Abstract
Forskelle i aktiviteten af neurotransmittere og neuromodulatorer og dermed forskellige neurale reaktioner, kan findes mellem bedøvede og vågen dyr. Derfor er fremgangsmåder, der tillader manipulation af synaptiske systemer i vågne dyr kræves for at bestemme bidraget af synaptiske input til neuronal forarbejdning upåvirket af anæstetika. Her præsenteres metode til opførelse af elektroder til samtidig optage ekstracellulær neurale aktivitet og frigive flere neuroaktive stoffer i nærheden af optagelsen steder i vågen mus. Ved at kombinere disse procedurer, udførte vi microiontophoretic injektioner af gabazine til selektivt at blokere GABAA-receptorer i neuroner i den inferiore colliculus af hoved-behersket mus. Gabazine held modificeret neurale respons egenskaber, såsom frekvensgang område og stimulus-specifik tilpasning. Således viser vi, at vores metoder er egnede til recording enkelt enhed aktivitet og for dissecting rolle specifikke neurotransmitterreceptorer i auditive forarbejdning.
Den væsentligste begrænsning af den beskrevne procedure er den relativt korte optagetiden (~ 3 timer), som er bestemt af niveauet af tilvænning af dyret til indspilningerne. På den anden side kan flere indspilningssessioner udføres i det samme dyr. Fordelen ved denne teknik i forhold til andre eksperimentelle procedurer, der anvendes til at manipulere niveauet af neurotransmission eller neuromodulation (såsom systemiske injektioner eller anvendelsen af optogenetic modeller), er, at lægemidlet effekten er begrænset til de lokale synaptiske input til mål-neuron. Derudover custom-fremstilling af elektroder giver mulighed for justering af specifikke parametre ifølge den neurale struktur og type neuron af interesse (såsom spidsen modstand til forbedring af signal-støjforholdet af optagelserne).
Introduction
Samspillet mellem neural excitation og hæmning er fundamental for behandling af sensorisk information 1. Det er også kendt, at anæstesi har en stærk indflydelse på dynamikken i cortical aktivering og den tidsmæssige mønster af synaptiske input 2,3. For eksempel er det blevet observeret, at anæstetika ændre varigheden af visuelt fremkaldte reaktioner i corticale neuroner 3,4. Desuden er forholdet mellem stimulerende og hæmmende synaptiske input er forskellig i bedøvede og vågne dyr 4,5, ændre både fremkaldte og spontane erhvervsfrekvens 6,7. Ved at måle de synaptiske konduktanser, Haider og kolleger 4 fandt, at inhibering matchede excitation i amplitude under anæstesi henviser under vågenhed, inhibering var stærkere end excitation. Disse resultater bede udvikling af eksperimentelle procedurer for at undersøge virkningen af specifikke synaptiske input på sensorisk forarbejdning i vågne dyr.
<p class = "jove_content"> Den kontrollerede udslyngning af ladede neuroaktive stoffer ved at anvende små nuværende injektioner (på rækkefølgen af NA) er blevet flittigt brugt til at studere bidrag synaptiske input og den rolle af formodede celle receptorer i sensorisk forarbejdning 8-13 . Denne teknik, der er kendt som microiontophoresis, tillader anvendelsen af lægemidler i nærheden af den indspillede neuron, hvilket bidrager til en hurtig og begrænset virkning. Denne procedure er mere egnet til at studere lokale virkninger af neuroaktive stoffer, sammenlignet med den udbredte virkning fremkaldt af andre eksperimentelle manipulationer såsom systemiske injektioner, mikrodialyse eller anvendelse af optogenetic teknikker. Normalt er en piggy-back elektrode konfiguration 14,15 bruges til samtidigt at registrere målet neuron og levere de neuroaktive stoffer af interesse. Den består af en optagelse elektrode fastgjort til en multibarrel pipette, der bærer de neuroaktive stoffer. Ændringer af den original procedure beskrevet af Havey og Caspary 14 er blevet implementeret. For eksempel kan en wolfram elektrode, i stedet for et glas én, bruges til at registrere den neurale aktivitet 16. Tidligere publicerede metoder til fremstilling af wolframelektroder 17,18 involverer tre generelle trin: elektrolytisk ætsning af wolfram tråd tips, glas isolering, samt regulering af spidsen eksponering til at opfylde kravene for optagelse.En interessant og emergent felt i auditive neurovidenskab er studiet af stimulus-specifik tilpasning (SSA 19). SSA er en specifik reduktion i den neurale respons på gentagne lydsignaler, som ikke generaliserer til andre, sjældent fremlagt lyde. Betydningen af SSA ligger i dets potentielle rolle som en neural mekanisme underliggende afvigelse påvisning i den auditive hjerne, samt en mulig neuronkorrelat for den sene mismatch negativitet komponent af auditive evoked potentiale 20,21. SSA occurs fra IC op til den auditive cortex 19,22-24. GABAA-medieret inhibering er blevet påvist at fungere som en gevinst kontrolmekanisme på SSA 7,16,25, som også er blevet vist at være påvirket af anæstesien 26. Her præsenterer vi en protokol, der kombinerer tidligere beskrevne fremgangsmåder til registrering af enkelt-enhed aktivitet af IC neuroner før og under påføringen af en selektiv antagonist af GABAA-receptorer i vågen mus. Først beskriver vi fremstilling af piggy-back elektroder og næste, de kirurgiske og indspilningsmetoder. For at teste for effektiviteten af lægemiddelfrigivelse, sammenlignede vi det receptive område såvel som niveauet af SSA IC neuroner før og under microiontophoretic udstødning af gabazine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført på universitetet i Salamanca med godkendelse af, og ved anvendelse af metoder, der opfylder de standarder for, University of Salamanca Animal Care udvalg samt standarderne for Den Europæiske Union (direktiv 2010/63 / EU) for brugen af dyr i neurovidenskab forskning.
1. Wolfram elektroder
Bemærk: Fremstillingen af wolframelektroder er baseret på den originale teknikken beskrevet i Merrill og Ainsworth 27 og Ainsworth et al 28 og udføres ved hjælp af setup arbejdsstation beskrevet i Bullock et al 17...
- For at optage en enkelt enhed ekstracellulær aktivitet IC neuroner, bruge elektroder med en spids impedans på 1,5-2,5 MQ. Her er de trin, der indgår i wolframelektroden fremstilling kun beskrevet kort, da en detaljeret beskrivelse findes i de ovennævnte referencer.
- Placer wolfram ledninger i en specialbygget justeringværktøj (figur 1A) at bistå skære dem i den ønskede længde. Tilpasningen Værktøjet består af 30 nåle (25 g) limet parallelt ved 2 mm intervaller, med et stop ved den ene ende til at begrænse længden af ledningerne til ~ 40 mm. vedhæfte omhyggeligt de løse ender af trådene med klæbebånd, og skær resten af tråden med stærke saks.
- Træk forsigtigt fra båndet for at fjerne de wolfram ledninger fra tilpasningen værktøj, og sørg for, at alle ledningerne blive siddende på båndet. Rulle båndet på en poleret messing spindel (figur 1B, C), holde ledningerne fast mod spindlen, så der er en god elektrisk forbindelse.
- Slut spindlen til en 5 rpm motor i arbejdsstationen, og fordybe de udragende wire tip i en radering løsning (KNO 2, 90 g pr 80 ml). Vinkel spindelaksen 45 ° i forhold til overfladen af ætsning opløsning. Fordyb wire tips, så ~ 1/3 af ledningerne kontakte løsningen.
- Immerse en carbon stang elektrode ind i ætsning badet til at lukke kredsløbet. Brug en fjeder kobber fletning pensel til at anvende ætsning levering til spindelakslen mens spindlen roterer. Juster strøm, der ledes gennem elektroderne og ætsning opløsning til 250 mA. Stop spidsen ætsning, når den nuværende falder til 200 mA. De wire tips vil blive ætset ind meget fine punkter.
- Pass en skærpet wiren gennem en flamme for at fjerne eventuel fedt og limrester. Placer tråden (stumpe ende først) i en borsilikatglas kapillær (1,5 mm OD, 0,86 mm ID) med sin nedre ende blokeret med modellervoks. Klemme pipetten lodret i toppen og bunden. Træk pipetten under anvendelse af en varmespiral (diameter 5 mm, dybde 5 mm) og et suspenderet stemplet. Som tråden trækkes ned med vægten af stemplet, det smeltede glas danner en meget fin pels omkring det.
- Fjern glasset dækker spidsen ved den skarpe ende af elektroden ved hjælp af et smeltet vulst af natriumtetraborat. Til dannelse af vulsten, bland natriumtetraborat (~ 0,25 g) med en lille mængde vand (~ 0,5 ml) og langsomt placere den på et varmeelement, indtil det smelter ind i en vulst ~ 2 mm i diameter. Temperaturen af varmeelementet styres af et potentiometer. Placer perlen og varmeelementet på en manipulator arm fastgjort til bordet, og flytte det indtil perlen er fokuseret under mikroskopet ved lav forstørrelse.
- Fastgør glasoverdækkede ledning til et dias og placere den under mikroskop. Flyt dias med scenen drejeknapper indtil spidsen og tetraborat perle er i fokus. Varm perlen, indtil det smelter lidt, og sæt ledningen spids ~ 10 - 15 um. Drej varme potentiometer off. Som perlen køler ned, den kontraherer og vil fjerne glasset fra spidsen af elektroden, udsætter den underliggende wolfram. Volframelektroden er klar til brug.
2. Multibarrel Glass Pipette Manufacturing
- Beskytte enderne af multitønde glas kapillærer (fem tønder i H-konfiguration) med varme krympeflex, at tillade et bedre greb til aftrækker klemmer og forhindre brud, og læg en i lodret aftrækker.
- For at opnå tip længder af ~ 15 mm, indstille aftrækker til følgende parametre: Varme: 84, Sub magnet kraft: 49, Main magnet kraft: 38. Finjuster disse parametre i henhold til den særlige opsætning, samt efter ændring af varmeelement.
- Træk kapillar at få to pipetter med tips tillukkede. Montere en pipette på et objektglas under anvendelse af modellervoks og bryde pipettespidsen under mikroskopet indtil den ydre diameter er ~ 20 - 30 um, ved anvendelse af fine sakse eller tænger eller den flade side af en skalpel. Hvis brudt kant er for groft, forfine det ved hjælp af tetraborat perle teknikken beskrevet i trin 1.7.
- Placer en wolfram elektrode (fra afsnit 1) i en holder lavet med en 20 G nål for enden af en 3-akse miniature micropositioner monteret på mikroskopet kronhjorte. Med pincet, bukke enden af elektroden 5 - 10 °, ~ 30 mm fra spidsen.
- Under mikroskopet, forsigtigt justere wolfram elektrode over multibarrel spids. Når den er sidestillet, sænke elektroden, indtil det kommer i kontakt med multibarrel, montering i rillen mellem de to øvre tønder. Skub spidsen af elektroden, indtil den rager -15 - 20 um væk fra spidsen af multibarrel. Gøre vinklen mellem elektroden og multibarrel så lille som muligt for at opnå en bedre binding og en tyndere ensemble.
- Påfør en lille dråbe af lys-hærdende lim ~ 5 mm væk fra spidsen. Pas limen ikke når spidsen for at undgå at blokere multibarrel kanaler.
- Cure limen ved hjælp af en blåt lys LED-lampe. Gentag limpåføringen / hærdning om nødvendigt, for bedre binding.
- Flyt mikroskopet scenen forsigtigt, indtil slutningen af wolfram elektroden frigøres fra holderen. Fjern piggy-back ensemble fra slide.
- Wrap the midterste del af piggy-back elektrode i en kort længde af varmekrympende rør og anvende hurtig hærdning epoxy passende for glas til yderligere sikring volframelektroden til multibarrel.
3. Lægemidler til Microiontophoresis
Bemærk: De lægemidler, der anvendes til microiontophoresis skal have en elektrisk ladning, når de opløses i vand. Check litteraturen at se, om lægemidlet af interesse er passende for denne procedure. Her, at proceduren for gabazine, en antagonist af GABAA-receptoren, er beskrevet.
- Filter destilleret vand under anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter at sterilisere vand og sikre indeholder nogen opløste stoffer. Forbered ~ 1.000 pi 20 mM gabazine bruge denne destilleret vand.
- Indstil pH af fortyndingen til 4 med 0,2 um filtreret NaOH under anvendelse af en fin-spids pH-elektrode.
- Opbevar 100 - 200 pi alikvoter ved -20 * C. Afrimning på dagen for optagelsen. Den dag, inden dyret er begrænseed, fylde tønder (3 - 5 pi) af multibarrel elektrode med lægemidlerne under anvendelse af en 100 pi mikroinjektionssprøjte med fleksibel plastik nål.
4. Kirurgi og Headpost Implantation
- Udføre eksperimenter i to mandlige CBA / J-mus (Mus musculus) med vægte på 27 og 30 g. Følg kirurgiske og registreringsprocedurer af Bryant og kolleger 29, Portfors og samarbejdspartnere 30-32, og Duque og Malmierca 26.
- I dagene før operationen, håndtere dyrene og vænne dem til optagelsen kammer ved at lade dem udforske frit. Udfør 3 sessioner om dagen, hver på mindst 30 min. Denne måde vil dyrene være roligere og komfortable under optagelserne.
- Bedøver musen med en blanding af ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injiceret intramuskulært. Med denne dosis er dyret dybt bedøvet for omkring 1 time. Giv supplerende doser af en omfatd af den første dosis efter behov.
- Sende dyret på et varmetæppe indstillet til at holde en temperatur på 38 ± 1 * C og stabilisere dyrets hoved i en stereotaktisk ramme ved at anvende to øre barer og en bid bar. Pas på ikke at gennembore trommehinden med øre barer.
- Beskytte øjnene ved at anvende en dråbe oftalmisk gel.
- Barber hovedbunden med en saks og anvende povidon-jod til at desinficere huden.
- Ved hjælp af en skalpel skæres et snit langs midterlinien for at blotlægge kraniet og tilbagetrække periosteum dækker parietal og mere rostral del af occipitale knogler.
- Lim et letvægts duralumin headpost (vægt ~ 0,65 g, længde 30 mm, figur 2A) med en rund og flad bund (5 mm diameter) på kraniet. Lim en sølvtråd til midten af headpost forlader dets ender fri. Den sølvtråd vil blive anvendt som referenceelektroden for elektrofysiologiske optagelse.
- Påfør et tyndt lag af ligHT-hærdelige klæbemiddel på kraniet og bunden af headpost. Vent 10 sek og placer headpost over rostral areal af parietale knogler, langs midterlinien.
- For en effektiv bindingsstyrke, lys hærde klæbemidlet ved anvendelse af en blå lyskilde i 20 sekunder.
- Bor tre huller omkring og bag bunden af headpost anvendelse af en elektrisk boremaskine og en lille borekrone.
- Placer to watch skruer (~ 2 mm længde) i de borede huller til at fungere som yderligere kontaktpunkter mellem kraniet og hovedtrin. Skruerne kræver 1½ vender at opnå en pasform. Test skruerne med pincet for at sikre de ikke er løse.
- Sæt spidsen af sølv jordledningen ind i det tredje hul og sørg for det kommer i kontakt med dura. Påfør en lille dråbe vand resistent cyanoacrylat lim til at binde ledningen til kraniet.
- Påfør lyshærdende komposit at styrke obligationen af headpost med kraniet. Dække bunden af headpost, den lave del af sølvtråd,og skruerne, og pas på ikke at forlænge bag lambda, at tillade adgang under optagelse. Cure anvendelse af en blå lyskilde.
- Trække musklen på bagsiden af halsen nær dens indføring på kraniet. Ved hjælp af en lille trepan (2,35 mm diameter), bore et rundt vindue lige under lambda sutur og sideværts med midterlinjen at blotlægge ringere colliculus (IC). Når grænserne er løse, trække op dækker knoglen med fine pincet. Hvis der opstår blødning, skyl med koldt sterilt saltvand for at stoppe det.
- Lav en lille (~ 1 mm brede og ~ 1 mm høje) mur omkring vinduet med komposit og lys-kur det.
- Dække den blotlagte kraniet og muskler med antibiotisk salve. Derefter fugte eksponerede overflade af IC med sterilt saltvand og dække det med vaseline, fylde godt genereret efter at gøre væggen omkring vinduet optagelse.
- Injicer buprenorphin subkutant (0,03 mg / kg, fortyndet 1:10 i sterilt saltvand) som et analgetikum.
- Hold dyret på than varmetæppe, indtil det vågner og returnere det til sin bolig bur til at inddrive fra kirurgi i tre dage før indspilningerne. Hus dyr i de enkelte rat's boliger bur for at forhindre bur kammerater rydde op i gelé og headpost røre metal-gitter dæksel. Placer nogle berigelse i buret, når dyret er single opstaldet. Også ændre dagligt savsmuldet for at forebygge infektion og nøje kontrollere, at dyret genvinder ordentligt og ikke viser nogen tegn på ubehag. Også kontrollere, om vaseline er over optagelsen vinduet beskytter den udsatte hjernen.
5. Elektrofysiologiske Optagelse og Microiontophoresis
- Efter inddrivelsen, giver dyret tid til at akklimatisere sig til optagelsen miljø og som har sit hoved behersket. Akklimatisere dyret ved fastsættelse af headpost til indehaveren, mens musen sidder på en skræddersyet polstret skum fastholdelsesanlæg udskåret til sin kropsstørrelse (figur 2B). Dette vil limDet bevægelser musen og vil bidrage til dens ro.
- Start med 10 min sessioner og progressivt øge varigheden op til 120 min. Under sessionen, belønne dyrene med søde væsker (kondenseret mælk, fortyndet 30:70 i vand) med givne intervaller 33. Senere under indspilningen, giver samme belønning ved starten og ved afslutningen af sessionen eller mens ingen neuron isoleres.
- Hvis dyret er meget begejstret forud for optagelsen, injicere mildt beroligende acepromazin (2 mg / kg, intraperitonealt). Ifølge den neurale system interesse, kan den beroligende påvirke dine resultater.
- Lad dyret frit at udforske optagelsen kammer i 5 - 10 min.
- Placer dyrets krop ind i skummet skræddersyede polstret harpiksstopperen (figur 2B).
- Fastgør headpost til en holder fastgjort til stereotaktisk ramme (Figur 2C). Dette er et godt tidspunkt at give dyret en flydende belønning.
- Cover dyrets krop med en bomuld tæppe og løst fastgør den ved hjælp af en plastik halvcylinderen og tape.
- Fjern vaseline fra vinduet optagelse og skyl med varmt sterilt saltvand.
- Optag neurale aktivitet og iontoforetisk anvendelse af gabazine.
- Placer multibarrel elektrode indehaveren, der kontrolleres af en mikrodrev og knyttet til en mikromanipulator.
- Forbind ledningerne til optagelse, ved hjælp af små krokodillenæb. Forbind den positive terminal til slutningen af wolfram elektrode, og jordterminalen til sølvtråd, der kontakter dura.
- Placer en ubelagt sølvtråd i hver tønde, så én ende berører opløsningen, og den anden ende er tilgængelig. Tilslut disse ender til microiontophoresis enheden ved at følge producentens anvisninger.
- Flyt multibarrel elektroden indtil spidsen i kontakt med overfladen af hjernen. Påfør varm steril saltopløsning for at forhindre udtørring af the hjernevæv. På det tidspunkt anvende en fastholdelse strøm (-10 nA for gabazine, kontrollere litteratur for det særlige lægemiddel) for at undgå udsivning af lægemidlet fra tønden spids, mens udkig efter en enkelt enhed aktivitet.
- Brug standard teknikker til isolering enkelt neuron ekstracellulær aktivitet. Opnå frekvensrespons område (FRA) af neuron, dvs. kombinationen af frekvenser og intensiteter i stand til at fremkalde en reaktion, fordi neuron er følsomme over for disse lyde 34-36.
- Vælge to frekvenser (F1 og F2), der fremkalder en lignende fyringshastighed og mønster. Præsenter hver af disse frekvenser så sjældent og gentagne stimuli under særling paradigme.
Bemærk: Kort beskrevet i oddball paradigme, er en frekvens (f1) præsenteret som den gentagne stimulus med en høj sandsynlighed for forekomst, mens den anden (F2) er den sjældent forekommende afvigende stimulus, afbrudt tilfældigt blandt de repetitive dem. I en anden oddball sekvens, den relativesandsynligheden for de to stimuli er byttet om. Nærmere oplysninger om stimulering paradigme er tidligere blevet beskrevet 22,37. - Slip gabazine ved at skifte strømmen til positive værdier (10 - 20 NA). Opnå igen FRA og gentag særling paradigme under gabazine ansøgningen. Fastholde udslyngning indtil en synlig effekt i skudhastighed overholdes; tager det normalt 5 - 20 min, afhængig af det særlige lægemiddel, dets koncentration, og størrelsen af udstødningen strøm. Gentage optagelsen protokollen til at opnå værdierne under indvirkning af lægemidlet.
- Stands injektionen ved at returnere strøm til retentionsværdier. Vent på lægemidlets virkning at vaske væk ved at overvåge, at FRA eller reaktion på den særling paradigme returnerer til kontrolværdier.
Bemærk: De indspilningerne kan vare 2 - 3 i timer per dag, og bør bringes til ophør tidligere, hvis dyret viser tegn på ubehag eller kæmper. Giv belønning væske og dækker optagelsen lmrav med vaseline.
6. Data Analysis
- Mål FRA før og under gabazine injektion samt niveauet af SSA.
- Kvantificer styrke SSA svar fra den fælles-SSA (CSI) og frekvens-specifikke SSA (SI) som beskrevet tidligere 19,22,23,38,39. CSI og SI afspejle den normaliserede forskel mellem den neuronale reaktion på sjældne stimulus og reaktion på gentagne én. Positive CSI og SI værdier angiver den neurale respons (pigge pr stimulus) var højere til sjældne end til gentagne toner.
- Sammenligne data fra kontrol og narkotika udslyngning tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi indspillede enkelt enhed aktivitet af 4 velisolerede neuroner i IC. Typiske signal-til-støj-forhold opnået under ekstracellulære optagelser i vågen mus er vist i figur 3B. Figur 4A viser frekvensgangen område (FRA) af hver neuron før og under blokaden af GABAA-receptorer med gabazine. En forøgelse i svaret styrke (pigge / stimulus) samt en udvidelse af den spektrale tuning blev observeret. Forøgelsen i fremkaldt reaktion var også tydeligt i de akkumulerede peri-stimulus tid histogrammer opnået fra det neurale respons på alle frekvenser og intensiteter præsenteret (figur 4B).
Et eller to par frekvenser inden neuron s FRA (krydser i figur 4A) blev udvalgt til at blive præsenteret som gentagne eller sjældne lyde i en særling paradigme, at sTudy niveauet af SSA i deres svar. For to eksempel neuroner, lyd-fremkaldte reaktioner på hver frekvens (F1 og F2) før og under gabazine injektion er vist som dot rastere i figur 5A, B. For de to eksempler neuroner, der var en klar ændring i lyden-fremkaldt reaktion som observeret i dot raster og PSTHs.
Ligeledes den lokale blokade af GABAA-receptorer øget neuronal reaktion på det store flertal af sjældne og gentagne toner (figur 5C) i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse 16. blev observeret Forskellige SSA i de neurale reaktioner på f1 og f2, som blev afspejlet i positiv CSI (CSI interval: -0,26 til 0,43, 0,25 ± 0,23) og SI-værdier (SIS interval: -0,41 til 0,83, 0,25 ± 0,23) . For de fleste af de tilfælde, den forøgede reaktion på den gentagne tone forårsagede et fald i disse indeks observeret i figur 5D
Figur 1. materiale til fremstilling af wolframelektroder. (A) Elektrode tilpasning værktøj, med nogle wolfram ledninger på plads. Den lettere stykke til venstre er et stop for ledningerne. Den saks spids angiver den side bruges som en guide til at skære ledningerne til den ønskede længde. (B) Tøm spindel. (C) Spindel med en batch af elektroder fastgjort, og hviler på en holder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Tilbehør til Awake Mus Recordings. (A) Headpost. (B) Skræddersyede polstret skum fastholdelsesanlæg. Placer than mus i mellem begge stykker, forlader hovedet udenfor. (C) Ændringer i stereotaktisk ramme. Den headpost holder (top bar) hjælper under headpost implantation og fastholder hovedet under optagelserne. Den bid stykke (lavere bar) bruges kun under headpost implantation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Eksempel på optagelse i Awake Mouse. (A) Frekvensgang område af en neuron fra musen IC. (B) bølgeformer af piggene optaget fra dette neuron. (C, D) Dot raster og peristumulus-time histogram optages fra denne neuron anvendelse af en særling paradigme ved frekvenserne angivet af prikkerne i (A). Gentegnes fra dataoffentliggjort i Duque og Malmierca 26. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Virkning af blokade af GABAA-receptorer på Spectral og Temporal Properties svar. (A) Frekvensgang område af fire IC indspillede neuroner før og under microiontophoretic injektion af gabazine. De sorte krydser i (A) angiver de frekvenser, valgt at blive præsenteret som sjældne og gentagne lyde. (B) Akkumuleret peri-stimulus tid histogrammer af den neurale respons på alle frekvenser og intensiteter præsenteret for konstruere respons området før og under injektionen af gabazine. De sorte søjler indikerer lyden varighed.Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Effekt af blokaden af GABAA-receptorer på reaktionen på gentagne og sjældne Sounds. (A, B) Dot raster af spiking reaktion på et par af frekvenser, der præsenteres som sjælden (rød, 10%) og gentagne stimulus (blå, 90%) før og under anvendelsen af gabazine. Hver frekvens spilles i to sekvenser, således at hver enkelt blev præsenteret som rare- og gentagne. Det skraverede baggrund angiver varigheden af stimulus. (C). Single-neuron svar på syv par frekvenser, der præsenteres som den sjældne og som den gentagne lyd før og under påføring af gabazine. (D) Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den microiontophoresis af neuroaktive stoffer i vågne dyr er en kraftfuld teknik til at undersøge og dissekere rolle specifikke synaptiske input på aktiviteten af enkelte neuroner 40,41. Endnu vigtigere, denne procedure muliggør bestemmelse af virkningen af de neurotransmittere og neuromodulatorer på neurale kredsløb uden potentielle forstyrrelser af bedøvelsesmidler. Her viser vi, at anvendelsen af gabazine i IC af vågen mus håndfast ændrede frekvens tuning (figur 4A), de tidsmæssige reaktionsmønstre (figur 4B) og SSA (figur 5).
Den væsentligste begrænsning af den beskrevne procedure er den relativt korte optagetiden (~ 3 timer), som er bestemt af niveauet af tilvænning af dyret til indspilningerne. På den anden side kan flere indspilningssessioner udføres på det samme dyr. Brug microiontophoresis det er uklart, hvor langtde anvendte neuroaktive stoffer diffunderer ind i det omgivende væv. Derfor kan en mulig effekt på neuronal netværk aktivitet fremkaldes ved at påvirke ikke kun optaget neuron, men også det omgivende gliale og neuronale celler. For eksempel har Candy og kolleger 42 vist, at visse afgives iontoforetisk molekyler, som ikke fjernes hurtigt, kan diffundere op til 600 um. I mus IC dette interval ville dække de fleste af omfanget af de dendritiske dorne men også påvirke den neuronale respons af tilstødende celler. Sammenfattende frigives lægemidlet ved iontoforese er ikke så rumligt begrænset som intracellulær lægemiddel dialyse, som tillader dissektion i finere detaljer af de synaptiske input til mål-neuron og test af lokale netværk behandler 16,43, det er mere specifikke end andre eksperimentelle procedurer anvendes til at manipulere niveauet af neurotransmission eller Neuromodulation, såsom systemiske injektioner, anvendelse af optogenetic teknikker eller push-pull dialyse.
Spidsen diameter glas pipetter og størrelsen af fastholdelses- og injektion strømninger er nøglefaktorer til at overvåge for at undgå uspecifik stof lækage ind i vævet. De lave injektion strømme (i størrelsesordenen tiere af na) begrænse spredningen af lægemidlet muliggør optagelse af neuroner tæt på hinanden. For eksempel tre af de fire neuroner bruges som eksempler (neuroner 1 - 3) blev registreret langs det samme spor med afstande på 16 og 800 um mellem dem. Trods den korte afstand på 16 um mellem neuron 1 og 2, blev en klart forskellig respons på neuron 2 observeret (figur 4).
Nogle alternativer til den foreslåede piggy-back-konfiguration er tidligere blevet anvendt. En af dem består i at anvende en af de multibarrel pipetter til optagelse, i stedet for en separat elektrode. Mens konstruktionen af ensembler er mindre kompliceret i dette tilfælde, er der ulemper. First, vil alle kanalerne har samme åbning diameter på spidsen, som ikke kan være optimale for både optagelse og lægemiddeladministration. Også den fremspringende elektrodespidsen i piggy-back-konfiguration forhindrer skader på målcellen sandsynligvis forårsaget af den bredere spids multibarrel. Den anden fælles alternativ er brugen af single-tønde glas pipetter til optagelse 15,44 i stedet for wolframelektroder. Glas elektroder er nemme at fremstille de krævede dimensioner, men har tendens til at tilstoppe under lange optagelser, eller når de rejser dybt ind i hjernen, så i vores erfaring wolframelektroder give mere pålidelige optagelser. Desuden ved anvendelse af wolframelektroder er det muligt at fremstille elektrolytisk læsion at lokalisere optagelse sites, uden de yderligere omfattende histologiske procedurer, der kræves, når et neuralt sporstof injektion anvendes 45. Anvendelsen af multibarrel glaspipetter tillader frigivelse af flere agonister og / eller antagonister meget tæt på optagelsensite, som er en stor fordel, når interaktionen mellem neurotransmittersystemer på sensorisk forarbejdning er under undersøgelse.
De er beskrevet i denne protokol til fremstilling af piggy-back elektroder procedurer gør det muligt at producere optagelse elektroder i henhold til de specifikke krav i eksperimentet og af de særlige kendetegn ved målområdet af interesse i en systematisk, men tilpasset måde. Desuden er de materialer til headpost fiksering konventionelt anvendes i tandplejen, så de er let tilgængelige. Således de kritiske trin i protokollen er dyret tilvænning og ætsning af wolframelektroder, som er de vigtigste faktorer, der bidrager til godt isolerede neuroner og stabile elektrofysiologiske optagelser. Samlet er denne teknik relativt enkel, økonomisk og meget pålidelig som et middel til at undersøge den rolle, multiple neuroaktive stoffer på enkelt- eller multi-enhed neuronal aktivitet i vågen, materialerbehersket mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af MINECO giver BFU201343608-P og PSI2013-49348-EXP, og JCYL tilskud SA343U14 til MSM og MRC grundlæggende finansiering til ARP. YAA afholdt en CONACYT (216.106) og en SEP-fællesskab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
References
- Harris, K. D., Thiele, A. Cortical state and attention. Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
- Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Frohlich, F. Awake vs. anesthetized: layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
- Haider, B., Hausser, M., Carandini, M. Inhibition dominates sensory responses in the awake cortex. Nature. 493 (7430), 97-100 (2013).
- Rudolph, M., Pospischil, M., Timofeev, I., Destexhe, A. Inhibition determines membrane potential dynamics and controls action potential generation in awake and sleeping cat cortex. J Neurosci. 27 (20), 5280-5290 (2007).
- Buran, B. N., von Trapp, G., Sanes, D. H. Behaviorally gated reduction of spontaneous discharge can improve detection thresholds in auditory cortex. J Neurosci. 34 (11), 4076-4081 (2014).
- Duque, D., Malmierca, M. S., Caspary, D. M. Modulation of stimulus-specific adaptation by GABA(A) receptor activation or blockade in the medial geniculate body of the anaesthetized rat. J Physiol. 592, (Pt 4) 729-743 (2014).
- Stone, T. W. Microiontophoresis and Pressure Ejection. , Wiley. (1985).
- Lalley, P. M. Modern techniques in neuroscience research). Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. 193-212 (1999).
- Foeller, E., Celikel, T., Feldman, D. E. Inhibitory sharpening of receptive fields contributes to whisker map plasticity in rat somatosensory cortex. J Neurophysiol. 94 (6), 4387-4400 (2005).
- Foeller, E., Vater, M., Kossl, M. Laminar analysis of inhibition in the gerbil primary auditory cortex. J Assoc Res Otolaryngol. 2 (3), 279-296 (2001).
- Kurt, S., Crook, J. M., Ohl, F. W., Scheich, H., Schulze, H. Differential effects of iontophoretic in vivo application of the GABA(A)-antagonists bicuculline and gabazine in sensory cortex. Hear Res. 212 (1-2), 224-235 (2006).
- Sivaramakrishnan, S., et al. GABA(A) synapses shape neuronal responses to sound intensity in the inferior colliculus. J Neurosci. 24 (21), 5031-5043 (2004).
- Havey, D. C., Caspary, D. M. A simple technique for constructing 'piggy-back' multibarrel microelectrodes. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 48 (2), 249-251 (1980).
- Dondzillo, A., Thornton, J. L., Tollin, D. J., Klug, A. Manufacturing and using piggy-back multibarrel electrodes for in vivo pharmacological manipulations of neural responses. J Vis Exp. (71), e4358 (2013).
- Perez-Gonzalez, D., Hernandez, O., Covey, E., Malmierca, M. S. GABA(A)-Mediated Inhibition Modulates Stimulus-Specific Adaptation in the Inferior Colliculus. PLoS ONE. 7 (3), e34297 (2012).
- Bullock, D. C., Palmer, A. R., Rees, A. Compact and easy-to-use tungsten-in-glass microelectrode manufacturing workstation. Med Biol Eng Comput. 26 (6), 669-672 (1988).
- Sugiyama, K., Dong, W. K., Chudler, E. H. A simplified method for manufacturing glass-insulated metal microelectrodes. J Neurosci Methods. 53 (1), 73-80 (1994).
- Ulanovsky, N., Las, L., Nelken, I. Processing of low-probability sounds by cortical neurons. Nat Neurosci. 6 (4), 391-398 (2003).
- Escera, C., Malmierca, M. S. The auditory novelty system: An attempt to integrate human and animal research. Psychophysiology. 51 (2), 111-123 (2014).
- Malmierca, M. S., Sanchez-Vives, M. V., Escera, C., Bendixen, A. Neuronal adaptation, novelty detection and regularity encoding in audition. Front Syst Neurosci. 8, 111 (2014).
- Malmierca, M. S., Cristaudo, S., Perez-Gonzalez, D., Covey, E. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the anesthetized rat. J Neurosci. 29 (17), 5483-5493 (2009).
- Antunes, F. M., Nelken, I., Covey, E., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the auditory thalamus of the anesthetized rat. PLoS ONE. 5 (11), 14071 (2010).
- von der Behrens, W., Bauerle, P., Kossl, M., Gaese, B. H. Correlating stimulus-specific adaptation of cortical neurons and local field potentials in the awake rat. J Neurosci. 29 (44), 13837-13849 (2009).
- Perez-Gonzalez, D., Malmierca, M. S. Variability of the time course of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 107 (2012).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Struct Funct. , (2014).
- Merrill, E. G., Ainsworth, A. Glass-coated platinum-plated tungsten microelectrodes. Med Biol Eng. 10 (5), 662-672 (1972).
- Ainsworth, A., Dostrovsky, J. O., Merrill, E. G., Millar, J. An improved method for insulating tungsten micro-electrodes with glass [proceedings]. J Physiol. 269 (1), 4-5 (1977).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. J Neurosci Methods. 178 (1), 75-79 (2009).
- Portfors, C. V., Roberts, P. D., Jonson, K. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162 (2), 486-500 (2009).
- Portfors, C. V., Mayko, Z. M., Jonson, K., Cha, G. F., Roberts, P. D. Spatial organization of receptive fields in the auditory midbrain of awake mouse. Neuroscience. 193, 429-439 (2011).
- Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers. J Vis Exp. (64), (2012).
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nat Protoc. 1 (2), 936-946 (2006).
- Malmierca, M. S., et al. A discontinuous tonotopic organization in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 28 (18), 4767-4776 (2008).
- Izquierdo, M. A., Gutierrez-Conde, P. M., Merchan, M. A., Malmierca, M. S. Non-plastic reorganization of frequency coding in the inferior colliculus of the rat following noise-induced hearing loss. Neuroscience. 154 (1), 355-369 (2008).
- Palmer, A. R., Shackleton, T. M., Sumner, C. J., Zobay, O., Rees, A. Classification of frequency response areas in the inferior colliculus reveals continua not discrete classes. J Physiol. 591 (16), 4003-4025 (2013).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation and deviance detection in the inferior colliculus. Front Neural Circuits. 6, 89 (2013).
- Duque, D., Perez-Gonzalez, D., Ayala, Y. A., Palmer, A. R., Malmierca, M. S. Topographic distribution, frequency, and intensity dependence of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the rat. J Neurosci. 32 (49), 17762-17774 (2012).
- Ayala, Y. A., Perez-Gonzalez, D., Duque, D., Nelken, I., Malmierca, M. S. Frequency discrimination and stimulus deviance in the inferior colliculus and cochlear nucleus. Front Neural Circuits. 6, 119 (2013).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. In vivo release of [3H]-purines by quinolinic acid and related compounds. Br J Pharmacol. 80 (2), 263-267 (1983).
- Lalley, P. M. Modern Techniques in Neuroscience Research. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. Berlin Heiderlberg. Ch. 7 193-212 (1999).
- Candy, J. M., Boakes, R. J., Key, B. J., Worton, E. Correlation of the release of amines and antagonists with their effects. Neuropharmacology. 13 (6), 423-430 (1974).
- Martins, A. R., Froemke, R. C. Coordinated forms of noradrenergic plasticity in the locus coeruleus and primary auditory cortex. Nat Neurosci. , (2015).
- LeBeau, F. E., Rees, A., Malmierca, M. S. Contribution of GABA- and glycine-mediated inhibition to the monaural temporal response properties of neurons in the inferior colliculus. Journal of Neurophysiology. 75 (2), 902-919 (1996).
- Ayala, Y. A., Malmierca, M. S. Cholinergic modulation of stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus. The Journal of Neuroscience. 35 (35), 12261-12272 (2015).
