶中。
3.注射KAX
- 称取动物（G），并返回到笼子里，直到准备注射。
- 注入0.1毫升KAX / 100g的动物体重腹膜内，使用具有28克针1毫升胰岛素注射器。
- 允许动物变得不省人事。捏脚和尾巴检查见长。
- 保留所有动物安全实验室进行手术的时间。
- 手术后，替代动物进入它们的笼子，并在RT保持舒适的意识，直到重新获得。只有回到动物动物设施当动物苏醒并恢复正常的行为。
4.准备手术以及微大会
- 使无菌2M的NaCl溶液。
- 使用微电极拉出器（ 图1C）到拉一0.86毫米内径重抛光标准和薄壁的硼硅管成两个细的锥形玻璃微针（ 图1D，图1E）。
- 从与用回填注射器针和1ml注射器（ 图1B）的2M食盐先前步骤回填一个微型针。从电极的尖端挖掘出气泡。
- 填写第二1ml注射器用2M氯化钠。连接一个18G的针头，然后安装聚乙烯管（ 图1A）的长度（约10英寸）。使用针筒柱塞通过针来填充用生理盐水聚乙烯管。
- 当两个微针和导管填充有盐水，仔细连接两个。消除任何空气中（ 图2）在它们之间的连接。
- 刮得很轻轻地靠着一门课程纸巾的晶粒细锥微针的尖端。
- 轻轻推动注射器柱塞，直到液体的微细流可以在纸巾中可以看出检查微针的电阻。的液体流应不大于0.5mm宽。
5.编写动物
- 应用1 - 2滴局部麻醉剂至角膜（丙美卡因盐酸眼用溶液，USP，0.5％）。等到没有眼反射发生。
- 修剪用剪刀晶须。
- 小号aturate与优碘溶液和周围的实验眼拭子区棉尖涂药。
- 使用显微镜，重视止血钳将上下眼睑鼓起眼睛，露出巩膜静脉和限制眼球运动。 （ 图3，箭头）
6.青光眼诱导盐水注射
- 当制备微针组装和动物，开始注射。
- 当动物被证实是没有反应英尺/尾捏，小心地在到静脉（ 图3，白色箭头）10和20度之间的低角度来刺破用微针的巩膜静脉。一个成功的穿刺到静脉可知当血液进入微针（ 图3，黑色箭头）的前端。
- 慢慢地，手动注入约50微升生理盐水静脉。这大约需要10秒。静脉将灼白盐循环救援人员到场啊脉管（ 图4，箭头）。一些地区可能维持一个血红色的外观（ 图4，箭头）。
- 执行第二注射到静脉，相对的第一部位，以确保对完整视网膜神经节细胞层彻底视网膜损伤。
注意：在几分钟之内，应该看到，通过眼睛的虹膜独特混浊外观的盐循环通过血管系统。
- 执行第二注射到静脉，相对的第一部位，以确保对完整视网膜神经节细胞层彻底视网膜损伤。
- 离开对面眼未处理用作内部对照。
7.动物恢复
- 取出止血。
- 用棉签三联抗生素软膏（杆菌肽锌，硫酸新霉素，polymysin乙硫酸盐）适用于止血和注射部位夹住的部位。眼部周围组织损伤不会出现使用止血。
- >将麻醉动物在笼子上的循环温水毯上一个耳鼻喉科体温过低。不时观察动物直至意识和正常行为的恢复。运输清醒动物回到动物殖民地。动物留在殖民地，直到牺牲的时间。
8.动物牺牲和视网膜去除
- 一个月之后，以诱发青光眼的过程中，动物用CO 2窒息和二次胸穿安乐死。
- 放置在腔室中的动物，并把盖子上的安全。
- 打开的 CO 2和气体调节阀，以允许20％体积/分钟的 CO 2的位移 氧气在该腔室。
- 允许四到5分钟的动物过期。
- 关闭两个阀门。
- 从腔室中取出的动物和用无菌解剖刀执行辅助胸椎穿刺。
- 安乐死后，用手术刀切在眼眶周围的眼睛，贝结缔组织NG小心不要切入眼球本身。
- 小心使用曲边剪刀剪断视神经和任何剩余的组织中提取完整的眼球。将提取的眼球无菌60毫米×15毫米培养皿一次性含有新鲜的PBS菜。
- 使从眼球的眼罩。要做到这一点，请用手术刀小切口正好后方虹膜和巩膜之间的边界。按照眼部周围的小弹簧剪刀圆周此切口从眼球取出角膜半球。连接到视神经半球保持。
- 查找安乐死的动物眼罩内的非常薄的粉红/米色视网膜。握住钝镊子视网膜的色素层，以稳定眼罩。使用另一对闭合钳非常轻轻挑逗整个完整的视网膜落睛的背面。避免捏，拉，或揪着直接视网膜。
- 用小弹簧剪刀剪开区域，视神经仍连接到视网膜。
- 一定要切掉从视网膜任何残留色素上皮或巩膜组织。
- 使用移液管，分离的视网膜轻轻转移到涂覆的含有新鲜的PBS35毫米×10mm的皮氏培养皿一干净SYLGARD。
9.整个安装视网膜准备
- 一旦在Sylgard菜，使用镊子和一个仙人掌针引脚视网膜到位。保持视网膜神经节细胞层朝上和视神经下来。视网膜的半球形状，即使固定后显着。视网膜的曲率将卷曲朝向天花板时视网膜神经节细胞层是在所希望的方向。
- 用小剪刀到视网膜切成四个象限，使得四叶草从视神经头散热的形状。
- 针附加仙人掌针的视网膜象限使视网膜尽可能平坦无覆盖UT拉伸（ 图5）。
- 修复在Sylgard菜的固定视网膜用3毫升的4％多聚甲醛O / N在室温。
视网膜10.抗体染色
注意：与第一和第二抗体染色的固定视网膜中视网膜观看神经元（ 图6）。
- 漂洗固定的，平面安装视网膜2分钟3次，每次在PBS中。
- 透视网膜，用1％的Triton X-100用在PBS中的1％胎牛血清60分钟。
- 漂洗视网膜三次，每次2分钟，在PBS中。
- 用0.1％的Triton X-100的PBS，每次洗涤5分钟漂洗两次。
- 用PBS，每洗5分钟，冲洗两次。
- 与在RT 1％的Triton X-100和1％胎牛血清的PBS中孵育45分钟。
- 用0.1％的Triton X-100的PBS，每次洗涤5分钟漂洗两次。
- 用PBS，每洗5分钟，冲洗两次。
- 孵育在PBS中的3毫升1-％胎牛血清每个视网膜用纯化的小鼠抗大鼠CD90 /小鼠CD90.1（1：300稀释）O / N在室温。
- 用0.1％的Triton X-100冲洗视网膜一旦在PBS 5分钟。
- 用PBS，每洗5分钟，冲洗两次。
- 继发的Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG孵育在3ml的PBS（无FBS）的各视网膜（1：300）O / N在室温。
- 用PBS洗涤宽松视网膜。
- 使用解剖显微镜，小心地从视网膜移除仙人掌针。
- 轻轻地用移液管转移到视网膜显微镜载玻片。一定要保持朝向天花板视网膜神经节细胞层的方向。视网膜的半球形状，即使固定后显着。视网膜的曲率将卷曲朝向天花板时视网膜神经节细胞层是在所希望的方向。
- 吸收任何过量的PBS与的Kimwipe或其它这类吸湿材料。要小心，不要吸收视网膜。
- 加入5滴½甘油和重量上午½PBSounting媒体。
- 盖上盖玻片视网膜，避免产生气泡。
- 安全使用盖玻片透明指甲油，胶水或其他粘合剂。
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Representative Results
本节说明用于诱导在体内大鼠青光眼模型青光眼样条件的装置组件和过程。我们表明用于执行高渗盐水注射导致眼内压增加的个体的工具和设备。我们展示了注入以其特有的漂白效果和前房导致的浑浊外观巩膜静脉丛。我们还描述了视网膜去除和平面安装丢失RGC的分析过程。最后，我们显示在视网膜神经节细胞存活的注射的效果。作为视网膜神经节细胞的分布是在大鼠视网膜的不同区域不均匀，图像从在每个视网膜上，从视神经头的中心4毫米抓走4 200微米2区域获得。在每个部分祢1.1标记的RGC的总数进行计数，平均和比较实验和对照 OL视网膜31。使用这种方法，RGC计数从平均225的控制未处理的条件的图像中改变为168一个月过程后以诱导青光眼样条件下（N = 30）。总之，这里介绍的步骤可以遵循一步一步来分析视网膜神经节细胞体和轴突死亡。
图1.微针组件。之前和在电极被拉后（A）的注射器与用于盐水注射聚乙烯管材。（B）的用于回填硼硅微针候补注射器。（℃）NARISHIGE电极用于使硼硅酸盐微针拔出器（D）硼硅玻璃电极拉马（E）被拉扯后放大查看微针尖。ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2.完整的微针大会。微针连接到安装有高渗盐水注射器，聚乙烯管。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.青光眼诱导盐水注入巩膜静脉丛。生理盐水注射到活的巩膜静脉影像，麻醉长埃文斯老鼠。箭头指示用于凸出的眼睛，防止其运动的止血钳的位置。白色箭头指示注入静脉位置。黑色箭头显示流入表示成功静脉穿刺微针针尖回血。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.高渗盐水里烫5秒钟影响注射。鼠眼图像被注射高渗盐水。箭头示出了在巩膜静脉丛盐水的特性热烫效果。箭头表示，目前尚未脱皮的巩膜静脉丛的一部分。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图5.平贴大鼠视网膜。整个安装视网膜图像从大鼠的眼睛除去，用仙人掌针一Sylgard菜寄托持平。黑色箭头指示视神经头。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.损害视网膜神经节细胞青光眼诱导手术后，未处理的对照眼（A）实验眼（B）一个月比较接受青光眼诱导生理盐水注射后。视网膜被标记对RGC标记，你的1.1（CD90）的抗体。细箭头表示在对照和实验条件个体的RGC。该过程导致在视网膜神经节细胞的数量的减少，代关闭主轴突束轴突的肌束颤动，和失真剩余视网膜神经节细胞的圆。挡箭表示从盐水注射导致的特点defasciculating轴突。箭头显示了视网膜中的血管。双端箭头标记的轴突束。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这个协议描述诱导在体内大鼠模型青光眼样病症的方法。此过程使用高渗盐水的注射诱导疤痕在小梁网29，32。发展疤痕组织闭塞房水的流出这增加前房压力。随着流出和压力降低建立，通过弹性悬挂韧带镜头推回到玻璃体腔。玻璃体然后施加压力到视网膜损害脆弱的视网膜神经细胞。使用此过程我们的结果表明，视网膜神经节细胞数开始以2周1个月后的过程神经节细胞损失显著损失减少。
该协议是在啮齿类动物中诱发的青光眼的只有一个方法。有在其中视网膜神经节细胞损伤或者由增加的眼内压或者通过直接哒完成了许多其它实验模型法师视神经30。通常情况下，这些方法已被开发在较大的动物和修改应用到小鼠和大鼠33。的毒素如星形孢菌素34和NMDA眼内注射，非水解谷氨酸类似物35诱导快速的视网膜神经节细胞死亡。然而研究显示，这种毒素跟随在小鼠和比目标神经节细胞35其他效应细胞的剂量-反应曲线。此外，在该模型的视网膜神经节细胞的伤害比人类青光眼的逐渐进展更直接。
视神经直接损害，也可造成的。激光干切断是切断构成在小鼠36视神经轴突的常用方法。但是，这种方法存在一些并发症。啮齿动物轨道的小尺寸使得难以准确地损害视神经而不通过中央视网膜动脉影响血液流动和静脉。为了克服这一点，一些研究人员利用涉及以提供对视神经37更好地进入去除脑的一小部分的更侵入性的方法。视神经损伤模型访问视神经intraorbitally为好。在此模型中，神经被自闭合钳子和眼血流捏不会受到损害。该过程将导致立即侮辱和视网膜神经节细胞的同步死亡。用此模型研究显示，视网膜神经节细胞38显著损失。然而，有些人认为它可能诱发比所造成的孤独39眼压升高造成更多的伤害。此外，青光眼的特点是视网膜神经节细胞33，39-42。因此，在时间进程和视神经挫伤造成损伤的潜在机制的缓慢的，慢性的，异步的损失可能比人类青光眼发生很大的不同。与此相反，在本文中讨论的模型避免了直接附属品的必要性分类到视神经，消除了脑组织中的任何剥离，并且允许渐进视网膜神经节细胞损伤。
注射到大鼠或小鼠的前房青光眼使用聚苯乙烯或磁珠微珠闭塞模型升高眼压。大部分工作已经在老鼠已经完成，他们只表现出低到与结果差异很大和不一致的数据43-50视神经损伤的中等水平。当使用大鼠高眼压的持续时间太短，导致细胞的48足够的伤害。甚至与修改的程序，该模型仍然引起在短的持续时间的严重损坏表示一种急性神经性模型而非慢性青光眼模型51。 Smedowski 等 43最近使用额外的初始“高压伤害”，实现持久与能源部慢性损害高眼压制定了进一步修改微珠程序秀承诺。更多的研究使用这种技术是必要的，以进一步验证这种模式。
慢性高眼压模型旨在阻碍房水外流。在巩膜缘和静脉52和巩膜静脉阻塞53的激光光凝是两个这样的方法。然而，它也表明，激光烧蚀技术仅产生瞬时高眼压和电池实际损失36，54-55的中等水平。
青光眼是由损伤和视网膜神经节细胞的轴突弥补视神经损失引起的慢性疾病。这个损失的机理是未知的。而增加的眼内压是标志的危险因素，一些人所建议的其他因素的参与。这些因素包括炎性过程，氧化应激，代谢不规则性，或血液流动扰动56-58。为了揭开CEL的精确机制本病升死亡，研究人员需要简单，可重复和功能的方式出现在人类青光眼准确地模拟的条件。只有这样，研究人员希望设计出一种方法来保护视网膜神经节细胞死亡。本文中所描述的过程使用眼压的人工诱导高程，以产生类似于在青光眼患者31可见视网膜神经节细胞的逐渐的，不可逆的损失。该过程是微创。显著视网膜神经节细胞损失手术后一个月内进行测定。这种方法是对青光眼的研究的一点显著工具。这种方法的一个潜在的局限性是高渗盐水的手动注射。因为本说明书的方法，它是可以期待在结果中很大的变异性。然而，我们已经确定在静脉热烫效果是一个关键的步骤。如果发生热烫，视网膜神经节细胞的损失永远是18至29％。为了支持这项工作，所有未来的研究可以莫迪FY的步骤包括常规的IOP测量，以确保这些注射导致在眼压。29,31可测量的增加。也许RGC死亡的这一模式将导致对对抗影响了全世界数百万人的毁灭性视觉丧失一个较完整的神经保护治疗的发展。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine hydrochloride, Minimum 99% | Sigma, Life Science | X1251-1G | |
| Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml | Putney, Inc | NDC 26637-411-01 | 10 ml bottle |
| Acepromazine Maleate, 10mg/ml | Phoenix Pharmaceutical, Inc | NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 | 50 ml bottle |
| Serum bottle, 10 ml | VWR | 16171319 | Borosilicate glass |
| 1 ml insulin syringe | VWR | BD329410 | 28 G needle |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | 2 M Solution |
| Microelectrode Puller | Narishige Group | PP-830 | |
| Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-10HP | without filament, 0.86 mm |
| Microfil syringe needle for filling micropipettes | World Precision Instruments, Inc | MF28G | |
| 18 gauge Luer-Lock needle | Fisher Scientific | 1130421 | Syringe needle |
| Flexible Polyethylene Tubing | Fisher Scientific | 22046941 | 0.034 inch diameter, approximately 10 inches |
| Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% | Akorn, Inc | NDC 17478-263-12 | 15 ml sterile bottle |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Microscope | Leica | StereoZoom 4 | |
| Hemostat Clamp | Fine Science Tools | 1310912 | curved edge |
| Triple Antibiotic Ointment | Fisher Scientific | NC0664481 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| 60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish | VWR | 351007 | |
| Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate | Sigma, Life Science | P7059-1L | 1x dilution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Forceps (2), Dumont # 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| 3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile | BD Biosciences | 357524 or 52947-948 | 1 and 2 ml graduations |
| 35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish | BD Biosciences | 351008 | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Cactus Needles | |||
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055-3 or 818715.0100 | Made into a 4% solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100 ml | Made into both a 1% and 0.1% solution |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biological | S11150 | 500 ml |
| Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 | BD Pharmingen | Cat 554892 | 1:300 dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11005 | 1:300 dilution |
| Microscope Slides | Corning | 2948-75x25 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100 ml | 50% glycerol to 50% PBS, by weight |
| Coverglass | Corning | 2975-225 | Thickness 1 22 x 50 mm |
| Confocal Microscope | Nikon | C2 Eclipse Ti |
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