The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.
Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.
يقيس فحص القلوية المذنب فواصل حبلا الحمض النووي على مستوى خلية واحدة. هي جزء لا يتجزأ تعليق من الخلايا وحيدة في الاغاروز على شريحة المجهر والخلايا هي lysed لتشكيل nucleoids، والتي تحتوي على حلقات supercoiled من الحمض النووي. الكهربائي في الرقم الهيدروجيني> 13 النتائج في فقدان supercoiling في الحلقات الحمض النووي التي تحتوي على فواصل حبلا، مع فروع سراح من الحمض النووي الهجرة نحو القطب الموجب، وخلق هياكل تشبه المذنب التي يمكن ملاحظتها بواسطة المجهر مضان. الحمض النووي مجزأة يهاجر من "الرأس" من المذنب في "ذيل" على أساس حجم جزء، ومضان النسبي للذيل المذنب بالمقارنة مع كثافة الإجمالية (الرأس والذيل) يمكن استخدامها لتحديد الحمض النووي الكسر 1 ، 2. فحص بسيط، حساسة، وتنوعا، سريع، وغير مكلفة نسبيا 1. ويستخدم للكشف عن الحمض النووي مجزأة الناجمة عن عوامل ضارة الحمض النووي للفحص لتحديد كمية الحمض النووي من التلف في الخلايا أو عزل نواة من indiviالأنسجة المزدوج من الحيوانات تعامل مع المواد السامة للجينات يحتمل أن تكون (الصورة). نظرا لمزاياها، وأوصى في الجسم الحي المذنب مقايسة كما في الجسم الحي السمية الوراثية الفحص الثاني (يقترن في الجسم الحي للفئران الاختبار) لإجراء تقييم سلامة المنتجات في المؤتمر الدولي الحالي على مواءمة (ICH) (3) وهيئة سلامة الأغذية الأوروبية (EFSA ) 4 المبادئ التوجيهية التنظيمية. في المختبر، ونحن قد استخدمت فحص لتقييم في الحمض النووي من التلف الجسم الحي الناجم عن المكونات الغذائية والأدوية والمواد النانوية 5-10. وسيتم استخدام كبد الفئران كمثال في هذا البروتوكول، ولكن مقايسة المذنب لا يمكن أن يؤديها مع الأنسجة الأخرى / أجهزة حيوانات التجارب، طالما الخلايا واحدة سليمة يمكن عزلها عن الأنسجة.
أنواع معينة من الحمض النووي من التلف صعبة للكشف عن فواصل حبلا الحمض النووي من دون تعديل فحص القلوية المذنب الأساسي. في حالة الحمض النووي من التلف التأكسدي، حبلا بيمكن إنشاء reaks في الآفات التأكسدي في الحمض النووي عن طريق هضم مع الانزيمات إصلاح مثل الإنسان 8 oxoguanine-DNA-N-glycosylase 1 (hOGG1، مما يخلق فواصل في 8 oxoguanine (8 oxoGua) وميثيل fapy-جوانين 11. أيضا، نوكلياز داخلية الثالث (إندو الثالث) يخلق فواصل أساسا في البريميدينات أكسدة 1. وهكذا، إضافة خطوة انزيم الهضم يجعل فحص طريقة محددة وحساسة لقياس الحمض النووي من التلف التأكسدي في الجسم الحي (12). وباستخدام هذه المقايسات، لقد أثبتنا التي يسببها التسمم الحمض النووي من التلف التأكسدي في كبد الجرذان والفئران 6-8 وفي قلب الفئران 10.
فحص القلوية المذنب العديد من التطبيقات في علم السموم وراثية والرصد الحيوي الإنسان: 1)، ومتابعة في فحص الجسم الحي لgenotoxins التي حددها حساسة في المختبر اختبارات 3،13، 2) لتقييم آليات الحمض النووي من التلف الناجم عن أجنبي بيولوجيا في أنسجة متعددة 14، 3) للتحقيق في ما إذا كانمادة مسرطنة تعمل باستخدام السمية الوراثية أو وضع غير السمية العمل (وزارة الزراعة) 7، 4) لتقييم إصلاح الحمض النووي الضرر 15، 5) للتحقيق في الأمراض التي تصيب الإنسان والتعرض المهني 16، و 6)، ومحتمل الإنتاجية العالية فحص الكشف عن جهاز معين السمية الوراثية 17.
يصف هذا البروتوكول قياس المتزامنة لكل من الحمض النووي من التلف التأكسدي المباشر وفي كبد الفئران على مستوى خلية واحدة. بروتوكول عام ينطبق على أي نوع من الأنسجة التي الخلايا وحيدة النواة أو يمكن أن تكون معزولة مع الحد الأدنى من الحمض النووي من التلف الناجم عن تصنيع (?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) | HyClone | SH30588.02 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
slide labels, (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
2.0 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1000 |
hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1000 |