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Medicine

Glaucomes induisant une procédure dans un Published: March 12, 2016 doi: 10.3791/53831
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Western Michigan University, 2Department of Biomedical Sciences, Grand Valley State University

Abstract

Le glaucome est une maladie du système nerveux central affectant les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). axones RGC constituant le nerf optique portent entrée visuelle au cerveau pour la perception visuelle. Dommages à RGC et leurs axones conduit à la perte et / ou la cécité vision. Bien que la cause spécifique du glaucome est inconnue, le principal facteur de risque de la maladie est une pression intraoculaire élevée. procédures de Glaucome induisant dans des modèles animaux sont un outil précieux pour les chercheurs qui étudient le mécanisme de RGC mort. De telles informations peuvent conduire au développement de traitements neuroprotecteurs efficaces qui pourraient aider à la prévention de la perte de vision. Le protocole dans le présent document décrit un procédé d'induction du glaucome - comme conditions dans un modèle de rat in vivo où 50 ul de 2 M solution saline hypertonique est injecté dans le plexus veineux épiscléral. Blanchir des navires indique injection réussie. Cette procédure entraîne une perte de RGC pour simuler le glaucome. Un mois aprèsinjection, les animaux sont sacrifiés et les yeux sont enlevés. Ensuite, la cornée, le cristallin et vitreux sont enlevés pour faire un œilleton. La rétine est ensuite détachée de l'arrière de l'œil et le tombé sur des boîtes Sylgard en utilisant des aiguilles de cactus. A ce stade, les neurones de la rétine peuvent être colorées pour l'analyse. Les résultats de ce laboratoire montrent que 25% environ de RGC sont perdus dans le mois de la procédure par rapport aux contrôles internes. Cette procédure permet une analyse quantitative de la rétine la mort des cellules ganglionnaires dans un modèle in vivo d' un glaucome chez le rat.

Introduction

Le glaucome est un groupe de maladies oculaires affectant les neurones de la rétine, en particulier, les cellules ganglionnaires de la rétine 1-2. Les axones de ces cellules convergent pour devenir le nerf optique portant des informations visuelles au cerveau où la vision est perçue. Dommages à RGC et leurs axones provoque donc des défauts visuels.

Les principales caractéristiques associées à des troubles du glaucome sont RGC la dégénérescence et la mort, augmentation de la pression intraoculaire (PIO) et optique de coupe de disque et une atrophie. Ces caractéristiques conduisent à la perte du champ visuel ou complète, une cécité irréversible. À l' heure actuelle, le glaucome a causé la cécité dans 70 millions de personnes à travers le monde 3. En tant que tel, il est le troisième cause mondiale de cécité 4.

Le mécanisme exact de RGC la mort dans le glaucome demeure inconnue. Beaucoup de recherches ont été faites pour résoudre le mystère. Il est connu, cependant, que le principal facteur de risque de glaucome est une augmentation in pression intraoculaire due à la circulation irrégulière de l'humeur aqueuse (AH) dans la chambre antérieure de l'oeil. AH agit comme un substitut transparent et incolore pour le sang dans la chambre antérieure de l'oeil avasculaire. Il nourrit les cellules environnantes, élimine les déchets sécrétés des processus métaboliques, transporte les neurotransmetteurs, et permet la circulation des médicaments et des cellules inflammatoires dans l'oeil pendant les états pathologiques 1.

Le maintien de la circulation aqueuse de l'humour implique le corps ciliaire et le trabéculum. L'humeur aqueuse est produite par le corps ciliaire. Il circule alors dans la chambre antérieure pour maintenir la santé globale du tissu oculaire. 75-80% d'humeur aqueuse est activement sécrétés par la non-pigmentaire épithélium ciliaire lorsque le fluide est filtré à travers trois couches de tissu spongieux dans le muscle ciliaire. Les sorties de fluide à travers le trabéculum et à travers le canal de Schlemm qui empts dans le système sanguin 5 .La restante de 20 - 25% du débit contourne le trabéculum et passivement sécrétées par ultrafiltration et la diffusion à travers la voie de uveo-sclérale. Cette voie semble être relativement indépendante de la pression intraoculaire 1.

Lorsque la production d'humeur aqueuse et de sortie sont hors d'équilibre, la pression augmente dans l'œil. Comme indiqué, cette augmentation de la pression intra-oculaire est le principal facteur de risque pour le développement du glaucome. Une telle pression provoque des dommages aux couches complexes de neurones de la rétine à l'arrière de l'œil. Les dommages aux axones des cellules ganglionnaires de la rétine du nerf optique provoque le cerveau pour ne plus recevoir de l'information visuelle précise. En conséquence, la perception de la vision est perdue et la cécité complète peut se produire.

À ce jour, il n'y a pas de remède pour le glaucome. Différentes méthodes de traitement existent qui visent principalement à réduire la pression intraoculaire. Ceux-ci comprennent topiqueclasses de médicaments tels que les bloqueurs des récepteurs beta1-adrénergiques, ou analogues de prostaglandines topiques. Les bêta - bloquants réduisent la pression intra - oculaire en diminuant la production d'humeur aqueuse 7. Les prostaglandines fonctionnent pour diminuer la PIO en augmentant l'écoulement de l' humeur aqueuse 8-14. Alpha-adrénergiques et des inhibiteurs de l'anhydrase carbonique sont également utilisées comme méthodes de traitement secondaire. Alpha agonistes adrénergiques augmentent sortie par la voie uvéoscléral 15-17. Les inhibiteurs de l' anhydrase carbonique réduisent la production de AH par inhibition enzymatique 18. Une grande partie des procédures plus invasives sont également utilisés pour traiter le glaucome. Trabéculoplastie au laser est utilisé pour augmenter l'écoulement de l' humeur aqueuse 19. Une autre thérapie chirurgicale, appelée trabéculectomie, crée un autre site de drainage pour filtrer AH lorsque la voie trabéculaire traditionnelle est bloqué 20-21.

Ces options de traitement ont été connus pour effcacement réduire la PIO. Toutefois, jusqu'à 40% des patients atteints de glaucome montrent des niveaux de PIO normales indiquant un besoin de méthodes thérapeutiques plus complètes. 22,23 De plus, la rétine la mort des cellules ganglionnaires vu dans le glaucome est irréversible une fois qu'il commence et les traitements actuels ne pas arrêter la progression de la maladie 24-28. Cela a mis en évidence la nécessité pour les thérapies neuroprotectrices efficaces qui ciblent la survie des neurones eux-mêmes. Développement de modèles de glaucome est crucial pour ce développement.

Dans cette étude , nous démontrons une méthode d'induction des effets du glaucome comme chez les rats adultes Long Evans en utilisant une procédure modifiée initialement décrite par Morrison 29. Dans cette procédure, les injections de 2 M solution saline hypertonique dans le plexus veineux épiscléral induit des conditions de glaucome comme par le tissu des cicatrices pour réduire humeur aqueuse dans le trabéculum conduisant à une augmentation de la pression intra-oculaire et une perte importante de RGC wSEIN d' un mois de la procédure 30-31. procédures de Glaucome induisant, telles que celle décrite ici, peut être la clé pour débloquer de nouveaux développements dans les traitements du glaucome.

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Protocol

Toutes les procédures en utilisant des sujets animaux ont été en conformité avec les normes de l'Institut de protection des animaux et l'utilisation Commission (IACUC) à l'Université Western Michigan.

1. Les animaux

  1. Utilisez rats mâles et femelles de 3 mois dans cette étude.
  2. Garder les animaux dans un cycle de 12 heures de lumière / obscurité avec un accès libre à la nourriture et de l'eau.

2. Préparation de KAX Cocktail pour anesthésie animale

  1. Dissoudre 50 mg de xylazine (20 mg / ml) dans 5 ml de kétamine (100 mg / ml) avec 1 ml d'acépromazine (10 mg / ml) et 3 ml d'eau distillée. Bien mélanger.
  2. Stériliser avec un filtre à seringue et stocker cette solution dans un flacon à sérum de 10 ml.

3. KAX Injection

  1. Peser animale (g) et le retour à la cage avant d'être prêt pour l'injection.
  2. Injecter 0,1 ml KAX / 100 g de poids corporel des animaux par voie intrapéritonéale, en utilisant une seringue de 1 ml d'insuline avec une aiguille 28 G.
  3. Permettrepour animaux à devenir inconscient. Vérifiez les réflexes en pinçant les pieds et la queue.
  4. Gardez tous les animaux en toute sécurité dans le laboratoire pour la durée de la chirurgie.
  5. Post-chirurgie, remplacer les animaux dans leurs cages et de garder à l'aise dans RT jusqu'à ce que la conscience est rétablie. retour Seuls les animaux de l'animalerie lorsque les animaux se réveillent et reprendre un comportement normal.

4. Préparation pour la chirurgie et de l'Assemblée Microneedle

  1. Faire une solution stérile 2 M de NaCl.
  2. Utilisez un extracteur de microélectrodes (figure 1C) de tirer un 0,86 mm de diamètre intérieur norme poli lourd et mince tube de borosilicate paroi en deux microaiguilles de verre finement effilées (figure 1D, figure 1E).
  3. Remblayer une micro - aiguille à l'étape précédente avec 2 M de solution saline à l' aide d' une aiguille de seringue et le remblayage d' une seringue de 1 ml (figure 1B). Touchez les bulles d'air de la pointe de l'électrode.
  4. Remplir une deuxième seringue de 1 ml avec 2 MNaCl. Branchez une aiguille de 18 G, puis fixer une longueur (environ 10 pouces) de tubes en polyéthylène (figure 1A). Utiliser le piston de seringue pour remplir le tube de polyethylene avec une solution saline à travers l'aiguille.
  5. Lorsque les deux microaiguille et tubes sont remplis avec une solution saline, connectez soigneusement les deux. Éliminer l'air dans la connexion entre eux (Figure 2).
  6. Finement biseauter la pointe de la microaiguille en raclant très légèrement contre le grain d'une serviette en papier de cours.
  7. Vérifier la résistance de la microaiguille en poussant doucement le piston de la seringue jusqu'à ce qu'une fine jet de liquide peut être vu sur la serviette en papier. Le courant de liquide ne devrait pas être plus large que 0,5 mm.

5. Préparation des animaux

  1. Appliquer 1 - 2 gouttes anesthésique topique à la cornée (Proparacaine Hydrochloride Solution ophtalmique, USP, 0,5%). Attendre jusqu'à ce qu'aucun réflexe oculaire se produit.
  2. Coupez les moustaches avec des ciseaux.
  3. Saturate un applicateur de pointe de coton avec une solution de bétadine et de la zone tampon autour de l'œil expérimental.
  4. En utilisant un microscope, joindre un hémostatique pour serrer la paupière inférieure à gonfler l'œil, exposer la veine épiscléral et de limiter le mouvement des yeux. (Figure 3, flèche)

6. Glaucome induisant une injection de solution saline

  1. Lorsque l'ensemble de micro-aiguilles et l'animal sont préparés, commencer injections.
  2. Lorsque l'animal est confirmé pour être insensible aux pieds / pincement de la queue, percer soigneusement la veine épiscléral avec la microaiguille en venant à un angle faible entre 10 et 20 degrés par rapport à la veine (figure 3, flèche blanche). Une ponction réussie dans la veine est apparente lorsque le sang pénètre dans la pointe de la micro - aiguille (figure 3, flèche noire).
  3. Lentement et manuellement injecter environ 50 pi de solution saline dans la veine. Cela devrait prendre environ 10 secondes. Les veines sera blanc blanch que le sel circule through la vascularisation (figure 4, flèche). Certaines régions peuvent maintenir une apparence de sang rouge (figure 4, flèche).
    1. Réaliser une deuxième injection dans la veine, en face du site de la première, afin d'assurer une lésion rétinienne complète à la couche complète des cellules ganglionnaires de la rétine.
      Note: En quelques minutes, on devrait voir un aspect trouble distinct à travers l'iris de l'œil que le sel circule à travers le système vasculaire.
  4. Laissez l'œil opposé non traité pour être utilisé comme un contrôle interne.

7. Récupération animale

  1. Retirez le hémostatique.
  2. Utiliser un applicateur en coton pour appliquer une pommade antibiotique triple (bacitracine zinc, le sulfate de néomycine, le sulfate polymysin B) sur le site serré par la pince hémostatique et de sites d'injection. Les dommages aux tissus autour de l'œil ne se produit pas à l'aide du hémostatique.
  3. > La place anesthésié les animaux dans leurs cages sur une couverture d'eau chaude circulant à prevhypothermie ent. Garder les animaux sous observation jusqu'à ce que la conscience et le comportement normal sont repris. Transports animaux éveillés à la colonie des animaux. Les animaux restent dans la colonie jusqu'au moment du sacrifice.

8. Sacrifice animal et Retina Removal

  1. Un mois après la procédure pour induire le glaucome, les animaux sont euthanasiés par asphyxie au CO2 et à la perforation thoracique secondaire.
    1. Placez l'animal dans la chambre et mettre le couvercle en toute sécurité.
    2. Ouvrir les vannes de CO 2 et régulateur de gaz pour permettre le volume de 20% / min CO 2 déplacement oxygène dans la chambre.
    3. Prévoyez quatre à 5 min pour l'animal expirer.
    4. Éteignez les deux valves.
    5. Enlever l'animal de la chambre et effectuer une ponction thoracique secondaire avec un scalpel stérile.
  2. Après l'euthanasie, utiliser un scalpel pour couper le tissu conjonctif dans la cavité orbitale entourant l'oeil, being attention à ne pas couper dans le globe oculaire lui-même.
  3. Soigneusement utiliser des ciseaux de bord incurvées pour couper le nerf optique et tout tissu restant à extraire le globe oculaire intact. Placez globe oculaire extrait dans une boîte de 60 mm stérile x 15 mm jetable de Pétri contenant du PBS frais.
  4. Faire une œilleton du globe oculaire. Pour ce faire, faire une petite incision au scalpel juste en arrière de la frontière entre l'iris et la sclérotique. Suivez cette incision autour de la circonférence de l'œil avec de petits ciseaux de printemps pour enlever l'hémisphère cornée du globe oculaire. L'hémisphère relié au nerf optique reste.
  5. Trouvez la très mince rétine rose / beige à l'intérieur du œilleton de l'animal euthanasié. Maintenez la couche pigmentée de la rétine avec des pinces émoussées pour stabiliser l'œilleton. Utilisez une autre paire de pinces fermées pour taquiner très doucement la rétine entière intacte au large de l'arrière de l'œil. Évitez de pincer, tirer, ou tirant la rétine directement.
  6. Utilisez de petits ciseaux à ressort pour couper lezone où le nerf optique est encore attachée à la rétine.
  7. Assurez-vous de couper tout épithélium pigmentaire résiduel ou le tissu scléral de la rétine.
  8. En utilisant une pipette de transfert, transférer très doucement la rétine isolée à un Sylgard propre enduit 35 mm boîte de Pétri x 10 mm contenant du PBS frais.

9. Retina Whole-Mount Préparation

  1. Une fois dans le plat Sylgard, utilisez une pince et une aiguille de cactus à la broche de la rétine en place. Gardez la couche de cellules ganglionnaires de la rétine vers le haut et vers le bas du nerf optique. forme hémisphérique de la rétine est notable même après fixation. La courbure de la rétine se courber vers le plafond lorsque la couche de cellules ganglionnaires de la rétine est dans l'orientation souhaitée.
  2. Utilisez de petits ciseaux pour couper la rétine en quatre quadrants, ce qui rend la forme d'un trèfle à quatre feuilles rayonnant à partir de la tête du nerf optique.
  3. Epingler les quadrants de la rétine avec des aiguilles de cactus supplémentaires pour rendre la rétine aussi plat que possible without étirement (figure 5).
  4. Fixer les rétines épinglées dans le plat de Sylgard avec 3 ml de paraformaldéhyde 4% O / N à la température ambiante.

10. coloration des anticorps de la rétine

Remarque: Tache rétines fixes avec des anticorps primaires et secondaires pour visualiser les neurones de la rétine (figure 6).

  1. Rincer, rétines plates montées fixes trois fois pendant 2 minutes chacun dans du PBS.
  2. Perméabiliser les rétines avec 1% de Triton X-100 avec 1% de sérum de fœtus bovin dans du PBS pendant 60 min.
  3. Rincer rétines trois fois, 2 min chacun, dans du PBS.
  4. Rincer deux fois avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS, 5 min par lavage.
  5. Rincer deux fois avec PBS, 5 min par lavage.
  6. Incuber avec 1% de Triton X-100 et 1% de sérum de fœtus bovin dans du PBS à température ambiante pendant 45 min.
  7. Rincer deux fois avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS, 5 min par lavage.
  8. Rincer deux fois avec PBS, 5 min par lavage.
  9. Incuber chaque rétine dans 3 ml de 1% de sérum de fœtus bovin dans du PBSavec la souris purifié anti-rat CD90 / souris CD90.1 (dilution 1: 300) O / N à la température ambiante.
  10. Rincer rétines une fois avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min.
  11. Rincer deux fois avec PBS, 5 min par lavage.
  12. Incuber chaque rétine dans 3 ml de PBS (pas de FBS) avec Alexa Fluor 594 de chèvre anti-IgG de souris secondaire (1: 300) O / N à la température ambiante.
  13. Laver rétines avec du PBS généreusement.
  14. En utilisant un microscope à dissection, enlever soigneusement les aiguilles de cactus de la rétine.
  15. transférer doucement rétines sur des lames de microscope avec une pipette de transfert. Assurez-vous de maintenir l'orientation avec la couche rétinienne des cellules ganglionnaires face au plafond. forme hémisphérique de la rétine est notable même après fixation. La courbure de la rétine se courber vers le plafond lorsque la couche de cellules ganglionnaires de la rétine est dans l'orientation souhaitée.
  16. Absorber tout excès de PBS avec Kimwipe ou tout autre matériau absorbant. Veillez à ne pas absorber la rétine.
  17. Ajouter 5 gouttes de ½ glycérol et ½ PBS en poids modmédias ontage.
  18. Couvrir la rétine avec la lamelle, en évitant les bulles d'air.
  19. lamelle sécurisée à l'aide de vernis à ongles clair, colle ou autre adhésif.

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Representative Results

Cette section illustre les composants de l' appareil et la procédure utilisée pour induire des conditions de glaucome comme dans un modèle in vivo de glaucome chez le rat. Nous montrons les différents outils et l'équipement utilisés pour effectuer une injection de solution saline hypertonique qui provoque une augmentation de la pression intraoculaire. Nous montrons l'injection dans le plexus veineux épiscléral avec son effet de blanchiment caractéristique et l'aspect trouble de la chambre antérieure qui en résulte. Nous décrivons également le processus d'élimination de la rétine et de montage à plat pour l'analyse de RGC perdues. Enfin, nous montrons les effets de l'injection sur la survie des cellules ganglionnaires de la rétine. La répartition des CGR est inégale dans les différentes régions de la rétine de rat, les images sont obtenues à partir de quatre régions 200 um2 dans chaque rétine, de 4 mm du centre de la tête du nerf optique. Le nombre total de Thy 1.1 RGC marquées dans chaque section sont comptées, en moyenne et par rapport à expérimental et contr ol rétines 31. En utilisant cette méthode, le nombre de RGC a changé d'une moyenne de 225 dans une image de conditions non traitées de contrôle à 168 un mois après la procédure pour induire des conditions de glaucome comme (N = 30). Pris ensemble, les procédures décrites ici peuvent être suivis étape par étape pour analyser la mort des corps et des axones des cellules ganglionnaires de la rétine.

Figure 1
Figure 1. Composants Microneedle. (A) La seringue avec des tubes en polyéthylène utilisé pour l' injection de solution saline (B) . Remblai seringue utilisée pour remblayer la microaiguille de borosilicate. (C) Narishige électrode extracteur utilisé pour fabriquer des microaiguilles de borosilicate. (D) en verre borosilicate électrodes avant et après avoir été tiré dans l'électrode extracteur. (E) Magnified vue de la pointe de l' aiguille de microélectrodes après avoir été tiré.ftp_upload / 53831 / 53831fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Complete Microneedle Assemblée. Microneedle attaché à des tuyaux en polyéthylène fixé à la seringue avec une solution saline hypertonique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Glaucome induisant Saline Injection dans le épisclérales Venous Plexus. Image de l' injection de solution saline dans la veine épiscléral d'un live, anesthésié Long Evans rat. La pointe de flèche indique la position de la pince hémostatique utilisé pour gonfler l'oeil et empêcher son mouvement. La flèche blanche indique la emplacement de la veine injectée. La flèche noire montre retour de sang qui coule dans la pointe de micro - aiguille indiquant la réussite ponction veineuse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Blanchir Effet de solution saline hypertonique Injection. Image de l' oeil de rat injecté avec une solution saline hypertonique. La pointe de flèche montre l'effet de blanchiment caractéristique du sérum physiologique dans le plexus veineux épiscléral. La flèche indique une partie du plexus veineux épiscléral qui n'a pas encore blanchies. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5. Flat-mount de Rat Retina. L' image de l' ensemble de montage rétine retiré de l'œil de rat et épinglé à plat dans un plat Sylgard en utilisant des aiguilles de cactus. La flèche noire indique la tête du nerf optique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Les dommages aux cellules ganglionnaires rétiniennes après chirurgie Glaucome induisant. Comparaison du contrôle oeil non traité (A) à l' oeil expérimental (B) d' un mois après avoir reçu le glaucome induisant une injection de solution saline. Les rétines ont été marquées avec un anticorps contre le marqueur RGC, Thy 1.1 (CD90). flèches minces indiquent RGC individuels tant dans le contrôle et les conditions expérimentales. La procédure aboutit à une réduction du nombre de RGC, defasciculation des axones au large des principaux faisceaux d'axones, et la distorsion de la circularité de RGC restants. flèches de bloc indiquent les axones defasciculating caractéristiques résultant de l'injection de solution saline. La pointe de flèche montre un vaisseau sanguin dans la rétine. Double-ended flèches étiquette faisceaux d'axones. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit un procédé pour induire des conditions de glaucome analogue dans un modèle in vivo chez le rat. Cette procédure utilise une injection de solution saline hypertonique pour induire une cicatrisation dans le trabéculum 29, 32. Le développement du tissu cicatriciel obture l'écoulement de l' humeur aqueuse qui augmente la pression dans la chambre antérieure. Avec une diminution des sorties et l'accumulation de pression, la lentille suspendue par des ligaments élastiques repousse dans la chambre vitrée. L'humeur vitrée applique alors une pression sur la rétine d'endommager les neurones rétiniens fragiles. Nos résultats en utilisant ce procédé montrent que le nombre de cellules ganglionnaires de la rétine commencent à diminuer à partir de 2 semaines avec une perte significative de la perte des cellules ganglionnaires à 1 mois après la procédure.

Ce protocole est seulement une méthode d'induction de glaucome chez les rongeurs. Il y a beaucoup d'autres modèles expérimentaux dans lesquels des dommages aux cellules ganglionnaires de la rétine est accompli soit par une augmentation de la pression intraoculaire ou par da directemage au nerf optique 30. Souvent, ces méthodes ont été mises au point dans les grands animaux et modifiés pour l' application à des souris et des rats 33. Intraoculaires des toxines telles que la staurosporine et 34 NMDA, le glutamate analogue non hydrolysable 35 induire la mort des cellules ganglionnaires de la rétine rapide. Des études ont montré, cependant, que de telles toxines suivent une courbe dose-réponse chez les souris et les cellules d'effets autres que les cellules cibles 35 ganglionnaires. En outre, les dommages aux cellules ganglionnaires de la rétine dans ce modèle est beaucoup plus directe que la progression graduelle du glaucome humain.

Les dommages directs du nerf optique peut également être infligée. Laser axotomie est une façon courante de rompre les axones qui forment le nerf optique chez les souris 36. Cependant, ce procédé présente quelques complications. La petite taille des orbites de rongeurs, il est difficile d'endommager le nerf optique avec précision, sans affecter le flux sanguin à travers l'artère centrale de la rétineet la veine. Pour y remédier, certains chercheurs utilisent une approche plus invasive impliquant l'enlèvement d'une petite partie du cerveau afin de fournir un meilleur accès au nerf optique 37. modèles nerf optique à l'écrasement d'accéder au nerf optique intraorbitally ainsi. Dans ce modèle, le nerf est pincé par une pince à fermeture automatique et le débit sanguin oculaire ne soit pas compromise. Cette procédure aboutit à une insulte et la mort immédiate synchrone des cellules ganglionnaires de la rétine. Les études utilisant ce modèle montrent une perte significative de RGC 38. Cependant, certains affirment que cela peut induire plus de dégâts que ceux causés par une PIO élevée seule 39. En outre, le glaucome se caractérise par une lente, une perte chronique asynchrone des cellules ganglionnaires de la rétine 33, 39-42 .Par conséquent, le cours du temps et le mécanisme sous - jacent de dommages infligés avec nerf optique écrasement pourrait être tout à fait différente de celle apparaissant dans le glaucome humain. En revanche, le modèle discuté dans le présent document évite la nécessité d'acce directess au nerf optique, élimine toute la dissection du tissu cérébral, et permet des dommages aux cellules ganglionnaires de la rétine progressive.

les modèles d'occlusion microbilles d'utilisation du glaucome du polystyrène ou des billes magnétiques injectés dans les chambres antérieures de rats ou de souris pour élever la PIO. La plupart de ce travail a été fait chez la souris et ils montrent qu'une faible à modérée de dégâts dans le nerf optique avec une grande variation dans les résultats et les données incohérentes 43-50. Lors de l' utilisation des rats, la durée de la PIO élevée était trop courte pour provoquer suffisamment de dégâts aux cellules 48. Même avec des modifications à la procédure, le modèle a causé encore de graves dommages dans courte durée représentant un modèle neuropathique aiguë plutôt qu'un modèle de glaucome chronique 51. Smedowski et al 43 ont récemment mis au point une procédure de microbilles en outre modifié à l' aide d' une «blessure à haute pression» initial supplémentaire pour atteindre plus durable élévation de la PIO avec des dommages chroniques qui does prometteurs. D'autres études utilisant cette technique sont nécessaires pour valider davantage ce modèle.

Les modèles de l'hypertension oculaire chronique visent à entraver humeur aqueuse. La photocoagulation au laser de l'épiscléral et les veines limbiques 52 et épiscléral occlusion veineuse 53 sont deux de ces méthodes. Cependant, il a également été démontré que les techniques d'ablation au laser ne produisent qu'une élévation transitoire de la PIO et à un niveau de perte de cellule réelle 36, 54-55.

Le glaucome est une maladie chronique résultant de dommages et la perte de cellules ganglionnaires de la rétine dont les axones constituent le nerf optique. Le mécanisme de cette perte est inconnue. Bien qu'une augmentation de la pression intra-oculaire est le facteur de risque caractéristique, certains ont suggéré l'implication d'autres facteurs. Ces facteurs comprennent les processus inflammatoires, stress oxydatif, des irrégularités métaboliques, ou des troubles de la circulation sanguine 56-58. Afin de découvrir le mécanisme précis de cell la mort dans cette maladie, les chercheurs ont besoin de moyens simples, reproductibles et fonctionnels avec précision les conditions synoptiques apparaissant dans le glaucome humain. Seulement alors les chercheurs peuvent espérer trouver un moyen de protéger les cellules ganglionnaires de la rétine de mourir. La procédure décrite dans cet article utilise une élévation induite artificiellement de la PIO pour produire une progressive, une perte irréversible de cellules rétiniennes ganglionnaires similaires à celle observée chez les patients atteints de glaucome 31. La procédure est minimalement invasive. Rétine importante perte de cellules ganglionnaires est mesurée dans le mois suivant l'intervention chirurgicale. Cette méthode est un outil important pour l'étude du glaucome. Une limitation potentielle de cette méthode est l'injection manuelle d'une solution saline hypertonique. En raison de cette méthode manuelle, il est possible de s'attendre à une grande variabilité dans les résultats. Toutefois, nous avons identifié l'effet de blanchiment dans la veine d'être une étape critique. Si blanchissement se produit, la rétine perte des cellules ganglionnaires est toujours comprise entre 18 et 29%. À cette fin, toutes les études futures pourraient modify la procédure d'inclure des mesures de la PIO de routine pour s'assurer que ces injections conduisent à une augmentation mesurable de la pression intraoculaire. 29,31. Peut-être ce modèle de RGC mort conduira à l'élaboration d'un traitement neuroprotecteur plus complet qui lutte contre la perte visuelle dévastatrice qui affecte des millions de personnes dans le monde.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% Sigma, Life Science X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml  Putney, Inc NDC 26637-411-01 10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml Phoenix Pharmaceutical, Inc NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml VWR 16171319 Borosilicate glass
1 ml insulin syringe  VWR BD329410 28 G needle 
Sodium chloride Sigma  S7653 2 M Solution 
Microelectrode Puller  Narishige Group PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing  Sutter Instruments B150-86-10HP without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes World Precision Instruments, Inc MF28G
18 gauge Luer-Lock needle Fisher Scientific 1130421 Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing Fisher Scientific 22046941 0.034 inch diameter, approximately 10 inches 
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% Akorn, Inc NDC 17478-263-12 15 ml  sterile bottle 
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-11
Microscope Leica  StereoZoom 4
Hemostat Clamp  Fine Science Tools 1310912 curved edge
Triple Antibiotic Ointment  Fisher Scientific NC0664481
Scalpel handle Fine Science Tools  10004-13
Scalpel blade #11 Fine Science Tools  10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish VWR 351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate Sigma, Life Science  P7059-1L 1x dilution 
Spring Scissors Fine Science Tools  15009-08
Forceps (2), Dumont # 5 Fine Science Tools 11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile BD Biosciences 357524 or 52947-948 1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish  BD Biosciences 351008
Sylgard 184 VWR 102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde EMD Millipore  PX0055-3 or 818715.0100 Made into a 4% solution 
Triton X-100 Sigma  T9284-100 ml Made into both a 1% and 0.1% solution 
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biological S11150 500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 BD Pharmingen Cat 554892 1:300 dilution 
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse  Life Technologies  A11005 1:300 dilution 
Microscope Slides Corning  2948-75x25
Glycerol  Sigma  G5516-100 ml  50% glycerol to 50% PBS, by weight 
Coverglass  Corning  2975-225 Thickness 1 22 x 50 mm 
Confocal Microscope Nikon  C2 Eclipse Ti

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References

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Glaucomes induisant une procédure dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modèle de rat et Whole-mount Retina Préparation
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Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn,… More

Gossman, C. A., Linn, D. M., Linn, C. Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation. J. Vis. Exp. (109), e53831, doi:10.3791/53831 (2016).

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