The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
Växter är allmänt används för att producera livsmedelsråvaror såsom fruktjuicer, men de kan också utvecklas som plattformar för tillverkning av högre värde biofarmaceutiska produkter 1-3. I båda fallen, nedströms (DSP) börjar ofta med extraktion av vätskor från vävnader såsom blad eller frukter, följt av klargörande av partikelbemängd extrakt 4,5. För tillverkning av biologiska läkemedel, kan kostnaderna för DSP står för upp till 80% av de totala produktionskostnaderna 6,7 och detta delvis återspeglar den höga partikelbördan närvarande i extrakt framställda av störande metoder såsom bladbaserade homogenisering 8,9 . Även rationell urval av filterskikt för att matcha partikelstorleksfördelningen i extraktet kan öka filterkapacitet och minska kostnaderna 10,11, kan förbättringen aldrig överstiga ett tak på absoluta kapacitet definieras av antalet partiklar som måste bevaras perenhet av filterytan för att uppnå förtydligande.
Taket kan lyftas om färre partiklar når ytan av de finaste filter i filtrerings tåg, och detta kan uppnås om spridda partiklar blandas med polymerer som är kända som flockningsmedel som främjar aggregering att bilda stora flockar 12. Sådana flockar kan behållas längre uppströms av grövre och billigare påsfilter, vilket minskar partikelbördan når finare och dyrare djupfilter. Polymer måste ha säkerhetsprofiler som är lämpliga för sina ansökningar, till exempel för bioläkemedel de måste vara kompatibel med god tillverkningssed (GMP), och typiskt måste ha en molmassa> 100 kDa och kan antingen vara neutral eller debiteras 13. Medan neutrala flockuleringsmedel fungerar däremot i allmänhet genom tvärbindning dispergerade partiklarna orsakar deras aggregering och bildandet av flockar med diametrar> 1 mm 11, laddade polymerer neutralisera laddningen av dispersed partiklar, vilket minskar deras löslighet och därmed orsakar utfällning 14.
Flockning kan förbättras genom att justera parametrar såsom pH eller konduktivitet, och typen polymer eller koncentration, för att matcha egenskaperna hos extraktet 15,16. För tobaksextrakt förbehandlats med 0,5-5,0 g L -1 polyetylenimin (PEI), en mer än två-faldig ökning av djupfilter kapacitet rapporterades i en 100-L pilotskala process. Kostnaden för denna polymer är mindre än € 10 kg -1 så dess införande i processen resulterat i kostnadsbesparingar på cirka 6000 € för filter och förbrukningsartiklar per sats 16 eller ännu mer när de kombineras med cellulosabaserat filterhjälpmedel 17. Trots detta är prediktiva modeller som krävs för att utvärdera a priori ekonomiska fördelarna med flockningsmedel eftersom deras integration kan kräva håll stegen 15-30 min 16,18, vilket resulterar i ytterligare investeringskostnader för lagringtankar. Men det finns för närvarande inga mekanistiska modeller som kan förutsäga resultatet av dessa experiment på grund av den komplicerade karaktären av flockning. Därför var en mer lämplig utformning-of-experiment (DOE) metod 19 utvecklats som beskrivs i denna artikel. Ett protokoll för den allmänna DoE förfarande har nyligen publicerats 20.
Små produkter finns nu tillgängliga för high-throughput screening av flockningsförhållanden 21. Dock kan dessa enheter inte realistiskt simulera förhållanden under flockning av växtextrakt, eftersom dimensionerna hos reaktionskärlet (~ 7 mm för brunnar på en 96-brunnar) och partiklar eller flockar kan vara mindre än en storleksordning isär. Detta kan påverka blanda mönster och därmed prognosförmåga av modellen. Dessutom kan det vara svårt att skala ner processer som involverar utfällning på grund av icke-linjära förändringar i blandnings beteende och fällning staheten 22. Därför denna artikel beskriver en bänk-top-skala screeningsystem med en kapacitet på 50-75 prover per dag, ger resultat som är skalbara från den ursprungliga 20 ml reaktionsvolym till en 100 L pilotskala process 16. När de kombineras med en DoE tillvägagångssätt, ger detta de prediktiva modeller som ska användas för processoptimering och dokumentation som en del av en kvalitet-för-designkoncept.
Metoden som beskrivs nedan kan också anpassas till biologiska läkemedel som produceras i cellkultur-baserade processer, där flockningsmedel är också betraktas som en kostnadsbesparande verktyg 23. Den kan också användas för att modellera den utfällning av målproteiner från ett råextrakt som en del av en strategi för rening, såsom visats för β-glukuronidas som produceras i raps, majs och sojaböna 24,25. Kan hittas En detaljerad beskrivning av flockningsegenskaper på andra ställen 16,26 och det är viktigt att säkerställa att polymer concentrheten är antingen icke-toxiska eller under skadliga nivåer i slutprodukten 11.
Den viktigaste aspekten att tänka på när inrätta ett DOE att karakterisera partikelflock är att konstruktionen måste i princip kunna upptäcka och beskriva de förväntade eller möjliga effekter 36,38, t ex påverkan av pH, polymertyp och polymerkoncentration 16. Därför är det viktigt att utvärdera den del av design utrymme (FDS) innan den verkliga experiment. FDS är den del av den flerdimensionella experimentella utrymmet (som omfattas av konstruktionsfaktorer, t.ex. …
The authors have nothing to disclose.
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |