Abstract
Различия в активности нейромедиаторов и нейромодуляторов, и, следовательно, различных нервных реакций, можно найти между наркозом и бодрствующих животных. Таким образом, методы, позволяющие манипулировать синаптические системы у бодрствующих животных необходимы для того, чтобы определить вклад синаптических входов в нейронную обработку незатронутой анестетиков. Здесь мы представляем методологию построения электродов для одновременной записи внеклеточной нейронной активности и высвобождения множественных нейроактивные веществ в непосредственной близости от мест записи в активных мышей. Комбинируя эти процедуры, мы провели микроионофоретическое инъекции габазин выборочно блокировать рецепторы ГАМК в нейронах нижней бугорок мышей с черепно-сдержанной. Габазин успешно модифицировать нейронные свойства отклика, такие как область частот отклика и адаптации стимула конкретным. Таким образом, мы показали, что наши методы подходят для recordinг одноквартирный активности и рассечения роль специфических рецепторов нейромедиаторов в слуховой обработки.
Основным ограничением описанной процедуры является относительно короткий промежуток времени записи (~ 3 ч), которая определяется уровнем привыкания животного к записи сессий. С другой стороны, несколько сеансов записи могут быть выполнены в том же животном. Преимущество этого метода по сравнению с другими экспериментальными процедурами, используемыми для управления уровнем нейротрансмиссии или нейромодуляции (например, системных инъекций, или использование оптогенетика моделей), является то, что действие препарата ограничивается местным синаптических входов к целевой нейроне. Кроме того, на заказ изготовление электродов позволяет регулировать конкретные параметры в соответствии с нейронной структуры и типа нейроном интерес (например, сопротивление наконечника для улучшения отношения сигнала к шуму записей).
Introduction
Взаимодействие нервного возбуждения и торможения является основой для обработки сенсорной информации 1. Известно также , что анестезия оказывает сильное влияние на динамику корковой активации и временной структуре синаптических входов 2,3. Например, было замечено , что анестетики изменить продолжительность визуально, вызвали ответы корковых нейронов 3,4. Кроме того, соотношение между возбуждающих и тормозящих синаптических входов отличается под наркозом и бодрствующих животных 4,5, изменения и вызывали и частота спонтанных активности 6,7. Путем измерения синаптических проводимостей, Haider и его коллеги 4 обнаружили , что ингибирование соответствует возбуждение в амплитуде под наркозом , тогда как во время бодрствования, торможение было сильнее , чем возбуждение. Эти данные подскажут развитие экспериментальных методик для изучения влияния специфических синаптических входов на сенсорной обработки у бодрствующих животных.
<р класс = "jove_content"> Контролируемый выброс заряженных нейроактивных веществ путем применения небольших инъекции тока (порядка нА) широко используется для изучения вклада синаптических входов и роль мнимых клеточных рецепторов в сенсорной обработки 8-13 , Этот метод, известный как microiontophoresis, допускает применение лекарств в непосредственной близости от записанного нейроне, что способствует быстрому и ограниченного эффекта. Эта процедура является более подходящим для изучения локальных эффектов нейроактивных веществ, по сравнению с широко распространенным эффектом, вызываемой другими экспериментальных манипуляций, таких как системные инъекции, микродиализом или использование оптогенетика методов. Как правило, конфигурация электродов контрейлерных 14,15 используется для одновременной записи целевого нейрон и доставить нейроактивные вещества , представляющие интерес. Он состоит из записывающего электрода, присоединенного к multibarrel пипетку, которая несет нейроактивные вещества. Модификации Oпервоначально оплащенной процедура описана Хэви и Каспари 14 были реализованы. Например, вольфрамовым электродом, а не стакан один, может быть использован для записи нейронной активности 16. Ранее опубликованные методы изготовления вольфрамовых электродов 17,18 включают три основных этапа: электролитическое травление вольфрамовой проволоки наконечники, стеклянной изоляции и регулировки экспозиции наконечника для удовлетворения требований записи.Интересный и поднимающихся поле в слуховом нейробиологии является изучение адаптации стимула специфических (SSA 19). SSA является специфическим снижение нервной реакции на повторяющиеся звуки, которые не обобщается на другие, редко представленных звуков. Важность SSA заключается в ее потенциальной роли в качестве нейронный механизм обнаружения основной девиантности в слуховом головного мозга, а также возможного нейронного корреляте для позднего негативность рассогласования компонента слуховых вызванных потенциалов 20,21. SSA оccurs от IC до слуховой коры 19,22-24. ГАМК -опосредованного ингибирование было продемонстрировано , чтобы действовать в качестве механизма регулировки усиления на SSA 7,16,25, который также , как было показано, будут затронуты анестезии 26. Здесь мы приводим протокол , который сочетает в ранее описанных способов для записи моноблочный активности IC нейронов до и во время применения селективного антагониста ГАМК А -рецепторов у бодрствующих мышей. Во-первых, мы описываем изготовление контрейлерных электродов и рядом, хирургических и записывающих методов. Для проверки эффективности высвобождения лекарственного средства, мы сравнили рецептивного поля, а также уровень SSA ИМС нейронов до и во время микроионофоретическое выброса габазин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры проводились в Университете Саламанки с одобрения и с использованием методов, соответствующих стандартам, Университет Саламанки животных комитета по уходу, а также стандарты Европейского Союза (Директива 2010/63 / ЕС) для использование животных в научных исследованиях нейронауки.
1. вольфрамовые электроды
Примечание: Производство вольфрамовых электродов основан на оригинальной методике , описанной в Мерриллом и Эйнсвортом 27 и Ainsworth и др 28 и выполнены с использованием установки рабочей станции , описанной в Bullock и др. 17..
- Для записи моноблочный внеклеточной активности нейронов IC, используют электроды с наконечником сопротивлением 1,5 - 2,5 МОм. Здесь, шаги, участвующих в производстве вольфрамового электрода описаны только кратко, поскольку подробное описание можно найти в вышеуказанных ссылках.
- Поместите вольфрамовых проволок в заказного выравниванияИнструмент (фиг.1А) , чтобы помочь разрезая их до нужной длины. Инструмент выравнивания состоит из 30 игл (25 г), склеенных параллельно на 2 мм с интервалом, с остановкой на одном конце, чтобы ограничить длину проводов до ~ 40 мм. Тщательно прикрепите свободные концы проводов с помощью клейкой ленты, и вырезать остальную часть проволоки с сильными ножницами.
- Аккуратно потяните с ленты, чтобы удалить вольфрамовые провода из инструмента выравнивания, убедившись в том, что все провода остаются прикрепленными к ленте. Раскатайте ленту на полированной латуни шпинделя (рис 1B, C), держа провода плотно прилегают к шпинделю так есть хороший электрическое соединение.
- Подключение шпинделя до 5 оборотов двигателя в рабочей станции, и погружать торчащие кончики проволоки в качестве травильного раствора (KNO 2, 90 г на 80 мл). Угол шпиндель оси 45 ° по отношению к поверхности травильного раствора. Погрузить концы проводов, так что ~ 1/3 провода контакта раствора.
- ИммERSE Угольный стержень электрода в травильной ванне, чтобы замкнуть цепь. Используйте пружины медной оплетки кисть, чтобы применить подачу травильного к шпинделя вала в то время как шпиндель вращается. Регулировка тока, который проходит через электроды и травильного раствора до 250 мА. Остановить кончик травление, когда ток падает до 200 мА. Кончики проволоки будут выгравированы на очень мелкие точки.
- Пропустите одну заостренную проволоку через пламя, чтобы удалить смазку и остатки клея. Поместите провод (тупой конец первой) в боросиликатного стеклянного капилляра (1,5 мм OD, 0,86 мм ID) с нижним концом блокированы формовочной глины. Хомут пипетку вертикально в верхней и нижней части. Потяните пипетки с помощью нагревательного змеевика (диаметр 5 мм, глубина 5 мм) и условный поршень. По мере того как провод вытягивается вниз по весу плунжера, расплавленное стекло образует очень тонкий слой вокруг него.
- Извлеките стакан, охватывающий наконечник на острый конец электрода с помощью расплавленного шарика натриятетраборат. Для того, чтобы сформировать шарик, смешать тетраборат натрия (~ 0,25 г) с небольшим количеством воды (~ 0,5 мл) и медленно поместите его на нагревательный элемент, пока он не расплавится в шарик ~ 2 мм в диаметре. Температура нагревательного элемента управляется с помощью потенциометра. Поместите шарик и нагревательный элемент на манипуляторе рычаг прикреплен к столу, и переместить его, пока шарик не ориентирован под микроскопом при малом увеличении.
- Закрепите застекленной провод к слайду и поместить его под микроскопом. Переместить слайд с этапом ручки до кончика и тетраборат шарика не находятся в фокусе. Нагреть шарик, пока он не расплавится чуть-чуть, и вставьте наконечник провода ~ 10 - 15 мкм. Включите отопительный потенциометр выключен. По мере того как шарик остывает, он сжимается и удалить стекло из кончика электрода, подвергая лежащим под ним вольфрамом. Вольфрамовый электрод готов к использованию.
2. Multibarrel стеклянную пипетку Производство
- Защитите концы мультибаррель стеклянные капилляры (пять баррелей в H-конфигурации) с термоусадочной трубкой, чтобы обеспечить лучшее сцепление с Съемник хомутов и предотвратить поломки, и поместите один в вертикальном съемника.
- Чтобы получить наконечник длины ~ 15 мм, установите съемник к следующим параметрам: Тепло: 84, Суб магнит сила: 49, главный магнит сила: 38. Тонкая настройка этих параметров в зависимости от конкретной установки, а также после изменения параметров нагревательный элемент.
- Протяните капилляр, чтобы получить две пипетки с кончиков Окклюдированный. Установите пипетку на слайде с помощью пластилина и сломать кончик пипетки под микроскопом, пока наружный диаметр не ~ 20 - 30 мкм, с помощью тонких ножниц или щипцов, или плоскую сторону скальпелем. Если сломанный край является слишком грубой, уточнить его с помощью метода тетраборат шарик, описанный в шаге 1.7.
- Поместите вольфрамовым электродом (из раздела 1) в держатель, выполненный с иглой 20 G в конце 3-осевой миниатюрный микроподвижки монтируется на микроскоп оленеме. Использование щипцов, согнуть конец электрода 5 - 10 ° ~ 30 мм от кончика.
- Под микроскопом, тщательно выравнивать вольфрамового электрода к соплу multibarrel. После того, как выровнен, опустите электрод, пока он контактирует с multibarrel, фитинг в паз между двумя верхними баррелей. Вставьте кончик электрода, пока она не высовывается ~ 15 - 20 мкм от кончика multibarrel. Сделать угол между электродом и multibarrel как можно меньше, чтобы получить лучшее сцепление и более тонкого ансамбля.
- Нанесите небольшое падение света излечим клеевой ~ 5 мм от кончиков. Будьте осторожны, чтобы клей не доходит до кончика, чтобы избежать блокирования multibarrel каналов.
- Вылечить клей с помощью лампы синего света LED. Повторите нанесения клея / отверждения при необходимости, для лучшего сцепления.
- Перемещение столика микроскопа осторожно до конца вольфрамового электрода не высвобождается из держателя. Удалите контрейлерных ансамбль из слайда.
- Оберните-йе средняя часть контрейлерные заднего электрода в короткой длине термоусадочной трубки и применять быстрое отверждение эпоксидной подходящий для стекла для дальнейшего закрепления вольфрамового электрода к multibarrel.
3. Препараты для Microiontophoresis
Примечание: Препараты, используемые для microiontophoresis должны иметь электрический заряд при растворении в воде. Проверьте литературу, чтобы увидеть, если препарат интереса подходит для этой процедуры. Здесь процедура габазин, антагонист рецептора ГАМК А, описан.
- Фильтр дистиллированной воды с помощью шприца 0,2 мкм фильтр для стерилизации воды и обеспечить не содержащая растворенные вещества. Готовят ~ 1000 мкл 20 мМ габазин с помощью этого дистиллированную воду.
- Доводят рН разбавления до 4 с 0,2 мкм фильтрованной NaOH с помощью тонкой кончик электрода рН.
- Хранить в 100 - 200 мкл аликвоты при -20 ° С. Размораживание в день записи. В тот же день, до того, как животное сдерживатье изд, заполнить бочки (3 - 5 мкл) multibarrel электрода с лекарствами, с использованием 100 мкл микрошприца, снабженный гибкой пластиковой иглой.
4. Хирургия и Headpost Имплантация
- Выполните эксперименты в двух самцов мышей линии CBA / J (Mus Musculus) с весом 27 и 30 г. Следуйте хирургических и записи процедур Брайант и его коллеги 29, Portfors и сотрудники 30-32 и Дуке и Мальмьерка 26.
- В дни до операции, обращаться с животными и приучить их к записи камеры, позволяя им свободно исследовать. Выполните 3 сеанса в день, каждый из которых продолжительностью не менее 30 мин. Таким образом, животные будут более спокойным и комфортным во время записи.
- Обезболить мышь с использованием смеси кетамина (50 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) вводят внутримышечно. С помощью этой дозы животное глубоко под наркозом в течение около 1 часа. Дайте дополнительные дозы одного thirг исходной дозы при необходимости.
- Место животное на нагревательном одеяле установлен для поддержания температуры 38 ± 1 ° С и стабилизировать голову животного в стереотаксической раме с помощью двух ушных бара и руст. Будьте осторожны, чтобы не проколоть барабанную перепонку с решеткой уха.
- Защитите глаза путем нанесения капли офтальмологических геля.
- Бритье кожи головы с помощью ножниц и применять повидон-йод для дезинфекции кожи.
- Используя скальпель, сделайте надрез вдоль средней линии, чтобы выставить череп и спрячьте надкостницу, покрывающую теменной и более ростральной части затылочной кости.
- Клей легкий дюралевый headpost (вес ~ 0,65 г, длина 30 мм, рис 2А) с круглым и плоским основанием (диаметр 5 мм) на черепе. Клей серебряную проволоку к середине headpost оставляя концы свободными. Серебряный провод будет использоваться в качестве опорного электрода для электрофизиологические записи.
- Нанесите тонкий слой LIGХТ-отверждаемый клей на черепе и основание headpost. Подождите 10 секунд и поместите headpost над ростральной области теменных костей, вдоль средней линии.
- Для эффективной прочности сцепления, Заполимеризуйте клей с использованием синего источника света в течение 20 сек.
- Просверлить три отверстия вокруг и позади основания headpost с помощью электрической дрели и небольшой сверло.
- Поместите два часовых винта (2 ~ длина мм) в просверленные отверстия, чтобы служить в качестве дополнительных точек контакта между черепом и headstage. Винты требуют 1 ½ поворачивается, чтобы добиться плотного прилегания. Проверьте винты с щипцами, чтобы убедиться, что они не свободны.
- Вставьте кончик серебряного провода заземления в третье отверстие убедившись, что он контактирует с Dura. Нанесите небольшое каплю воды клея устойчивостью цианакриловым связывать проволокой к черепу.
- Нанесите светоотверждаемый композит для усиления скрепление headpost с черепом. Накройте основание headpost, нижняя часть из серебряной проволоки,и винты, соблюдая осторожность, чтобы не продлевать за лямбда, чтобы разрешить доступ во время записи. Лечение с использованием синего источника света.
- Втяните мышцы на задней части шеи вблизи его вставки на черепе. С помощью небольшой трепана (2,35 мм диаметр), просверлить круглое окно чуть ниже лямбда швом и сбоку от средней линии, чтобы выставить нижнюю бугорок (IC). Когда границы ослаблены, подтяните покрытие кости с мелкими пинцетом. Если происходит кровотечение, промыть холодной стерильным физиологическим раствором, чтобы остановить его.
- Сделайте небольшой (~ 1 мм в ширину и ~ 1 мм высотой) стены вокруг окна с композитным и светоотверждаемый его.
- Накройте обнаженный череп и мышцы с антибактериальной мазью. Затем смочить открытую поверхность IC стерильным физиологическим раствором и покрыть ее вазелином, заполняя скважину генерироваться после создания стены вокруг окна записи.
- Вводят бупренорфиновое подкожно (0,03 мг / кг, разбавленный 1:10 в стерильном физиологическом растворе) в качестве обезболивающего средства.
- Держите животное на тон нагревая одеяло, пока он не будит и вернуть его в клетку жилья, чтобы оправиться от операции в течение трех дней до начала записи сессий. Дом животных в индивидуальной клетке rat's корпуса, чтобы предотвратить обойме товарищей вычищать желе и headpost прикоснутся к крышке металлической сетки. Поместите некоторое обогащение в клетке, когда сингл располагается животное. Кроме того, меняются ежедневно с опилками, чтобы предотвратить инфекцию и тщательно проверить, что животное восстанавливается должным образом и не показывает никаких признаков дискомфорта. Кроме того, проверьте, если вазелин находится над окном записи, защищающего мозг подвергается.
5. Электрофизиологические Запись и Microiontophoresis
- После выздоровления дать время животных, чтобы акклиматизироваться к среде записи и имеющую свою голову сдержанной. Акклиматизироваться животное путем фиксации headpost к держателю в то время как мышь сидит на заказ мягкой пены фиксатор вырезанной с размером тела (рис 2В). Это будет Итэто движение мыши и будет способствовать его спокойствию.
- Начните с 10-минутной сессии и постепенно увеличивать продолжительность до 120 мин. В ходе сессии наградить животных со сладкими жидкостями (сгущенное молоко, разбавленный в воде 30:70) через заданные интервалы времени 33. Позже, во время сеанса записи, дают такую же награду, в начале и в конце сеанса или пока ни нейрон не изолирована.
- Если животное очень возбуждается перед записью, впрыскивать мягким успокаивающим Ацепромазин (2 мг / кг, внутрибрюшинно). Согласно нервной системе интерес, седативное может повлиять на ваши результаты.
- Пусть животное свободно исследовать записи камеры в течение 5 - 10 мин.
- Поместите тело животного в пену выполненный на заказ мягкой фиксатор (рис 2В).
- Закрепите headpost к держателю , прикрепленной к стереотаксической рамы (рис 2C). Это хорошее время, чтобы дать животному жидкости награду.
- КолорадоVer тела животного с помощью ватного одеяла и свободно закрепите его с помощью пластиковой hemicylinder и клейкой ленты.
- Удалите вазелин из окна записи и смойте теплой стерильным физиологическим раствором.
- Запись нейронной активности и ионтофоретическое применение габазин.
- Поместите multibarrel электрода на держателе, управляемый микроприводом и прикрепленную к микроманипулятора.
- Подключите провода для записи, используя небольшие крокодил. Подключите положительный вывод до конца вольфрамового электрода и клеммы заземления к серебряной проволоки, которая контактирует с Dura.
- Поместите непокрытую серебряную проволоку внутри каждого ствола, так что один из концов входит в контакт с раствором, а другой конец доступен. Соедините эти концы к microiontophoresis устройства, следуя инструкциям изготовителя.
- Переместите multibarrel электрод пока кончик контактирует с поверхностью мозга. Нанесите теплую стерильного физиологического раствора, чтобы предотвратить высыхание гое ткань мозга. На этом этапе применяют ток удержания (от -10 нА для габазин, проверить литературу для конкретного препарата), чтобы избежать утечки лекарственного средства из наконечника ствола, ища моноблочный деятельности.
- Используйте стандартные методы для выделения одного нейрона внеклеточной активности. Получить область частотного отклика (FRA) нейрона, то есть комбинация частот и интенсивностей способны вызвать отклик , потому что нейрон чувствителен к этим звукам 34-36.
- Выберите две частоты (f1 и f2), которые вызывают аналогичную скорость стрельбы и рисунок. Представьте каждый из этих частот, как редкие и повторяющиеся стимулы под чудаком парадигмы.
Примечание: Если коротко, то в чудаком парадигмы, одна частота (f1) представлен в виде повторяющегося стимула с высокой вероятностью возникновения, а вторая (f2) является редко встречающиеся девиантного стимула, чередующиеся случайным образом среди повторяющихся единиц. Во втором чудаком последовательности, относительнаявероятности двух раздражителей поменялись местами. Подробная информация о парадигме стимуляции были описаны ранее 22,37. - Отпустите габазин путем сдвига тока до положительных значений (10 - 20 нА). Получить снова FRA и повторить чудак парадигмы при применении габазин. Поддерживать выброс до видимого эффекта в скорости стрельбы наблюдается; она обычно занимает 5 - 20 мин, в зависимости от конкретного препарата, его концентрации, а также от величины тока выброса. Повторите протокол записи для получения значений под действием препарата.
- Остановить инъекции, возвращая ток удержания значений. Подождите, действие препарата, чтобы смыть с помощью мониторинга, что FRA или ответом на чудака парадигме возвращает для управления значения.
Примечание: записи сессий может длиться 2 - 3 ч в сутки, и должна быть закончена раньше, если животное проявляет никаких признаков дискомфорта или изо всех сил. Дайте вознаграждение жидкости и покрывают ч записиЯнтарь с вазелином.
Анализ 6. Данные
- Мера FRA до и во время инъекции габазин, а также уровень SSA.
- Количественно сила реакции SSA общим индексом-SSA (CSI) и частотно-специфических индекс SSA (СИ) , как описано ранее 19,22,23,38,39. CSI и SI отражают нормированную разницу между нейронного ответ на редкий стимул и ответ на повторяющиеся один. Положительные значения CSI и SI указывают на нервную реакцию (шипы на раздражитель) был выше, чем к редким повторяющимся тонов.
- Сравните данные из управления и выброса лекарственного средства состояния.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы записали моноблочный активность 4 хорошо изолированных нейронов IC. Типичное отношение сигнал-шум , полученные в ходе внеклеточных записи у бодрствующих мышей показаны на фигуре 3В. На фиг.4А показана область частотного отклика (FRA) каждого нейрона до и во время блокады ГАМК А -рецепторов с габазин. Наблюдали приращение силы реакции (шипы / стимул), а также к уширению спектральной перестройки. Приращение вызванной реакции было отмечено также в накопившихся временных гистограмм пери-стимулов , полученных из нервной реакции на всех частот и интенсивностей представленной (4В).
Были выбраны одна или две пары частот в пределах ОЛР нейрона (крестики на рисунке 4A) , которые будут представлены в виде повторяющихся или редких звуков в чудаком парадигмы, к sTudy уровень ССА в своих ответах. Для двух нейронов, например , звуковые вызвали ответы на каждой частоте (f1 и f2) до и во время инъекции габазин показаны в виде растров точек на рисунке 5А, В. Для двух нейронов например, было явное изменение в звуке-ответ вызвала как это наблюдалось в растр точек и PSTHs.
Кроме того, локальная блокада -рецепторов ГАМК увеличили нейронную реакцию на подавляющее большинство редких и повторяющихся тонов (рис 5C) в согласии с нашим предыдущим исследованием 16. Различные уровни SSA наблюдались в нервных реакций на f1 и f2, что нашло отражение в положительной CSI (интервал CSI: -0,26 до 0,43, 0,25 ± 0,23) и значения SI (интервал интеграторы: -0,41 до 0,83, 0,25 ± 0,23) , Для большинства случаев, повышенная реакция на повторяющийся тон вызвал падение этих показателей , как отмечено на рисунке 5D
Рисунок 1. Материал для изготовления вольфрамовых электродов. (A) Электрод инструмент выравнивания, с некоторыми вольфрамовой проволоки в месте. Чем светлее кусок слева остановка для проводов. Кончик ножничные указывает сторону , используемый в качестве направляющей для резки провода до нужной длины. (B) Пустой шпиндель. (C) Шпиндель с партией электродов , прикрепленных, и опираясь на держателе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Аксессуары для Awake Мышей Recordings. (A) Headpost. (B) на заказ мягкой пены удерживающим. Место тон мышь между обеими частями, оставляя голову наружу. (C) Изменения в стереотаксической рамы. Держатель headpost (верхняя панель) помогает во время headpost имплантации и удерживает голову во время записи. Укус часть (нижний бар) используется только во время имплантации headpost. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Пример записи в Awake мыши. (A) область Частотная характеристика нейрона от мыши IC. (B) осциллограммы шипов , записанных от этого нейрона. (C, D) Dot растровые и peristumulus времени Гистограмма записанные от этого нейрона с использованием чудак парадигмы на частотах показали точками на (А). Перерисованы из данныхопубликованы в Дуке и Мальмьерка 26. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Влияние блокады ГАМК А -рецепторы на спектральные и временные свойства отклика. Зона реакции (А) Частота четырех IC записаны нейроны до и во время микроионофоретическое инъекции габазин. Черные кресты (А) указывают частоты выбраны , которые будут представлены в виде редких и повторяющихся звуков. (Б) Накопленная пери-стимул времени гистограмм нервной реакции на всех частот и интенсивностей , представленных построить зону реакции до и во время инъекции из габазин. Черные полоски указывают на звуковую длительность.Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Влияние блокады ГАМК А рецепторов на ответ на многократном и редкие звуки. (А, В) Точечные растров ответ на Прокалывание пару частот , представленных в виде редких (красный, 10%) и повторяющийся раздражитель (синий, 90%) до и во время применения габазин. Каждая частота играет в двух последовательностей таким образом, что каждый из них был представлен как редко- и повторяющимся. Затененных фон указывает на длительность стимула. (C). Single-нейронные ответы на семь пар частот , представленных в виде редких и как повторяющегося звука до и во время применения габазин. (D) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microiontophoresis нейроактивных веществ у бодрствующих животных является мощным средством , чтобы исследовать и анализировать роль конкретных синаптических входов на активность отдельных нейронов 40,41. Что еще более важно, эта процедура позволяет определить воздействие нейротрансмиттеров и нейромодуляторов на нейронных цепей без потенциальной интерференции анестетиков. Здесь мы покажем , что применение габазин в IC Пробудитесь мышей решительно изменили настройки частоты (рис 4а), временные паттерны реагирования (Рисунок 4б) и SSA (рисунок 5).
Основным ограничением описанной процедуры является относительно короткий промежуток времени записи (~ 3 ч), которая определяется уровнем привыкания животного к записи сессий. С другой стороны, несколько сеансов записи может быть выполнена на том же животном. Использование microiontophoresis остается неясным, как далекоприменяемые нейроактивные вещества диффундируют в окружающую ткань. Таким образом, возможный эффект на нейрональной активности сети может быть вызвана влияет не только записанную нейрон, но и окружающий глиальных и нервных клеток. Например, конфеты и его коллеги 42 показали , что определенные ионтофоретически доставленные молекулы, которые не быстро извлекали, могут диффундировать до 600 мкм. У мышей IC этот диапазон будет охватывать большую часть степени дендритных беседок, но и влияют на нейронную реакцию соседних клеток. Таким образом, препарат выпущен путем ионофореза не в качестве пространственно ограничены , как внутриклеточного диализа лекарственного средства, что позволяет рассечение в более тонкие детали синаптических входов к целевому нейроном и испытание локальной сети процессов 16,43, более конкретно , чем другие экспериментальные процедуры, используемые для управления уровнем нейротрансмиссии или нейромодуляции, таких как системные инъекции, использование оптогенетика техники, или пуш-импл диализ.
Диаметр наконечника стеклянных пипеток и величина удерживающей способности и инжекционных токов, являются ключевыми факторами для контроля того, чтобы избежать неспецифического утечки наркотиков в ткани. Низкие токи инжекции (порядка десятков нА) ограничить распространение препарата, позволяющего регистрировать нейронов близко друг к другу. Например, три из четырех нейронов, используемых в качестве примеров (нейроны 1 - 3) были записаны по той же дорожке с расстояния от 16 до 800 мкм между ними. Несмотря на небольшое расстояние от 16 мкм между нейроном 1 и 2, явно отличается реакция нейрон 2 наблюдалось (рисунок 4).
Некоторые альтернативы предложенной конфигурации Пигги Бэг были использованы ранее. Один из них состоит в использовании одного из multibarrel пипеток для записи, вместо отдельного электрода. В то время как строительство ансамблей является менее сложной, в этом случае, есть недостатки. Елкит, все каналы будут иметь одинаковый диаметр отверстия в наконечнике, который не может быть оптимальным для записи и доставки лекарственного средства. Кроме того, выступающий кончик электрода в конфигурации поросенок-обратно предотвращает повреждение клетки-мишени, вероятно, вызванной более широким кончиком multibarrel. Второй распространенной альтернативой является использование однокамерный стеклянных пипеток для записи 15,44 вместо вольфрамовых электродов. Стеклянные электроды легко изготовить в соответствии с требуемыми размерами, но, как правило, забивают во время длительной записи или во время путешествия в глубь мозга, поэтому в нашем опыте вольфрамовые электроды обеспечивают более надежные записи. Кроме того, при использовании вольфрамовые электроды можно производить электролитическую повреждение локализовать места запись, без дополнительно уточняют гистологических процедур , необходимых при нейронная трассирующей используется 45. Использование multibarrel стеклянных пипеток позволяет высвобождение нескольких агонистов и / или антагонистов очень близко к записисайт, который является огромным преимуществом, когда взаимодействие между системами нейротрансмиттеров на сенсорной обработки находится в стадии изучения.
Процедуры, описанные в настоящем протоколе для изготовления из контрейлерных электродов позволяют производить записи электродов в соответствии с конкретными требованиями эксперимента и характеристик целевой области интереса к систематическим, все же заказной манере. Кроме того, материалы для фиксации headpost обычно используются в стоматологии, так что они легко доступны. Таким образом, критические шаги в протоколе являются животное привыкания и травление вольфрамовыми электродами, которые являются основными факторами, способствующими хорошо изолированных нейронов и стабильных электрофизиологических записей. В целом, этот метод является относительно простым, экономичным и очень надежным в качестве средства для изучения роли нескольких нейроактивных веществ на одной или нескольких единиц активности нейронов в бодрствует, head-Сдержанные мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Этот проект был профинансирован MINECO предоставляет BFU201343608-P и PSI2013-49348-EXP, а также грант SA343U14 JCYL МСМ и MRC основного финансирования ARP. YAA провел КОНАСИТ (216106) и стипендию SEP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
References
- Harris, K. D., Thiele, A.
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
- Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
- Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
- Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
- Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, (Pt 4) 729-743 (2014).
- Stone, T. W. Microiontophoresis and Pressure Ejection. , Wiley. (1985).
- Lalley, P. M. Modern techniques in neuroscience research). Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. 193-212 (1999).
- Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
- Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
- Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
- Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
- Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing 'piggy-back' multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
- Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358 (2013).
- Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297 (2012).
- Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
- Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
- Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
- Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
- Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111 (2014).
- Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
- Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071 (2010).
- von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
- Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107 (2012).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
- Merrill, E. G., Ainsworth, A.
- Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
- Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162 (2), 486-500 (2009).
- Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neuroscience. 193, 429-439 (2011).
- Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
- Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neuroscience. 154 (1), 355-369 (2008).
- Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89 (2013).
- Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
- Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119 (2013).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
- Lalley, P. M. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin Heiderlberg. Ch. 7 193-212 (1999).
- Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
- Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
- LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).
