Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.
Glaukom er en sygdom i centralnervesystemet påvirker retinale ganglieceller (RGC'er). RGC axoner udgør synsnerven bære visuelt input til hjernen for visuelle opfattelse. Skader på RGC'er og deres axoner fører til synstab og / eller blindhed. Selvom de specifikke årsag glaukom er ukendt, den primære risikofaktor for sygdommen er en forhøjet intraokulært tryk. Glaukom-fremkaldende procedurer i dyremodeller er et værdifuldt redskab for forskere studerer den mekanisme af RGC død. Sådanne oplysninger kan føre til udvikling af effektive neurobeskyttende behandlinger, der kunne hjælpe i forebyggelsen af synstab. Protokollen i dette papir beskrives en fremgangsmåde til induktion af glaukom – ligesom forholdene i en in vivo rottemodel hvor 50 pi 2 M hypertonisk saltvand injiceres i episcleral venøse plexus. Blanchering af skibene indikerer vellykket injektion. Denne procedure medfører tab af RGC'er at simulere glaukom. Én måned efterinjektion blev dyrene aflivet, og øjne fjernes. Dernæst hornhinden, linsen og glaslegemet fjernet for at gøre en øjestykket. Nethinden derpå skrællet fra bagsiden af øjet og fastgjort på Sylgard retter med cactus nåle. På dette tidspunkt kan neuroner i nethinden farves til analyse. Resultater fra dette laboratorium viser, at ca. 25% af RGC'er er tabt inden for en måned af proceduren i forhold til de interne kontroller. Denne procedure giver mulighed for kvantitativ analyse af retinal ganglion celledød i en in vivo rotte glaukom model.
Glaukom er en gruppe af øjensygdomme påvirker neuroner i nethinden, specifikt angår den retinale ganglieceller 1-2. Axoner af disse celler konvergere at blive synsnerven transporterer visuel information til hjernen, hvor synet opfattes. Skader på RGC'er og deres axoner forårsager derfor visuelle defekter.
De primære egenskaber i tilknytning til glaukom lidelser er RGC degeneration og død, forhøjet intraokulært tryk (IOP), og optisk disk cupping og atrofi. Disse træk fører til synstab felt eller fuldstændig irreversibel blindhed. I øjeblikket har glaukom forårsaget blindhed i 70 millioner mennesker på verdensplan 3. Som sådan, det er verdens tredjestørste årsag til blindhed 4.
Den nøjagtige mekanisme af RGC død i glaukom fortsat ukendt. Megen forskning er blevet gjort for at låse mysteriet. Det er imidlertid kendt, at den primære risikofaktor for grøn stær er en stigning in intraokulære tryk på grund af uregelmæssig cirkulation af kammervæske (AH) i det forreste kammer i øjet. AH fungerer som en transparent og farveløs erstatning for blod i avaskulære forreste kammer i øjet. Det nærer de omkringliggende celler, fjerner udskilte affaldsprodukter fra metaboliske processer, transporterer neurotransmittere, og tillader cirkulation af narkotika og inflammatoriske celler i øjet under patologiske tilstande 1.
Opretholdelsen af kammervand cirkulation involverer corpus ciliare og trabekelværket. Kammervand produceres af corpus ciliare. Det strømmer så ind i det forreste kammer for at opretholde den generelle sundhed i det okulære væv. 75 – 80% af kammervand udstrømning aktivt secerneres gennem ikke-pigmentglaukom ciliære epitel når fluidet filtreres gennem tre lag af svampet væv i den ciliære muskel. Fluidet kommer ud gennem trabekelværket og gennem Schlemm Kanal som træde i stedet forerne i blodsystemet 5 .Den resterende 20 – 25% af udstrømning omgår trabekelværket og passivt udskilles af ultrafiltrering og diffusion gennem uveo-sclerale pathway. Denne vej synes at være relativt uafhængig af intraokulært tryk 1.
Når vandvæskeproduktionen og udstrømning er ude af balance, trykket opbygges inde i øjet. Som nævnt, denne stigning i intraokulært tryk er den primære risikofaktor i udviklingen af glaukom. Sådant tryk medfører skade på indviklede lag af neuroner i nethinden bagerst i øjet. Skader på retina ganglieceller axoner af synsnerven får hjernen til at ikke længere modtage nøjagtig visuel information. Som følge heraf er opfattelsen af synet tabt og fuldstændig blindhed kan forekomme.
Til dato er der ingen kur mod grøn stær. Forskellige behandlingsmetoder findes der primært sigter mod at reducere det intraokulære tryk. Disse omfatter aktueltmedicin klasser såsom beta1-adrenerge receptorblokkere eller aktuelle prostaglandin analoger. Beta-blokkere reducerer det intraokulære tryk ved at reducere produktionen af kammervand 7. Prostaglandiner funktion at reducere IOP ved at øge udstrømningen af vandig humor 8-14. Alfa-adrenerge agonister og kulsyreanhydrasehæmmere anvendes også som sekundære behandlingsmetoder. Alfa-adrenerge agonister øger udstrømning gennem uveosclerale pathway 15-17. Carboanhydrasehæmmere reducere produktionen af AH ved enzymatisk hæmning 18. Meget mere invasive procedurer anvendes også til behandling af glaukom. Laser trabeculoplasty bruges til at øge udstrømningen af vandig humor 19. En anden kirurgisk terapi, kaldet trabekulektomi, skaber en alternativ drænage site at filtrere AH når den traditionelle trabekulære pathway bliver blokeret 20-21.
Disse behandlingsmuligheder har været kendt for effectively reducere IOP. Men op til 40% af glaukom patienter viser normale IOP niveauer indikerer et behov for mere komplette terapeutiske metoder. 22,23 Derudover retinal ganglion celledød set i grøn stær er irreversibel, når det begynder og nuværende behandlinger ikke stoppe progressionen af sygdommen 24-28. Det har understreget behovet for effektive neurobeskyttende behandlingsformer, der er målrettet overlevelsen af neuroner selv. Udvikling af glaukom modeller er afgørende for denne udvikling.
I denne undersøgelse viser vi en fremgangsmåde til induktion glaukom-lignende virkninger i voksne Long Evans-rotter under anvendelse af en modificeret procedure oprindeligt skitseret af Morrison 29. I denne procedure, injektioner af 2 M hypertonisk saltvand ind i episcleral venøse plexus inducerer glaukom-lignende tilstande ved ardannelse væv for at reducere kammervæske udstrømning i trabekelværket fører til en stigning i intraokulært tryk og et betydeligt tab af RGC'er wnden en måned efter proceduren 30-31. Glaukom-fremkaldende procedurer, som den her beskrevne, kan være nøglen til at frigøre nye udviklinger i glaukom behandlinger.
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til induktion glaukom-lignende forhold i en in vivo rottemodel. Denne procedure anvender en injektion af hypertonisk saltvand til at inducere ardannelse i trabekelværket 29, 32. Udvikling arvæv okkluderer udstrømningen af kammervæske, som forøger trykket i det forreste kammer. Med nedsat udstrømning og trykopbygning, linsen suspenderet af elastiske ledbånd skubber tilbage i den glasagtige kammer. Glaslegemet gælder så tryk på nethinden beskadige de…
The authors have nothing to disclose.
C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).
Xylazine hydrochloride, Minimum 99% | Sigma, Life Science | X1251-1G | |
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL | Putney, Inc | NDC 26637-411-01 | 10 mL bottle |
Acepromazine Maleate, 10mg/mL | Phoenix Pharmaceutical, Inc | NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408 | 50 mL bottle |
Serum bottle, 10 mL | VWR | 16171319 | Borosilicate glass |
1 mL insulin syringe | VWR | BD329410 | 28 gauge needle |
Sodium chloride | Sigma | S7653 | 2 M Solution |
Microelectrode Puller | Narishige Group | PP-830 | |
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-10HP | without filament, 0.86 mm |
Microfil syringe needle for filling micropipettes | World Precision Instruments, Inc | MF28G | |
18 gauge Luer-Lock needle | Fisher Scientific | 1130421 | Syringe needle |
Flexible Polyethylene Tubing | Fisher Scientific | 22046941 | 0.034 inch diameter, approximately 10 inches |
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5% | Akorn, Inc | NDC 17478-263-12 | 15 mL sterile bottle |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
Microscope | Leica | StereoZoom 4 | |
Hemostat Clamp | Fine Science Tools | 1310912 | curved edge |
Triple Antibiotic Ointment | Fisher Scientific | NC0664481 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Scalpel blade # 11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish | VWR | 351007 | |
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate | Sigma, Life Science | P7059-1L | 1x dilution |
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
Forceps (2), Dumont # 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile | BD Biosciences | 357524 or 52947-948 | 1 and 2 mL graduations |
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish | BD Biosciences | 351008 | |
Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
Cactus Needles | N/A | N/A | |
Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055-3 or 818715.0100 | Made into a 4% solution |
Triton X-100 | Sigma | T9284-100 mL | Made into both a 1% and 0.1% solution |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biological | S11150 | 500 ml |
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1 | BD Pharmingen | Cat 554892 | 1:300 dilution |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11005 | 1:300 dilution |
Microscope Slides | Corning | 2948-75×25 | |
Glycerol | Sigma | G5516-100 mL | 50% glycerol to 50% PBS, by weight |
Coverglass | Corning | 2975-225 | Thickness 1 22 x 50 mm |
Confocal Microscope | Nikon | C2 Eclipse Ti |