Abstract
Skillnader i aktiviteten av neurotransmittorer och neuromodulators och därmed olika neurala svar kan hittas mellan sövda och vakna djur. Därför är metoder som möjliggör manipulering av synaptiska system i vakna djur som krävs för att bestämma bidraget av synaptiska inmatningar till neuronal behandling opåverkad av anestetika. Här presenterar vi metodik för konstruktion av elektroder att samtidigt spela in extracellulära neural aktivitet och släpp flera neuroaktiva ämnen i närheten av inspelningsplatser i vaken möss. Genom att kombinera dessa förfaranden, utförde vi microiontophoretic injektioner av gabazine att selektivt blockera GABA A-receptorer i nervceller i sämre colliculi av huvud-hållsamma möss. Gabazine framgångsrikt modifierade neurala svar egenskaper såsom frekvenssvaret området och stimulans specifik anpassning. Således, visar vi att våra metoder är lämpliga för recording enda enhet aktivitet och dissekera betydelsen av specifika neurotransmittorreceptorer i ljudbearbetning.
Den största begränsningen av det beskrivna förfarandet är den relativt korta inspelningstiden (~ 3 tim), som bestäms av nivån på tillvänjning av djuret till inspelningssessioner. Å andra sidan kan flera inspelningssessioner utföras i samma djur. Fördelen med denna teknik jämfört med andra experimentella förfaranden som används för att manipulera graden av neurotransmissionen eller neuromodulering (såsom systemiska injektioner eller användningen av optogenetic modeller), är att läkemedelseffekten är begränsad till den lokala synaptiska inmatningar till mål-neuron. Dessutom seden-tillverkning av elektroder medger justering av specifika parametrar enligt den neurala strukturen och typen av neuron av intresse (såsom spetsen motstånd för att förbättra förhållandet signal-till-brus av inspelningarna).
Introduction
Samspelet mellan neural excitation och hämning är grundläggande för bearbetning av sensorisk information 1. Det är också känt att anestesi har en stark inverkan på dynamiken i kortikal aktivering och tidsmönstret synaptiska ingångar 2,3. Exempelvis har det observerats att anestetika ändra längden på visuellt framkallade svar i kortikala neuroner 3,4. Dessutom är förhållandet mellan retande och hämmande synaptiska ingångar annorlunda i sövda och vakna djur 4,5, förändra både framkallade och spontana förvärvsfrekvensen 6,7. Genom att mäta synaptiska conductances, Haider och kollegor fyra fann att hämning matchas excitation i amplitud under narkos, medan under vakenhet, var hämning starkare än excitation. Dessa fynd föran utvecklingen av experimentella förfaranden för att undersöka effekterna av specifika synaptiska ingångar på sensorisk bearbetning i vakna djur.
<p class = "jove_content"> Den kontrollerade utstötning av laddade neuroaktiva ämnen genom att tillämpa små ström injektioner (i storleksordningen nA) har i stor utsträckning använts för att studera bidrag synaptiska ingångar och rollen av förmodade cellreceptorer i sensorisk bearbetning 8-13 . Denna teknik, som kallas microiontophoresis tillåter applicering av läkemedel i närheten av den inspelade neuron, vilket bidrar till en snabb och begränsad effekt. Detta förfarande är mer lämplig för att studera lokala effekter av neuroaktiva substanser, jämfört med den utbredda effekten som framkallas av andra experimentella manipulationer såsom systemiska injektioner, mikrodialys eller användning av optogenetic tekniker. Vanligtvis är en piggy-back elektrodkonfiguration 14,15 används för att samtidigt spela in mål-neuron och leverera de neuroaktiva substanser av intresse. Den består av en inspelning elektrod fäst vid en multibarrel pipett som bär de neuroaktiva substanser. Modifieringar av original förfarande som beskrivits av Havey och Caspary 14 har genomförts. Till exempel kan en volframelektrod, i stället för en glas ett användas för att spela in neural aktivitet 16. Tidigare publicerade metoder för tillverkning av volframelektroder 17,18 involverar tre allmänna steg: elektrolytisk etsning av volfram tråd tips, isolerande glas, och justering av spetsen exponering för att möta registreringskraven.En intressant och framväxande fält i hörsel neurovetenskap är studiet av stimulus-specifik anpassning (SSA 19). SSA är en specifik minskning av neurala svar på repetitiva ljud som inte generalisera till andra, sällan presenterade ljud. Vikten av SSA ligger i dess potentiella roll som en neural mekanism underliggande avvikelse i audi hjärnan, såväl som en möjlig neuronal korrelat för den sena mismatch negativitet komponent i det auditiva framkallade potentialen 20,21. SSA occurs från IC upp till hörselbarken 19,22-24. GABA A-medierad hämning har visats fungera som en förstärkningskontrollmekanism på SSA 7,16,25, som också har visat sig påverkas av anestesi 26. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar tidigare beskrivna metoder för registrering av en enda enhet aktivitet IC nervceller före och under tillämpningen av en selektiv antagonist av GABA A-receptorer i vaken möss. Först beskriver vi framställningen av piggy-back elektroder och nästa, de kirurgiska och inspelningsmetoder. För att testa effekten av läkemedelsfrisättning, vi jämförde receptiva fält samt nivån på SSA IC nervceller före och under microiontophoretic utmatning av gabazine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer genomfördes vid universitetet i Salamanca med godkännande av och användning av metoder som överensstämmer med de normer som gäller, universitetet i Salamanca Djurvård kommittén samt normerna i Europeiska unionen (direktiv 2010/63 / EU) för användningen av djur i neurovetenskaplig forskning.
1. volframelektroder
Notera: Tillverkningen av volframelektroder är baserad på den ursprungliga teknik som beskrivs i Merrill och Ainsworth 27 och et al Ainsworth 28 och utförs med hjälp av inställningar för arbetsstationen beskriven i Bullock et al 17...
- För att spela in en enda enhet extracellulär aktivitet av IC-neuroner använder elektroder med en spets impedans av 1,5-2,5 MQ. Här är de steg som ingår i volframelektrodtillverkning beskrivs endast kortfattat, eftersom en detaljerad beskrivning återfinns i de ovannämnda referenserna.
- Placera volfram trådar i en specialbyggd inriktningverktyget (Figur 1A) för att hjälpa skära dem till den önskade längden. Justeringsredskapet består av 30 nålar (25 G) limmade parallellt vid 2 mm intervall, med ett stopp vid en ände för att begränsa längden på kablarna till ~ 40 mm. Kläm fast de lösa ändarna av trådarna med tejp, och skär resten av tråden med starka sax.
- Dra försiktigt från bandet för att avlägsna volframtrådarna från justeringsverktyg, att se till att alla kablar sitter kvar på bandet. Rulla bandet på en polerad mässing spindel (Figur 1B, C), som håller trådarna hårt mot spindeln så det finns en god elektrisk anslutning.
- Anslut spindeln till en 5 rpm motor i arbetsstationen, och sänk de utskjutande tråd tips i en etsningslösning (KNO 2, 90 g per 80 ml). Vinkel spindelaxeln 45 ° i förhållande till ytan av etsningslösningen. Doppa tråd tips så att ~ 1/3 av trådarna kontakta lösningen.
- immerse en kolstav elektroden i etsningsbadet för att sluta kretsen. Använda en fjäderkopparfläta borste för att tillämpa etsningstillförseln till spindelaxeln medan spindeln roterar. Justera den ström som leds genom elektroderna och etsningslösningen till 250 mA. Stoppa spetsen etsning när strömmen sjunker till 200 mA. Tråd tips kommer att vara etsad i mycket fina poäng.
- Passera en skärpt tråd genom en flamma för att avlägsna fett och limrester. Placera kabeln (trubbiga änden först) till en borsilikatglas kapillär (1,5 mm YD, 0,86 mm ID) med sin nedre ände blockerades med modellera. Klämma pipetten vertikalt vid toppen och botten. Dra pipetten med hjälp av en värmeslinga (diameter 5 mm, djup 5 mm) och en upphängd kolv. När tråden dras ned genom vikten av kolven, bildar den smälta glaset ett mycket fint päls runt den.
- Ta bort glaset som täcker spetsen vid den skarpa änden av elektroden med hjälp av en smält sträng av natriumtetraborat. Att bilda pärlan, blanda natriumtetraborat (~ 0,25 g) med en liten mängd vatten (~ 0,5 ml) och långsamt placera den på ett värmeelement, till dess att den smälter till en vulst ~ 2 mm i diameter. Temperaturen hos värmeelementet styrs av en potentiometer. Placera vulsten och värmeelementet på en manipulatorarm fixerad till tabellen, och flytta den till dess att vulsten är inriktad under mikroskop vid låg förstoring.
- Säkra glastäckta tråden till en bild och placera den under mikroskop. Flytta bilden med scen rattarna tills spetsen och tetraborate pärla är i fokus. Värm pärlan tills den smälter lätt och sätt i trådspetsen ~ 10-15 pm. Stäng av värme potentiometer bort. Som vulsten svalnat, kontrakt som den och kommer att ta bort glaset från spetsen av elektroden, utsätta den underliggande volfram. Volframelektroden är klar att använda.
2. Multibarrel glaspipett Manufacturing
- Skydda ändarna på multifat glaskapillärer (fem fat i H-konfiguration) med krympslang, för att möjliggöra ett bättre grepp på klämmorna avdragare och förhindra brott, och placera en i vertikal avdragare.
- För att få spetslängder ~ 15 mm, ställ in avdragare följande parametrar: Heat: 84, Sub magnetkraft: 49, Main magnetkraft: 38. Finjustera dessa parametrar enligt specifika konfiguration, liksom efter att ha bytt värmeelement.
- Dra kapillär att få två pipetter med tips tilltäppta. Montera en pipett på ett objektglas med användning av modelleran och bryta pipettspetsen under mikroskop tills den yttre diametern är ~ 20-30 | im, med användning av fina saxar eller tänger, eller den flata sidan av en skalpell. Om den trasiga kanten är för grovt, förfina den med tetraborate pärla teknik som beskrivs i steg 1,7.
- Placera en volframelektrod (från avsnitt 1) i en hållare gjord med en 20 G nål i slutet av en tre-axlig miniatyr micropositioner monterad på mikroskop stage. Med hjälp av pincett, vika änden av elektroden 5-10 °, ~ 30 mm från spetsen.
- Under mikroskop, försiktigt anpassa volframelektroden över multibarrel spets. När linje, sänka elektroden tills det kommer i kontakt med multibarrel, montering i spåret mellan de två övre fat. Skjut spetsen på elektroden tills det skjuter ut ~ 15-20 | j, m bort från spetsen av multibarrel. Göra vinkeln mellan elektroden och multibarrel så liten som möjligt för att erhålla en bättre bindning och ett tunnare ensemble.
- Applicera en liten droppe av ljus härdbart lim ~ 5 mm bort från spetsarna. Var försiktig limmet inte når spetsen för att undvika att de multibarrel kanaler.
- Härda limmet med hjälp av ett blått ljus LED-lampa. Upprepa limmet application / härdning vid behov för bättre bindning.
- Flytta mikroskop scenen försiktigt fram till slutet av volframelektroden frigörs från hållaren. Ta bort piggy-back ensemble från bilden.
- wrap the mellersta delen av piggy-back elektrod i en kort längd av värmekrympslang och tillämpa snabb härdning epoxy lämplig för glas för att ytterligare säkra volframelektroden till multibarrel.
3. Läkemedel för Microiontophoresis
Notera: De läkemedel som används för microiontophoresis måste ha en elektrisk laddning vid upplösning i vatten. Kontrollera litteraturen för att se om läkemedlet av intresse är lämplig för detta förfarande. Här, förfarandet för gabazine, en antagonist till GABA A-receptorn, beskrivs.
- Filter destillerat vatten med hjälp av en 0,2 um sprutfilter för att sterilisera vatten och säkra som inte innehåller några lösta ämnen. Förbered ~ 1000 il 20 mM gabazine använder denna destillerat vatten.
- Justera pH i spädning till 4 med 0,2 | j, m filtrerad NaOH med användning av en fin spets-pH-elektrod.
- Lagra 100 - 200 l alikvoter vid -20 ° C. Tina på dagen för inspelningen. Den dagen, innan djuret är begränsaed, fylla fat (3-5 l) av den multibarrel elektroden med drogerna, med hjälp av en 100 ul mikro försedd med en flexibel plast nål.
4. Kirurgi och Headpost implantation
- Utföra experiment i två manliga CBA / J-möss (Mus musculus) med vikter av 27 och 30 g. Följ kirurgiska och registreringsförfaranden av Bryant och kollegor 29, Pörtfors och medarbetare 30-32, och Duque och Malmierca 26.
- I dagarna före operationen, hantera djuren och vänja dem till inspelningen kammaren genom att låta dem utforska fritt. Utför 3 sessioner per dag, var och en som varar minst 30 minuter. På så sätt djuren blir lugnare och bekväm under inspelningarna.
- Söva musen med en blandning av ketamin (50 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg) injiceras intramuskulärt. Med denna dos djuret är djupt sövd för cirka en timme. Ge kompletterande doser av ett third av den initiala dosen som behövs.
- Placera djuret på en värmefilt inställdes för att upprätthålla en temperatur på 38 ± 1 ° C och stabilisera djurets huvud i en stereotaktisk ram genom att använda två öron barer och en bit bar. Var noga med att inte tränga igenom trumhinnan med örat barer.
- Skydda ögonen genom att tillämpa en droppe ögon gel.
- Raka hårbotten med hjälp av sax och tillämpa povidon-jod för att desinficera huden.
- Med hjälp av en skalpell, gör ett snitt längs mittlinjen för att exponera skallen och dra benhinnan täcker parietalceller och mer rostralt delen av occipital ben.
- Limma en lätt duralumin headpost (vikt ~ 0,65 g, längd 30 mm, figur 2A) med en rund och platt bas (5 mm diameter) på skallen. Limma en silvertråd till mitten av headpost lämnar sina ändar fria. Den silvertråd kommer att användas som referenselektrod för den elektrofysiologiska inspelning.
- Applicera ett tunt lager av light-härdbart lim på skallen och basen av headpost. Vänta 10 sekunder och placera headpost över rostralt område av parietalben, längs mittlinjen.
- För en effektiv bindningsstyrka, ljus härda limmet med hjälp av en blå ljuskälla för 20 sek.
- Borra tre hål runt och bakom basen av headpost användning av en elektrisk borr och en liten borr.
- Placera två klock skruvar (~ 2 mm längd) i de borrade hålen för att tjäna som ytterligare kontaktpunkter mellan skallen och huvudsteg. Skruvarna kräver 1½ vänder för att uppnå en tät passning. Testa skruvarna med pincett för att se till att de inte är löst.
- Sätt spetsen på silverjordledningen i det tredje hålet se till att det kommer i kontakt med dura. Applicera en liten droppe vattenresistent cyanoakrylatlim att binda tråden till skallen.
- Applicera ljushärdande komposit för att förstärka bindningen av headpost med skallen. Täcka basen av headpost, den låga delen av silvertråd,och skruvarna, som är noga med att inte sträcka bakom lambda, att tillåta åtkomst under inspelning. Bota med hjälp av en blå ljuskälla.
- Dra in muskeln på baksidan av halsen nära dess införing på skallen. Med hjälp av en liten trephine (2,35 mm diameter), borra ett runt fönster strax under lambda sutur och i sidled med mittlinjen för att exponera sämre colliculi (IC). När gränserna är lösa, dra upp täck ben med fin pincett. Om blödning uppstår, skölj med kallt steril koksaltlösning för att stoppa den.
- Gör en liten (~ 1 mm bred och ~ 1 mm höga) vägg runt fönster med komposit och ljus bota den.
- Täck den exponerade skallen och muskler med antibiotisk salva. Då, väta den exponerade ytan av IC med steril koksaltlösning och täcka den med vaselin, fyller väl genereras efter att ha gjort väggen runt inspelningsfönstret.
- Injicera buprenorfin subkutant (0,03 mg / kg, späddes 1:10 i steril saltlösning) som ett analgetikum.
- Hålla djuret på tHan värmefilt tills den vaknar och returnera den till sin bostad bur att återhämta sig från kirurgi för tre dagar före inspelningen. Hysa djur i enskilda rat's bostäder bur för att förhindra burkamrater rensa gelé och headpost vidröra metall-grid lock. Placera några anrikning i buren när djuret enda inrymd. Dessutom ändras dagligen sågspånet att förhindra infektion och noggrant kontrollera att djuret återhämtar sig ordentligt och inte visar några tecken på obehag. Kontrollera också om vaselin är över inspelningsfönstret skydda utsatta hjärnan.
5. elektrofysiologiska inspelning och Microiontophoresis
- Efter återhämtning, ger djuret tid att acklimatisera sig till inspelningsmiljön och har sitt huvud fastspända. Vänja djuret genom att fastställa headpost till hållaren medan musen sitter på en skräddarsydd vadderad skum som hindrar ristade sin kroppsstorlek (Figur 2B). Detta kommer limdet rörelser musen och kommer att bidra till dess lugn.
- Börja med 10 min sessioner och successivt öka varaktigheten upp till 120 minuter. Under sessionen, belöna djuren med söta vätskor (kondenserad mjölk, utspädd 30:70 i vatten) med bestämda intervall 33. Senare, under inspelningen, ger samma belöning i början och i slutet av sessionen eller när ingen neuron isoleras.
- Om djuret är mycket glada före inspelningen injicera milt lugnande medel acepromazin (2 mg / kg, intraperitonealt). Enligt det neurala systemet av intresse, kan den sedativa påverka dina resultat.
- Låt djuret fritt utforska inspelningen kammaren under 5 - 10 min.
- Placera djurets kropp in i skum skräddarsydd vadderainer (Figur 2B).
- Säkra headpost till en hållare fäst på den stereotaktiska ramen (figur 2C). Detta är ett bra tillfälle att ge djuret en flytande belöning.
- cover djurets kropp med en bomullsfilt och löst fast den med en plasthalvcylinder och tejp.
- Ta bort vaselin från inspelningsfönstret och skölj med varmt steril saltlösning.
- Spela in neural aktivitet och jontoforetisk tillämpning av gabazine.
- Placera multibarrel elektroden på sin hållare, som styrs av en mikrodrivan och fäst vid en mikromanipulator.
- Anslut kablarna för inspelning, med hjälp av små krokodilklämmor. Anslut den positiva terminalen till slutet av volframelektroden, och jordterminalen till silvertråd som är i kontakt med dura.
- Placera ett obestruket silvertråd i varje fat, så ena änden i kontakt med lösningen och den andra änden är åtkomlig. Anslut dessa ändar till microiontophoresis enheten följa tillverkarens anvisningar.
- Flytta multibarrel elektroden tills spetsen i kontakt med ytan av hjärnan. Applicera varm steril saltlösning för att förhindra uttorkning av the hjärnvävnad. Vid denna punkt tillämpa en kvarhållande ström (-10 nA för gabazine kontrollerar litteraturen för särskilda läkemedel) för att undvika läckage av läkemedlet från cylindern spets samtidigt som letar efter en enda enhet aktivitet.
- Använd standardtekniker för att isolera enstaka neuron extracellulär aktivitet. Erhålla frekvensgången området (FRA) av neuron, dvs en kombination av frekvenser och intensiteter kan framkalla ett svar eftersom neuron är känsliga för dessa ljud 34-36.
- Välj två frekvenser (F1 och F2) som framkallar en liknande eldhastighet och mönster. Presentera varje av dessa frekvenser som sällsynt och repetitiva stimulans under kuf paradigm.
Obs: I korthet i kuf paradigm, är en frekvens (f1) presenteras som repetitiva stimulans med en hög sannolikhet att inträffa, medan den andra (f2) är det sällan förekommer avvikande stimulans, varvat slumpmässigt bland de repetitiva och kära. I en andra oddball sekvens, den relativasannolikheterna för de två stimuli är omvända. Detaljer för stimuleringsparadigm har beskrivits tidigare 22,37. - Släpp gabazine genom att flytta strömmen till positiva värden (10-20 nA). Skaffa igen FRA och upprepa udda paradigm under gabazine ansökan. Bibehålla utstötning tills en synlig effekt i skotthastigheten observeras; det vanligtvis tar 5-20 min, beroende på det särskilda läkemedlet, dess koncentration, och storleken på den utstötningsström. Upprepa inspelningsprotokollet för att erhålla de värden som under inverkan av läkemedlet.
- Stoppa injektion genom att återföra strömmen till lagringsvärden. Vänta på att effekten av läkemedlet för att tvätta bort genom att övervaka att FRA eller svar på den oddball paradigm återgår till kontrollvärden.
Obs! Inspelningar kan pågå 2-3 timmar per dag, och borde avslutas tidigare om djuret visar några tecken på obehag eller kämpa. Ge belöning vätska och täcka inspelnings chbärnstens med vaselin.
6. Dataanalys
- Mät FRA före och under gabazine injektion liksom graden av SSA.
- Kvantifiera styrkan i SSA svar från common-SSA Index (CSI) och frekvensspecifika SSA index (SI) som beskrivits tidigare 19,22,23,38,39. CSI och SI spegla den normaliserade skillnaden mellan den neuronala svar på den sällsynta stimulus och svaret på den repetitiva ett. Positiva CSI och SI-värden indikerar neurala svar (spikar per stimulus) var högre sällsynta än repetitiva toner.
- Jämföra data från kontroll och drogutstötnings skick.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi spelade in en enda enhet aktivitet 4 välisolerade nervceller i IC. Typiska signal-brusförhållanden som erhållits under extracellulära inspelningar i vakna möss visas i figur 3B. Figur 4A visar frekvenssvaret området (FRA) av varje neuron före och under blockaden av GABA A-receptorer med gabazine. Ett inkrement i svarsstyrkan (spikes / stimulus) samt en breddning av den spektrala tuning observerades. Ökningen i den framkallade svar var också tydligt i de ackumulerade peri-stimulus tid histogram som erhållits från neurala svar på alla frekvenser och intensiteter presenteras (Figur 4B).
En eller två par frekvenser inom neuron FRA (kors i figur 4A) valdes att presenteras som repetitiva eller sällsynta ljud i en kuf paradigm, att sSTUDERA nivån på SSA i sina svar. För två exempel nervceller, ljud framkallade svar till varje frekvens (F1 och F2) före och under gabazine injektion visas som punktraster i figur 5A, B. För de två exempel nervceller, fanns en tydlig förändring i ljudframkallat svar som observerades i punktraster och PSTHs.
Likaså lokala blockad av GABA A-receptorer ökade neuronala svar på den stora majoriteten av sällsynta och repetitiva toner (Figur 5C) i överenskommelse med vår tidigare studie 16. Olika nivåer av SSA observerades i neurala svar på F1 och F2, som återspeglas i positiv CSI (CSI intervall: -0,26 till 0,43, 0,25 ± 0,23) och SI-värden (SIS intervall: -0,41 till 0,83, 0,25 ± 0,23) . För de flesta av fallen, det ökade som svar på den repetitiva tonen orsakade en nedgång i dessa index såsom observeras i figur 5D
Figur 1. Material för tillverkning av volframelektroder. (A) Elektrodjusteringsverktyg, med vissa volfram kablar på plats. Den ljusare bit till vänster är ett stopp för ledningarna. Sax spetsen visar den sida som en guide för att skära av trådarna till önskad längd. (B) tom spindel. (C) Spindel med ett parti av elektroder fästa, och vilar på en hållare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Tillbehör till Awake Möss Recordings. (A) Headpost (B). Skräddarsydd vadderad skum som hindrar. plats than mus mellan de båda bitar, lämnar huvudet utanför. (C) Ändringar av stereotaktisk ram. Den headpost hållaren (översta raden) bistår under headpost implantation och hindrar huvudet under inspelningarna. Bitstycket (lägre bar) används endast under headpost implantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Exempel på inspelning i Awake mus. (A) Frekvensområdet av en neuron från mus-IC. (B) vågformer av de spikar som spelats in från denna neuron. (C, D) Dot raster- och peristumulus-time histogram registrerades från denna neuron med användning av en oddball paradigm vid frekvenserna indikerade med prickarna i (A). Ritas från datapublicerad i Duque och Malmierca 26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effekt av blockaden av GABA A-receptorer på Spectral och Temporal Response Properties. (A) Frekvensområdet av de fyra IC inspelad nervceller före och under microiontophoretic injektion av gabazine. De svarta kors i (A) visar de frekvenser valt att presenteras som sällsynta och repetitiva ljud. (B) Ackumulerade peri-stimulus tid histogram av neurala svar på alla frekvenser och intensiteter som presenteras för att konstruera svaret området före och under injektionen av gabazine. De svarta staplarna visar ljud varaktighet.Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Effekt av blockaden av GABA A-receptorer på svar på repetitiva och sällsynta ljud. (A, B) Dot raster av spiking svar på ett par av frekvenser som presenteras som sällsynt (röd, 10%) och repetitiva stimulus (blå, 90%) före och under appliceringen av gabazine. Varje frekvens spelas i två sekvenser, så att varje en presenterades som rare- och repetitiva. Den skuggade bakgrunden indikerar varaktigheten av stimulus. (C). Single-neuron svar på sju par frekvenser som presenteras som den sällsynta och som den repetitiva ljud före och under tillämpningen av gabazine. (D) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den microiontophoresis av neuroaktiva substanser i vakna djur är en kraftfull teknik för att undersöka och analysera betydelsen av specifika synaptiska ingångar på aktiviteten hos enskilda nervceller 40,41. Ännu viktigare, gör detta förfarande bestämningen av effekterna av signalsubstanser och neuromodulators på neurala kretsar utan risk för störningar av bedövningsmedel. Här visar vi att tillämpningen av gabazine i IC vaken möss kraftigt förändrat frekvensinställning (Figur 4A), den temporala svarsmönster (figur 4B) och SSA (figur 5).
Den största begränsningen av det beskrivna förfarandet är den relativt korta inspelningstiden (~ 3 tim), som bestäms av nivån på tillvänjning av djuret till inspelningssessioner. Å andra sidan kan flera inspelningssessioner utföras på samma djur. Använda microiontophoresis det är oklart hur långtde applicerade neuroaktiva substanser diffundera in i den omgivande vävnaden. Därför kan en eventuell effekt på neuronala nätverksaktivitet framkallas genom att påverka inte bara den inspelade neuron men även den omgivande gliaceller och neuronala celler. Till exempel, har Candy och kollegor 42 visat att vissa jontoforetiskt molekyler, som inte snabbt avlägsnas, kan diffundera upp till 600 | im. I möss IC detta område skulle täcka större delen av omfattningen av de dendritiska hållare utan också påverka neuronala svaret från angränsande celler. Sammanfattningsvis är läkemedlet frigörs genom jontofores inte så spatialt begränsad som intracellulär drog dialys, vilket gör dissektion i finare detalj av synaptiska ingångar till målet neuron och test av lokala nätverk processer 16,43, är det mer specifik än andra experimentella förfaranden som används för att manipulera graden av neurotransmission eller neuromodulering, som vid system injektioner, användningen av optogenetic tekniker, eller push-pull dialys.
Spetsen diameter glaspipetter och omfattningen av de kvarhållande och injektionsströmmarna är nyckelfaktorer för att övervaka för att undvika icke-specifik läkemedelsläckage in i vävnaden. De låga injektionsströmmar (i storleksordningen tiotals nA) begränsa spridningen av läkemedlet möjliggör inspelning av nervceller nära varandra. Till exempel, tre av de fyra neuroner som exempel (neuroner 1 - 3) registrerades längs samma spår med avstånd 16 och 800 um mellan dem. Trots det korta avståndet på 16 um mellan neuron 1 och 2, var en klart annorlunda svar av neuron 2 observerades (Figur 4).
Vissa alternativ till den föreslagna piggy-back-konfiguration har använts tidigare. En av dem består av användning av en av de multibarrel pipetter för inspelning, i stället för en separat elektrod. Medan konstruktionen av de ensembler är mindre komplicerad i detta fall, finns det nackdelar. granart, kommer alla kanaler ha samma öppningsdiameter vid spetsen, vilket kanske inte är optimalt för både inspelning och läkemedelstillförsel. Även den utskjutande elektrodspetsen i piggy-back konfiguration förhindrar skador på målcellen orsakas troligen av den bredare spets multibarrel. Den andra vanligt alternativ är användningen av enpipiga glaspipetter för inspelning 15,44 istället för volframelektroder. Glaselektroder är lätt att tillverka till de erforderliga dimensionerna, men tenderar att täppa under långa inspelningar eller när du reser djupt in i hjärnan, så vår erfarenhet volframelektroder ger mer tillförlitliga inspelningar. Dessutom är det med hjälp av volframelektroder möjligt att producera elektrolytisk lesion att hitta inspelningsplatser, utan vidareutveckla histologiska förfaranden som krävs när en neural spår injektion används 45. Användningen av multibarrel glaspipetter tillåter frisättningen av multipla agonister och / eller antagonister mycket nära till inspelningsplats, vilket är en enorm fördel när samspelet mellan signalsubstanssystem på sensorisk bearbetning är under utredning.
De procedurer som beskrivs i detta protokoll för tillverkningen av piggy-back elektroder gör det möjligt att framställa registreringselektroderna i enlighet med de särskilda kraven i experimentet och av egenskaperna hos målområdet av intresse i en systematisk, men anpassade sätt. Dessutom är materialen för headpost fixering som konventionellt används inom tandvården så att de är lätt tillgängliga. Således, de kritiska stegen i protokollet är djur tillvänjning och etsning av volframelektroder, som är de viktigaste faktorerna som bidrar till väl isolerade nervceller och stabila elektrofysiologiska inspelningar. Sammantaget är relativt enkel, ekonomisk och mycket pålitlig som ett sätt att studera betydelsen av flera neuroaktiva ämnen på en eller flera enheter nervaktivitet i vaken denna teknik, huvud-återhållen möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Projektet har finansierats av Mineco beviljar BFU201343608-P och PSI2013-49348-EXP och JCYL bidraget SA343U14 till MSM och MRC basfinansiering till ARP. YAA höll en CONACYT (216.106) och en SEP gemenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
References
- Harris, K. D., Thiele, A.
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
- Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
- Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
- Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
- Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, (Pt 4) 729-743 (2014).
- Stone, T. W. Microiontophoresis and Pressure Ejection. , Wiley. (1985).
- Lalley, P. M. Modern techniques in neuroscience research). Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. 193-212 (1999).
- Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
- Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
- Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
- Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
- Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing 'piggy-back' multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
- Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358 (2013).
- Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297 (2012).
- Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
- Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
- Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
- Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
- Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111 (2014).
- Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
- Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071 (2010).
- von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
- Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107 (2012).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
- Merrill, E. G., Ainsworth, A.
- Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
- Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162 (2), 486-500 (2009).
- Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neuroscience. 193, 429-439 (2011).
- Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
- Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neuroscience. 154 (1), 355-369 (2008).
- Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89 (2013).
- Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
- Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119 (2013).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
- Lalley, P. M. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin Heiderlberg. Ch. 7 193-212 (1999).
- Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
- Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
- LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).
