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Biology

Vorgehensweise Um die Effizienz von Flockungsmittel für die Beseitigung von Dispersed Partikel aus Pflanzenextrakten zur Bewertung

Published: April 9, 2016 doi: 10.3791/53940

Introduction

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Pflanzen sind weit verbreitet zu produzieren Nahrungsmittelrohstoffe wie Fruchtsäfte verwendet, aber sie können auch als Plattform für die Herstellung von höherwertigen biopharmazeutischen Produkten 1-3 entwickelt werden. In beiden Fällen wird der Weiterverarbeitung (DSP) beginnt häufig mit der Entnahme von Flüssigkeiten aus dem Gewebe wie Blätter oder Früchte, gefolgt von der Klärung der partikelbeladenen Extrakte 4,5. Für die Herstellung von Biopharmazeutika, können die Kosten für die DSP machen bis zu 80% der gesamten Produktionskosten 6,7 und dies spiegelt teilweise die hohe Partikelbelastung in Extrakten durch disruptive Methoden wie Blade-basierte Homogenisierung hergestellt 8,9 . Obwohl die rationale Auswahl der Filterschichten kann die Partikelgrößenverteilung in dem Extrakt auf Filterkapazität zu erhöhen und die Kosten 10,11 reduzieren, kann die Verbesserung nicht durch die Anzahl von Partikeln definiert , die Obergrenze der absolute Kapazität überschreiten , die pro aufbewahrt werden müssenEinheit Filterfläche Klärung zu erreichen.

Die Decke kann aufgehoben werden , wenn weniger Partikel die Oberfläche der feinsten Filter in der Filterstrang gelangen, und dies kann , wenn dispergierte Teilchen vermischt sind mit Polymeren als Flockungsmittel bekannt , erreicht werden, die die Aggregation fördern 12 große Flocken zu bilden. Solche Flocken können weiter stromaufwärts durch gröbere und weniger teuer Beutelfilter zurückgehalten werden, um die Partikelbelastung Verringerung der feineren erreichen und teurer Tiefenfilter. Die Polymere müssen Sicherheitsprofile haben für ihre Anwendungen, zB für Biopharmazeutika sie mit der guten Herstellungspraxis (GMP) entsprechen müssen, und in der Regel müssen sie eine Molmasse> 100 kDa haben und entweder neutral oder 13 aufgeladen werden kann. Während neutral Flockungsmittel deren Aggregation und die Bildung von Flocken mit einem Durchmesser handeln , im allgemeinen durch Vernetzung dispergierten Teilchen verursacht> 1 mm 11, neutralisieren geladene Polymere die Ladung von dispersed Partikel, wodurch ihre Löslichkeit und damit verursachenden Niederschläge 14.

Flockung kann durch Einstellen Parameter wie pH oder Leitfähigkeit und der Polymertyp oder der Konzentration verbessert werden, 15,16 , die Eigenschaften des Extrakts zu entsprechen. Tabakextrakte vorbehandelt mit 0,5-5,0 g L -1 Polyethylenimin (PEI), eine mehr als 2-fache Erhöhung der Tiefenfilterkapazität wurde in einer 100-L Pilotmaßstab Prozess berichtet. Die Kosten für dieses Polymers weniger als 10 € kg -1 , so dass ihre Einführung in den Prozess zu Kosteneinsparungen geführt von ca. 6.000 € für Filter und Verbrauchsmaterialien pro Charge 16 oder sogar noch mehr , wenn sie mit Cellulosebasis Filterhilfsmittel 17 kombiniert. Trotzdem sind Vorhersagemodelle erforderlich , um die a priori wirtschaftlichen Nutzen von Flockungsmitteln zu bewerten , da die Einbeziehung halten Schritten von 15-30 min 16,18 erfordern kann, was zu einer weiteren Investitionskosten für die LagerungPanzer. Es gibt jedoch noch keine mechanistische Modelle zur Verfügung, um das Ergebnis dieser Experimente aufgrund der komplexen Natur der Flockung vorhersagen kann. Daher ist ein geeignetes Design-of-Experiments (DoE) Ansatz 19 wurde wie in diesem Artikel beschrieben entwickelt. Ein Protokoll für die allgemeine DoE Verfahren wurde kürzlich 20 veröffentlicht.

Kleines Geräte sind ab sofort verfügbar für das Hochdurchsatz - Screening von Flockungsbedingungen 21. Jedoch können diese Vorrichtungen nicht realistisch Bedingungen während der Ausflockung von Pflanzen simulieren extrahiert, da die Abmessungen des Reaktionsgefäßes (~ 7 mm für die Vertiefungen auf einer Platte mit 96 Vertiefungen) und die Partikel oder Flocken kann weniger als eine Größenordnung auseinander. Dies kann Mischmuster beeinflussen und damit die Vorhersagekraft des Modells. Darüber hinaus kann es schwierig sein, Prozesse zu verringern Präzipitation denen aufgrund nicht-linearen Änderungen des Mischungsverhalten und Präzipitat stabilität 22. Daher beschreibt dieser Artikel eine Bank-top-Skala - Screening - System mit einem Durchsatz von 50 bis 75 Proben pro Tag, Ergebnisse liefert , die von der anfänglichen 20 ml Reaktionsvolumen auf einer 100 l - Pilotmaßstab Prozess 16 skalierbar sind. Wenn es mit einem DoE Ansatz kombiniert, ermöglicht dies die Vorhersagemodelle für die Prozessoptimierung und Dokumentation im Rahmen eines Qualitäts-by-Design-Konzept verwendet werden.

Das nachfolgend beschriebene Verfahren kann auch auf Biopharmazeutika angepasst werden produziert in der Zellkultur-basierten Verfahren, bei denen Flockungsmittel auch als kostensparende Werkzeug 23 in Betracht gezogen werden. Es kann auch die Ausfällung von Zielproteinen aus einem Rohextrakt zu modellieren als Teil eines Reinigungsstrategie verwendet werden, wie für die β-Glucuronidase in Raps, Mais und Soja 24,25 hergestellt demonstriert. Eine detaillierte Beschreibung der Flockungsmittel Eigenschaften können an anderer Stelle werden 16,26 und es ist wichtig , um sicherzustellen , dass das Polymer Konzentr gefundentionen sind entweder nicht-toxische oder unter schädlichen Mengen im Endprodukt 11.

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Protocol

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1. Entwickeln Sie eine angemessene experimentelle Strategie

  1. Identifizieren Sie die Umwelt- und Prozessparameter , die relevant sind für die Flockung Verfahren festgelegt oder optimiert werden, das heißt , welche Faktoren den stärksten Effekt auf Flockung haben. Typischerweise gibt es mehrere solche Parameter so ein Ansatz DoE wie kürzlich beschrieben 20 aufgrund des Fehlens von mechanistischen Modelle notwendig.
    1. Wählen Sie die Parameter (Faktoren) auf Basis von Literaturdaten 12, Vorkenntnisse und Erfahrungen mit dem System. Typische Faktoren umfassen Puffer , pH, Pufferleitfähigkeit, Inkubationszeit und Temperatur sowie Polymertyp und Konzentration 15,16,27.
    2. Verwenden Sie die gleichen Referenzen (siehe 1.1) für jeden numerischen Faktor und Ebenen für kategoriale Faktoren sinnvolle Bereiche zu definieren.
    3. Definieren die Versuchsergebnisse (Reaktionen) zu überwachen und verwendet werden, um die Effizienz der Flockung zu bewerten. Je nach System, diesekann Filtrat oder der Überstand Trübung, Sinkgeschwindigkeit, Aggregatgröße oder die Kapazität eines nachfolgenden Filter 16,23,28-30.
    4. Sicherstellen, dass die Tests verwendet, um die Antworten zu messen sind quantitative, robuste und reproduzierbare / reproduzierbar, so dass die daraus resultierenden Daten hoher Qualität mit Experimenten später oder durch einen anderen Betreiber durchgeführt ergänzt werden kann.
  2. Wählen Sie eine DoE Art die Anzahl der Faktoren suiting über das System untersucht und der Grad des Wissens bereits angesammelt. Verwenden Sie vorhandene Literatur eine geeignete DoE Typ 20 zu identifizieren.
    1. Wählen Sie eine Siebung Design, wenn es wenig Informationen über die Flockung System untersucht werden, eine große Anzahl von Parametern gescreent werden müssen oder nur wenig bekannt über sinnvolle Bereiche für die Parameter. Typische Screening-Designs sind voll und teilfaktoriellen Designs. Umfassen Mittelpunkte in der Konstruktion , wenn die Parameter eine nichtlineare Wirkung zu erwarten ist , beispielsweise 19.
    2. Wählen Sie eine Antwortoberfläche Methodik (RSM), zB zentrale Composite Design (CCD) 31 oder optimale 32,33, wenn nur wenige Faktoren , die mit bekannten Bereiche müssen genau gekennzeichnet werden.
  3. Stellen Sie die DoE mit entsprechender Software up a priori Qualitätskriterien wie der Anteil der Design - Raum zu gewährleisten 20 erfüllt sind.

2. Bereiten Sie die Flockung Experimente

Abbildung 1
Abbildung 1: Pflanzenextrakt Flockung Workflow: Prozessmaßstab (links) und Benchtop - Skala (rechts). Folgende Protein Extraktion mit wässrigen Puffern, dispergierte Teilchen von Zelltrümmer werden durch die Zugabe von Flockungsmitteln aggregiert. Die Aggregate werden dann durch eine Kaskade von Tasche und Tiefenfiltration und die Kapazität dieser entferntentlang Filter mit dem Filtrat Trübungen können direkt die Effizienz der Flockung zu messen, verwendet werden.

  1. Entwickeln Sie eine Allgemeine experimentelle Work Flow (Abbildung 1).
    1. Verwenden Sie eine Absaugeinrichtung , die voraussichtlich in der gleichen Partikelgrößenverteilung ergibt sich (oder bereits beobachtet wird ) bei der Endanwendung Skala, zB einem spezialisierten Homogenisator. Wenn möglich, die Gestaltung eines Scale-down - Modell des Extraktor für die Homogenisierung von Tabak beschrieben 10 verlässt.
    2. Definieren Sie die Extraktmengen während Flockung Experimenten verwendet (hier 20 ml). Wählen Sie ein Volumen , das eine repräsentative Anzahl von Teilchen sein , die in dem Reaktionsgefäß, beispielsweise Flockungs- Experimente in 20 ml Aliquots ergab reproduzierbar und skalierbares Ergebnisse für Tabakextrakten ~ 7% [w / v] Feststoffe 34 und Teilchengrößen von ~ 0,5 ermöglicht um bis ~ 3 mm 16.
    3. Entwerfen Sie alle Überwachungs- und Post-Flockung-Operationen, so dass they sind repräsentativ für die Skala Endanwendung, zB wählen Sie Filter mit dem gleichen Verhalten Partikelretention , wie sie bei den Produktionsmaßstab verwendet.
  2. Pflegen Sie die Pflanzen, aus denen die Extrakte hergeleitet.
    1. Verwenden Sie die gleiche Pflanzenlinie, hier Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 und Anbaubedingungen , die bei der Herstellung verwendet werden , wie zuvor beschrieben 33.
    2. Wenn andere Ausgangsmaterialien verarbeitet werden, diese Ausgangsmaterialien vorbereitet , so dass sie von der Endanwendung Maßstab repräsentativ sind, zum Beispiel verwenden authentische Puffer, zur Berücksichtigung von Verdünnungsschritte während des Prozesses und halten Sie sich an den erwarteten pH - Wert und Leitfähigkeit, hier pH 7,5 und Leitfähigkeit 30 mS cm -1.
  3. Bereiten Filtration Utilities, Trübungs-Überwachungsgeräte und Probenahmegefäße.
    1. Schneiden Sie die Filtermaterialien auf die gewünschte Größe, hier 15 x 15 cm 2, wenn sie nicht bereit zu uns sinde-Module. Sicherstellen, dass alle Überwachungs- und Analysegeräte sind funktionell und beschriften Sie alle Probenröhrchen.
    2. Auch wenn diese einfache Aufgaben sind, bereiten diese Elemente in der Zeit, um sicherzustellen, dass sie nicht Unterbrechungen während der eigentlichen Flockung Experimente führen wird. Vermeiden Sie Verzögerungen, weil sie mit den Ergebnissen, die Flockung gegeben stören kann, ist eine zeitabhängige Verfahren.
  4. Bereiten Sie Flockungsmittel Stammlösungen. ACHTUNG: Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung , wenn Flockungsmittel, zB Handschuhe Handhabung. Die Materialien können gefährlich sein (Gefahrzetteln nach Europa UE 67/548 / EWG und 1999/45 / CE umfassen N, Xi oder Xn). Vermeiden Sie Staub und beziehen sich auf die Sicherheitsdatenblätter. Die Arbeiten im Rahmen einer Abzugshaube.
    1. Wählen Sie eine Stammkonzentration für jedes Flockungsmittel, hier 80,0 g L -1 für die beiden PEI Flockungsmittel , die verwendet wurden. Wählen Konzentrationen so hoch wie möglich Probenverdünnung zu vermeiden, wenn das Flockungsmittel Zugabe, die Partikel Konzentra reduzieren würdetion und damit Flockung Effizienz beeinflussen.
    2. Konto für jede Prädilutions- , die die Hersteller Formulierung des Polymers, zum Beispiel , wenn das Polymer bereits geliefert als eine wässrige 50% [w / v] Lösung widerspiegelt. Flockungsmittel Stammlösungen von 4-8% [w / v] gefunden wurden die am besten geeignet, so weit zu sein.
    3. Unter Berücksichtigung der oben diskutierten Punkte, stellen Sie sicher, dass das Flockungsmittel Konzentration erzeugt keine eine hochviskose Lösung, die Pipettieren hemmt, möglicherweise Fehler verursachen, weil die endgültige Flockungsmittelkonzentration nicht richtig eingestellt ist.
    4. Verwenden Sie die gleiche Stammkonzentration für alle Flockungsmittel, wenn möglich, da dies den Aufbau eines Pipettierschema (2.5) erleichtern somit die Wahrscheinlichkeit von Fehlern zu reduzieren.
    5. Stellen Sie den pH - Wert und Leitfähigkeit jedes Flockungsmittel Stammlösung , die Bedingungen der Extrakte übereinstimmen, hier pH 4-10 und 15-55 Leitfähigkeit mS cm -1. Bereiten Sie einzelne Aktien für ein einzelnes Flockungsmittel, wenn mErz als ein Satz von pH-Wert und / oder Leitfähigkeitsbedingungen für diesen Polymer getestet.
    6. Bereiten Sie Flockungsmittel Stammlösungen frisch, nicht mehr als 48 Stunden vor dem Gebrauch. Obwohl kann Flockung mit Polymer-Aktien für mehr als 4 Wochen gelagert induziert werden, kann der Wirkungsgrad durch Hydrolyse bei hohen oder niedrigen pH-Werten zu Polymer sinken. Finden Sie in der Dokumentation des Herstellers für weitere Details.
    7. Stellen Sie sicher , dass die Parameter für die DoE ausgewählt können während des Experiments genau für jede Probe eingestellt werden, zum Beispiel sicherzustellen , dass es Heiz- / Kühlbäder zur Verfügung Bebrütungstemperaturen einzustellen, hier 4 ° C, 20 ° C und 37 ° C. Wenn während der Flockung Mischteil des Experiments ist es, sicherzustellen, dass die Mischvorrichtung ist repräsentativ für die Endanwendung Skala in Bezug auf kritische Parameter wie Stromeingang.
  5. Konvertieren Sie das DoE Zeitplan in ein Pipettierschema.
    1. Konvertieren Sie die verschiedenen Flockungsmittel Konzentrationen tes zu seinted in Volumen der Stammlösung, die zu den Extraktproben hinzugefügt werden: die letzten Flockungsmittel Konzentrationen durch die Stammkonzentration teilen und durch das Probenvolumen in den Flockung Experimenten verwendet multiplizieren. Identifizieren Sie die größte resultierende endgültige Volumen, zB wenn 20 ml Probe mit maximal 2 ml Flockungsmittel Stammlösung gemischt wird diese 22 ml sein wird.
    2. Berechnen Volumina Puffer erforderlich , um den gleichen Endvolumen in allen Flockung Aliquots auf dem größten Volumen des Flockungsmittels Lager basierend aufrechtzuerhalten hinzugefügt werden, beispielsweise wenn 0,75 ml Flockungsmittel Lager muß dann 1,25 ml Puffer zu einer Probe hinzugefügt werden , erforderlich , um die zur Aufrechterhaltung letzte Probenvolumen von 22 ml (2.5.1).
    3. Addieren Sie die Volumina von Flockungsmittel Stammlösung für jedes Polymer und Flockung Zustand bis die absoluten Volumina der Stammlösung zu berechnen, die für die DoE erforderlich sind.
  6. Ernte-Tabakblätter und Vorbereiten der Extrakt.
    1. Entfernen Sie die Top-Sechs leaves (oder so viele wie möglich in den Verfahrensanweisungen angegeben) aus Tabakpflanzen eines geeigneten Alter, zB 6 Wochen alt, und die Übertragung auf eine geeignete Vorrichtung Extraktion wie einem Homogenisator oder Schneckenpresse.
    2. In drei Volumina Extraktionspuffer pro Gramm Biomasse, zB 300 ml pro 100 g, und Mischung für 8 min.
    3. Bereiten einzelnen Extrakte mit den geeigneten Puffern, wenn unterschiedliche pH und / oder Leitfähigkeit getestet. Hier handelt es sich dabei um das Pflanzenmaterial Homogenisieren 3 x 30 sec in einem Mixer oder einem Entsafter 34.
    4. Alternativ bereiten den Extrakt in einer Weise, die repräsentativ für die Verfahren untersucht wird.
  7. Aliquot der Extrakt und Fügen Sie den Puffer.
    1. Manuell und gründlich verrühren, den Extrakt während des gesamten Verfahrens die Proben sind homogen mit einer gleichmäßigen Verteilung der Partikel zu gewährleisten.
    2. Gerade verteilen den Extrakt unter den voretikettierten Reaktionsröhrchen dekantiert,hier 20 ml in jedem Gefäß. Selbst stehende 50-ml-Röhrchen Handhabung vereinfachen und sind ideal für 20-ml-Proben.
    3. Füge das Volumen jeder Extraktionspuffer erforderlich, um die Fest Endvolumen für jede einzelne Reaktionsröhre aufrechtzuerhalten einer geeigneten Pipette.

3. ausflocken die Pflanzenextrakte mit verschiedenen Polymeren

  1. Pipette, um die benötigte Menge an Flockungsmittel Stammlösung, hier 0,1-2,0 ml, auf die Proben der Reihe nach, wie durch die randomisierten Lauf Reihenfolge der DoE angezeigt. Gründlich mischen jede Probe unmittelbar nach der Zugabe von Flockungsmittel durch intensive Anleitung genau 20 Sekunden schütteln.
    1. Bei Bedarf anpassen für andere Einsatzmaterialien, die Rüttelzeit Durchmischung zu gewährleisten, sondern streng konsequente Mischzeiten für alle Proben zu gewährleisten. Beachten Sie, dass das Mischen verlängert kann die irreversible Zerstörung der Flocken verursachen und inkonsequent ausgeübte Kraft während des Schüttelns verzerren können die Flockung Ergebnisse.
  2. Optional: das Verfahren Modify oben für die gleichzeitige Anwendung von zwei oder mehr Flockungsmittel beschrieben.
    1. Option 1: Anstelle eines einzigen Polymer eine Mischung aus zwei oder mehreren Flockungsmitteln hinzuzufügen, hier PEI und Chitosan. Verwenden Sie die Flockungsmittel Kombinationen in der DoE definiert. Integrieren Sie das Verhältnis und absoluten Konzentrationen der Polymere als einzelne Parameter während des DoE-Setup (1.1).
    2. Option 2: Hinzufügen von zwei oder mehr Polymeren sequentiell zu dem Extrakt.
      1. Verwenden, um die einzelnen Polymerkonzentrationen, ist ihre Art und die Inkubationszeit zwischen jeder Zugabe zu dem Extrakt, als zusätzliche Faktoren während der SVM-Setup.
      2. Auch diesen Ansatz verwenden, um zu testen, ob die wiederholte Zugabe eines einzelnen Polymer Flockung verbessern können. Verwenden , um eine schrittweise Zugabe der langsamen Zugabe eines Flockungsmittels zu simulieren, beispielsweise vier Stufen, wobei jede Zugabe von 0,25 ml 80 g L -1 Flockungsmittel Lager auf ein 20 ml Volumen über 4 min kann die Zugabe von Flockungsmittel imitieren miteine Durchflussrate von 0,25 ml min -1.
      3. In allen Fällen, indem die maximale Lautstärke aller Flockungsmittel zum Probenvolumen, hier noch 22 ml, und neu berechnen die erforderlichen Mengen an Flockungsmittel Stammlösungen und Puffer zur Steigerung des Volumens, wenn notwendig, eine neue maximale endgültige Probenvolumen für diese Einrichtung zu identifizieren.
  3. Inkubieren der Proben für die Zeiten, in der DoE definiert, typischerweise 3-30 min, Flockenbildung zu ermöglichen. Stellen Sie sicher , dass alle anderen Inkubationsbedingungen, zB Temperatur, werden entsprechend dem DoE.
  4. Bitte beachten und Dokument Flockenbildung. Notieren Sie sich den Fortschritt der Flockenbildung bei Bedarf, zB als mm von Flocke pro min Absetzen durch die Höhe der abgesetzten Feststoffe zu messen. Bei Bedarf verlängern Flockung für einen längeren Zeitraum, wie beispielsweise über Nacht.
  5. Filtern des ausgeflockten Extrakt.
    1. Verwenden Sie die Filtermaterialien früher hergestellt (2.3) des ausgeflockten Extrakt nach der entsprechenden zu klärenInkubationszeit durch die ausgeflockten Proben durch das Filtermaterial und in ein sauberes Gefäß oder Reaktionsröhrchen dekantiert.
      1. Sie nicht erneut zu suspendieren die abgesetzten Flocken vor der Filtration und Anwendung des Extraktes mit mit einer Rate von ~ 300 ml min -1 auf den Filter, entsprechend 3-4 sec für eine 20 ml Probe.
      2. Bestätigen Sie die Leistung des Filtrationsschritt , wenn ein anderes Material in den Benchtop-Experimente verwendet wird , im Vergleich zum letzten Prozess in Bezug auf die Partikelretention, zB durch die Partikelgrößenverteilung in den beiden Probentypen 11 zu messen.
    2. Analysieren des Filtrats in Bezug auf Trübung und / oder Korngrößenverteilung je nach Bedarf mit geeigneten Vorrichtungen, beispielsweise einem Turbidimeter.
    3. Optional: wiederholen Sie die Analyse nach längeren Inkubationszeiten, zB 12-24 h, die Bildung oder Neubildung von instabilen Flocken zu untersuchen.
  6. Analysieren Sie die Proben im Hinblick auf die PrE-definierten Antworten (1.1.3).
    1. Nehmen Sie Proben aus den Filtraten und analysieren sie für zusätzliche Reaktionsparameter, wie zB die Konzentrationen verschiedener Zielproteine ​​oder wertvolle Produkte.
    2. Optional: Analysieren Sie den Rückstand (meist Feststoffe) für die gleichen Parameter, die die Massenbilanz des Verfahrens zu schließen. Insbesondere quantifizieren die Wirkung von Flockungsmitteln auf Flüssigkeitsrückgewinnung durch die Feststoffe zu vergleichen Masse zurückbleibt, nachdem Proben behandelt werden oder nicht mit Flockungsmittel behandelt.
  7. Bestätigen Sie die Datenqualität und übertragen die Ergebnisse an die DoE-Software.
    1. Geben Sie für extreme Werte in den gesammelten Antwortdaten, zB unerwartet hohe Werte.
    2. Stellen Sie sicher, dass alle Antwortdaten korrekt mit den entsprechenden experimentellen Bedingungen ausgerichtet sind.
    3. Übertragen Sie die Ergebnisse in die DoE-Software und stellen Sie sicher, dass die Standard-und randomisierten Lauf Aufträge nicht vertauscht werden.

4. Bewerten Siedie DoE

  1. Verwenden Sie die integrierten Datenanalysetools der DoE - Software ein Vorhersagemodell zu entwickeln , wie zuvor 20 beschrieben.
    1. Wählen Sie einen geeigneten Datentransformationsmodus bei Bedarf Modellbildung zu erleichtern, melden Sie sich hier 10. Ein Verhältnis von mehr als 10 für größte vs. kleinste Antwortwert zeigt an, dass eine Datenumwandlung erforderlich. Identifizieren Sie die am besten geeignete Transformation die entsprechenden statistischen Werkzeugen, zB einer Box-Cox Plot 35.
    2. Wählen Sie ein Basismodell , das (i) an die ausgewählte DoE passt (1.2) und (ii) stimmt mit Vorkenntnissen über das untersuchte System basiert auf der Analyse der Varianz (ANOVA) Werkzeuge der DoE - Software, zB ein Polynom zweiter Ordnung oft passt besser zu den beobachteten Effekt der Inkubationszeit als ein Polynom erster Ordnung.
    3. Entfernen unbedeutende Modell Faktoren, zum Beispiel p> 0,05, oder Faktor Wechselwirkungen iterativ durch sie Abwahl derreby Verringerung der Komplexität des Modells und seiner Aussagekraft zu erhöhen.
    4. Bestätigen Sie die Modellqualität durch R Vergleich 2, eingestellt R 2 und sagte voraus , R 2 zusammen mit dem normalen Wahrscheinlichkeitsdiagramm der studentisierten Residuen Residuen-vs-run, vorhergesagt-vs-Ist - und Box-Cox - Plots 36. Alle R 2 Werte sollten innerhalb eines 0,2 - Bereich liegen.
    5. Stellen Sie sicher , dass das endgültige Modell stimmt mit den grundlegenden Annahmen der Physik und Thermodynamik, zB keine negativen Konzentrationen vorhergesagt werden.
  2. Verwenden Sie die Modellbedingungen vorherzusagen, die am günstigsten sind für das untersuchte System, hier eine geringe Trübung.
    1. Wählen Sie die wichtigsten Antworten und deren bevorzugte Zustände, zB minimale Trübung. Kombinieren Sie diese Auswahl durch eine Wünschbarkeit Funktion oder ähnliche Werkzeuge zu maximieren, die eingebaut sind Merkmale von mehreren DoE - Software - Pakete 36.
    2. In Abhängigkeit von der beabsichtigten Anwendung of Modell läuft Bestätigung wählen die optimalen Bedingungen und / oder die Vorhersagekraft des Modells im Allgemeinen, zum Beispiel , wenn die Bedingungen zu überprüfen , vorhergesagt am günstigsten zu sein waren sie nicht Teil der ursprünglichen DoE wählen als Follow-up - Experimente.

5. Verbesserung des Modells und Überprüfen Sie die Vorhersagekraft

  1. Verfeinern Sie den ursprünglichen Design - Raum zu den begehrenswertesten Betriebsbedingungen, zB niedrige Trübung in der 0-1.000 nephelometrischen Trübungseinheiten (NTU) Bereich auf der Basis der Modellprognosen (4.2).
  2. Richten Sie eine neue DoE innerhalb dieser Bereiche, darunter nur jene Faktoren, die als wesentliche oder relevant identifiziert wurden (4.1.2)).
    HINWEIS: Ein Faktor kann für einen Prozess in Bezug auf die Modellanalyse aber irrelevant signifikant sein, dh seine Wirkung auf eine Antwort ist <1% der von anderen Faktoren verglichen.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 5,2, bis die Qualität der Modellvorhersagen der requiremen Spielets, beispielsweise die Standardabweichung des Modells , wie durch die Software angegeben ist für die beabsichtigte Anwendung ausreichend. Ändern Sie die experimentelle Strategie , wenn für diese Iterationen erforderlich sind , zB verwenden nur ein Flockungsmittel in der Verfeinerung.
  4. Übertragen und die Ergebnisse aus der Scale-down-Modell in den Pilotmaßstab oder endgültige Produktionsmaßstab bestätigen.

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Representative Results

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Flockung von Tabakextrakt mit verschiedenen Polymeren

Das oben beschriebene Verfahren wurde erfolgreich ein Verfahren zu entwickeln für die Ausflockung von Tabakextrakte bei der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers (der HIV-neutralisierenden Antikörper 2G12) und ein fluoreszierendes Protein (DsRed) (Abbildung 1) 16 verwendet und ist seit übertragen auf andere Proteine ​​einschließlich Lektine, Malaria-Impfstoffkandidaten und Fusionsproteine ​​(nicht veröffentlichte Daten). Typischerweise reduziert die Anwendung von Flockungsmitteln die Trübung des Beutels filterten Pflanzenextrakt aus ~ 6000 NTU (10.000 NTU nach der Extraktion) bis ~ 1000 NTU. In einem ersten Screening - Experiment wurde eine 91-Run IV-optimales Design verwendet wurde , 18 verschiedene Polymere , die in drei verschiedenen Konzentrationen getestet (da dieser Faktor Flockung Effizienz 13,27 beeinflusst) und beobachtet Flockung über eine ~ 12 - stündiger Inkubation period (2A und B). Die lange Inkubationszeit kann wichtig sein, um sinnvolle Zeitrahmen für die Flockung zu identifizieren. Auch pH - Werten von 4-8 wurden getestet , da diese in Zukunft Prozesse relevant sein können aufgrund der Eigenschaften spezifischer Zielproteine ​​13,25,27,37. Unter den 18 getesteten Polymere wurden sechs gefunden Extrakt Trübung nach Filtration Tasche in typischen Extrakte mit einer Leitfähigkeit von 25 mS cm -1 zu reduzieren.

Das Modell durch Ausschluss aller unwirksame Polymere in zwei Iterationen verfeinert wurde und dann mit zusätzlichen Prozessparameter, wie beispielsweise Leitfähigkeit in den 15-45 mS cm -1 Bereich einer Inkubationszeit von 5-75 min und Temperaturen von 4-30 ° C, Modelle geeignet für einen breiteren Bereich von Verfahrensbedingungen zu erzeugen. Die Vorhersagekraft des Modells nach jeder Iteration erhöht, was zu einem sehr zuverlässiges Modell (3A). >

Nach vier Iterationen wurde das hochgeladene kationische und verzweigtes Polymer PEI gefunden am effizientesten für die Aggregation der dispergierten Teilchen in Tabakextrakte sein. Allerdings verringerte sich die Effizienz dieses Polymers mit zunehmender Extrakt Leitfähigkeit. Die Eigenschaften Molekülgröße, Ladung, Struktur (verzweigt oder linear), Ladungsdichte und dem Grad der Aminsubstitution (primäre, sekundäre, tertiäre oder quaternäre) wurden als Faktoren in einem DoE und die letzten beiden Parameter getestet hatte die größte Wirkung. Die Details wurden an anderer Stelle 16 berichtet. Basierend auf diesem Wissen von Polymereigenschaften von den DoE Ergebnisse, fünf andere Polymere wurden mit molekularen Eigenschaften ähnlich wie PEI (Ladungsdichte> meq g -1 und quartären Amin) ausgewählt. Eine dieser fünf Polymere zeigten höhere Flockung Wirkungsgrad bei höheren Leitfähigkeiten (3B) 11.

nt. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Im Rahmen des Ansatzes DoE, wurde bestätigt, dass keiner der PEIs Produktgewinnung unter allen getesteten Bedingungen beeinflusst Tat die Kapazität der Tiefenfilter verwendet anschließend restlichen dispergierten Feststoffe zu entfernen um den Faktor 3,2 bis 5,7 erhöht und erreichte ~ 110 L m -2 je nach Filtertyp. Diese Ergebnisse wurden auch in einer 100 l - Pilotmaßstab Prozess bestätigt, in dem der Antrag von Flockungsmitteln die Klärung reduziert -related Produktionskosten von> 50% und die gesamten Produktionskosten um ca. 20%.

Figur 2
Abbildung 2: Effizienz verschiedener Flockungsmittel unter verschiedenen Prozessbedingungen (A). Auszug Proben direkt nach der Flockung und Filtration Beutel kann immer noch trübe erscheinen. (B) Nach mehrstündigem Absetzen wird die Trübung dergleichen Proben deutlich reduziert werden kann. Doch unmittelbar erhaltenen Trübungswerte nach der Filtration sind oft bevorzugt, da erweiterte Haltezeiten nicht möglich sein kann, in großem Maßstab Fertigungsprozesse. (C) Flockung ebenfalls wirksam ist , wenn sie Pflanzenextrakte erzeugt mit einer Schneckenpresse anstelle eines Mischers angelegt , wie durch die klare rote Flüssigkeit am Boden der 50 - ml - Röhrchen angedeutet (die rote Farbe ist aufgrund der Anwesenheit des fluoreszierenden Proteins DsRed ). (D) Mischungen verschiedener Flockungsmittel können auch Flockung zu induzieren.

Figur 3
Abbildung 3:. Die Modellierung Flockung ein DOE - Ansatz (A) Die Genauigkeit der Modellvorhersagen , wie die Anzahl von Polymeren im Modell erhöht wurde von der anfänglichen Screening reduziert sogar Verfeinerung obwohl die Anzahl der Prozessparameter von t erhöhtwo auf fünf. (B) Umschalten der Polymertyp (hier von einem PEI zu einem anderen) als Folge einer Änderung der Prozessparameter (hier Leitfähigkeit) unterhält effiziente Partikel Flockung und entsprechende Trübung niedrig Filtrat im Vergleich zu unbehandelten Kontrollextrakt ( durchgezogene rote Linie). Die Fehlerbalken in A und B zeigen die Standardabweichungen der Modellprognosen. Eine gestrichelte rote Linien zeigen die Standardabweichungen der unbehandelten Extrakt (n = 10). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Flockung von Tabakextrakten mit einer Spindelpresse vorbereitet

Die Flockung Ergebnisse wurden auch von Tabak hergestellten Extrakte mit einem Homogenisator zu denen mit einer Schraube-Presse, die weniger verteilte Partikel im Größenbereich mm erzeugt vorbereitet übertragen, sondern mehrPartikel im Größenbereich um. In einem 29-run-IV optimales Design wurde gezeigt , dass PEI für diese Art der Extrakt in einer ähnlichen Konzentrationsbereich wirksam ist , und dass die Rückgewinnung der Zielproteine ​​nicht beeinträchtigt wird (Abbildung 2C). Dies zeigt, dass (i) Flockungsbedingungen für eine Art von Ausgangsmaterial identifiziert wurden, können auf andere Ausgangsmaterialien übertragen zu einem gewissen Grad, zeit bei der Prozessentwicklung zu speichern, und (ii) dass die DoE Strategie, um diese Übertragbarkeit zu bestätigen verwendet werden kann, nicht nur für einzelnen Prozessbedingungen, sondern über den gesamten Design-Raum.

Flockung Experimente mit Flockungsmittel Mischungen

Kombinationen von Flockungsmitteln kann effektiver sein , als einzelne Polymere, zB durch mehrere verbesserte Überbrückung zwischen den Partikeln 12. Daher das oben beschriebene Verfahren angepasst war die Zugabe von zwei Polymeren aufzunehmen (3.2) 26. Drei nicht-synthetische Polymere wurden allein, in Kombination miteinander oder in Kombination mit PEI getestet. Die effizienteste Flockung von Tabakextrakten wurde mit PEI allein erreicht, sondern eine Kombination von PEI und Chitosan oder Polyphosphate kann die Konzentration von PEI erforderlich reduzieren. Darüber hinaus erlaubt die DoE Ansatz uns die effektivsten Polymerkombinationen zu identifizieren , wenn PEI (mit oder ohne Chitosan und Polyphosphate) weggelassen, damit eine optimale Flockung Bedingungen in Prozesse zu definieren , zu helfen , wo PEI mit dem Zielprotein nicht kompatibel ist, zB aufgrund von Ausfällen, wie für βglucuronidase 24,25 berichtet. Darüber hinaus war der DoE der Lage , eine komplexe Design - Raum zu charakterisieren , für die kein mechanistisches Modell (2D) zur Verfügung stand. Mit Hilfe der ANOVA - Tools der DoE - Software war es möglich , zwischen zuverlässige Vorhersagemodelle und schlecht bewertet Pendants (Abbildung 4) zu unterscheiden.

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Discussion

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Der wichtigste Aspekt zu berücksichtigen , wenn eine DoE Einrichtung Partikel Flockung zu charakterisieren , ist , dass das Design grundsätzlich in der Lage sein müssen , um die zu erwartenden oder möglichen Auswirkungen 36,38, zB der Einfluss von pH - Wert, Polymertyp und Polymerkonzentration 16 erfassen und zu beschreiben. Daher ist es wichtig, den Anteil des Bauraums (FDS) vor Beginn der eigentlichen Experimente zu bewerten. Die FDS ist der Anteil des mehrdimensionalen Versuchsraum (abgedeckt durch die Konstruktionsfaktoren, wie zB pH) , innerhalb dessen es möglich ist , vordefinierte Unterschiede zwischen zwei experimentellen Ergebnissen ein System bekannter Variabilität gegeben zu erfassen, beispielsweise eine Differenz in der Trübung von 250 Erfassungs NTU eine Variabilität von 125 NTU gegeben. Die FDS kann durch Vermehrung der Konstruktion mit zusätzlichen Abfahrten erhöht werden und sollte für Entwürfe gedacht zu führen Prozesssteuerung 36 ≥0.95 werden. Wenn darüber hinaus die Anzahl der Durchläufe nicht zulässt ter gesamte Experiment in einem einzigen Tag durchgeführt werden, sollte Blöcke im DoE vordefiniert werden, um einen Anteil von Charge zu Charge und von Tag zu Tag Variabilität. Jeweils normiert auf ihren entsprechenden Referenzfahrt , wenn sie mit Pflanzenmaterial arbeitet, läuft die Aufnahme der Bezugnahme in jedem Block (beispielsweise nicht-behandelten Kontrollen) trägt dazu bei , Variabilität zu kompensieren , wird der Vergleich von Daten aus mehreren Durchläufen möglich ist . In diesem Zusammenhang ist die Anzahl der Wiederholungsläufe in der DoE Erhöhung ebenfalls nützlich.

Wenn eine große Zahl von Polymeren abgeschirmt werden, ist es ratsam , die individuellen Eigenschaften des Flockungsmittel, zB Ladungsdichte und Molekularmasse, als diskrete numerische Faktoren eher als die Polymere selbst als kategorische Faktoren zu verwenden. Dies reduziert die Anzahl von Experimenten, weil experimentelle Designs oft für kategoriale Faktoren repliziert werden müssen, während zusätzliche Ebenen von numerischen Faktoren nur eine kleine Anzahl von zusätzlichen Durchläufe benötigen. Die Informationen conZelt des Experiments erhöht sich auch und ermöglicht die Identifizierung von Polymereigenschaften , die Flockung zu verbessern, beispielsweise eine hohe Ladungsdichte , wie hier in den Experimenten gefunden. CCD und RSM experimentellen Designs sind nützliche Modelle mit hoher Vorhersagekraft zu schaffen, die Identifizierung von robusten Verarbeitungsbedingungen ermöglicht (zB zur Führung Prozesskontrolle) und werden in der Regel zu folgen Screening - Designs verwendet. Wenn die Anzahl von Faktoren und Faktoren Ebenen unter Untersuchungsergebnisse in Doe mit mehr als 400 einzelnen Experimenten, kann es sinnvoll sein, die Anzahl von Faktorstufen zu reduzieren oder auf andere Konstruktionstypen wechseln, weil die Anzahl der Proben, die leicht mit der Technik gehandhabt werden kann präsentiert hier wird auf ~ 100 pro Tag begrenzt.

Aus experimenteller Sicht müssen Polymere stabil unter den gewählten Versuchsbedingungen bleiben, dh sie nicht bei niedrigen pH - Depolymerisation müssen. Eine sorgfältige Vorbereitung des FlockungsmittelsBestände in Bezug auf die Konzentration ist auch reproduzierbare Ergebnisse und qualitativ hochwertige Modelle zu erhalten, die notwendig. In diesem Zusammenhang müssen das Flockungsmittel vorbehandelt werden, beispielsweise mal oder pH - Einstellung für Chitin Quellung vollständige Solubilisierung zu gewährleisten, und damit eine homogene Lösung zu erhalten. Hochviskose Bestände sollten vermieden werden, da diese Pipettierfehler verursachen kann, wenn zu dem Extrakt, das Polymer zu übertragen. Viele Polymere können eine starke Pufferwirkung haben und die Bestände haben extreme pH - Werte, zB pH ~ 9,5 für 8% [w / v] PEI. Dies kann den pH-Wert des Extrakts beeinträchtigen, wenn die Bestände nicht voreingestellt und werden die experimentellen Ergebnisse verzerren. Zum Beispiel, wenn Flockung effektiver bei hohen pH-Wert und einem nicht-pH-Wert eingestellt PEI Lager verwendet wird, dann könnte ein DoE legen nahe, dass hohe Konzentrationen PEI mehr wirksam sind. Allerdings wird dieser Effekt durch den höheren pH - Wert durch das größere Volumen der Lager verursacht verursacht werden , die hinzugefügt wurde, nicht durch die erhöhten Polymerkonzentration per se. Die Aktien Konzentrationen verwendet werden, sollten auch diejenigen, die in großen Anwendungen ähneln unterschiedlichen Verdünnungseffekte zwischen den Skalen zu vermeiden, dass die Partikelkonzentration und damit Flockung beeinflussen können. Einige Tonbasis Flockungsmittel wie Kaolin enthalten eine große Anzahl von feinen Teilchen selbst , die die Ausflockung Wirkung maskieren kann, beispielsweise Trübungen Reduktion nach der anfänglichen Filtration und andere Reaktionen sollte die Wirksamkeit dieser Stoffe, beispielsweise nachgeschaltete Filterkapazität zu bewerten , ausgewählt werden.

Für die Datenanalyse ist es wichtig , können die gesammelten Ergebnisse in Bezug auf extreme Werte, Versätze und allgemeine Konsistenz, zB Extremwerte eine Copy-Paste - Fehler, eine Verschiebung der Dezimalstelle oder eine Fehlfunktion der Geräte / Analysegeräte zeigen zu bewerten. Eine gründliche Analyse wird sichergestellt, dass nur qualitativ hochwertige Daten für die Modellerstellung verwendet werden. Während Modellbildung ist es wichtig, th ständig beurteilene breite Palette von Qualitätsindikatoren durch die DoE-Software zur Verfügung gestellt. Die grundlegenden Kriterien sind die R 2, eingestellt R 2 und sagte voraus , R 2 Werte, aber normal Residuen Residuen-vs-Lauf und Ist-vs-vorhergesagten Grundstücke (Abbildung 4) sind sogar noch wichtiger , weil sie Informationen über die einzelnen Lauf bieten in ein Experiment eher als ein Summenparameter. Darüber hinaus sollte die Kohärenz des endgültigen Modell und deren Vorhersagen mit den bekannten Mechanismen der Flockung immer untersucht werden. Große Abweichungen zwischen Vorhersage und wissenschaftlichen Erwartungen auftreten können , weil DoE Modelle nur beschreibend sind und nicht mechanistisch, zB Modelle an den Rändern eines Bauraums Extremwerte vorhersagen kann die Verwendung von Polynomanpassungen Algorithmen widerspiegelt.

Abbildung 4
Abbildung 4:. Qualitätsindikatoren von DoE Modelle keinermal Grundstück von studentisierten Residuen sollte eine gerade Linie so nah wie möglich (A) mit nur geringen Abweichungen (grüne Pfeile) akzeptabel für hochwertige Modelle ähneln. Eine gekrümmte Erscheinung (C) mit starken Abweichungen (rote Pfeile) von der Ideallinie (rot) zeigt ein schlechtes Modell, zB durch wichtige Faktoren fehlen. Letztlich sollte die vorhergesagte und experimentelle (Ist-) Werte übereinstimmen (B) und erneut einer geraden Linie folgen. Abweichungen von der Ideallinie (roter Kreis und gestrichelte Linie) deuten auf eine schlechte Modellvorhersagen (D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die DoE-Ansatz kann helfen, Flockung bei komplexen Ausgangsmaterialien wie Pflanzenextrakte zu charakterisieren, auch wenn es keine vorhandenen Daten. Die Flockung von Tabakextrakten wurde mit einer Arbeitsbelastung von 2 haben wir optimierteks und Verbrauchskosten von ~ 500 €. Dies reduziert die Anzahl der Tiefenfilter für einen einzelnen Pilotmaßstab Charge erforderlich Beteiligung ~ 800 l Pflanzenextrakt um 60%, was eine entsprechende Reduzierung der Verbrauchskosten erreicht.

Die Flockungsmittel wurden auch verschiedene Pflanzenextrakte und Zellkultur-Homogenate angewendet. Obwohl das gleiche Flockungsmittel für alle diese Ausgangsmaterialien wirksam war, hatte die Polymerkonzentration so eingestellt werden, um die verschiedenen Konzentrationen von dispergierten Teilchen aufzunehmen. Zusätzlich , wenn ein wirksames Polymer identifiziert worden ist , die Filtration und / oder Zentrifugation Schritte müssen möglicherweise angepasst werden , 11 , um die unterschiedliche Partikelgrößenverteilung zu entsprechen.

Das hier beschriebene Verfahren kann leicht an andere Ausgangsmaterialien angepasst werden und ist damit auch relevant für Wissenschaftler und Ingenieure entwickeln Verdeutlichungsstrategien für Säugetierzellkulturen und Lebens- / Futtermittelproduktionsprozesse. Especially pflanzlicher Basis Prozesse werden von den Zwischenprobenvolumina profitieren hier vorgeschlagenen weil Pflanzenextrakte Teilchen bis zu 1 mm im Durchmesser enthalten kann , die mit Formaten 21 Mikroplatte nicht kompatibel sind, beispielsweise weil die Mischdynamik aufgrund eines Teilchendurchmessers zu Behälterdurchmesser - Verhältnis unterscheiden , dass ist nicht von der Prozessmaßstab repräsentativ.

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Disclosures

Der Autor hat keinerlei Interessenkonflikte offen zu legen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100P Portable Turbidimeter Hach 4650000 Turbidimeter
2G12 antibody Polymun AB002 Reference antibody
Biacore T200 GE Healthcare 28-9750-01 SPR device
BP-410 Furh 2632410001 Bag filter
Catiofast VSH BASF 79002360 Flocculating agent
Centrifuge 5415D Eppendorf 5424 000.410 Centrifuge
Centrifuge tube 15 ml Labomedic 2017106 Reaction tube
Centrifuge tube 50 ml self-standing Labomedic 1110504 Reaction tube
Chitosan Carl Roth GmbH 5375.1 Flocculating agent
Design-Expert(R) 8 Stat-Ease, Inc. n.a. DoE software
Disodium phosphate Carl Roth GmbH  4984.3  Media component
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Forma -86C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
HEPES Carl Roth GmbH 9105.3 Media component
K700P 60D Pall 5302305 Depth filter layer
KS50P 60D Pall B12486 Depth filter layer
Miracloth Labomedic 475855-1R Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS WTW WTW_2020 pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Phytotron Ilka Zell n.a. For plant cultivation
Polymin P BASF 79002360 Flocculating agent
POLYTRON PT 6100 D Kinematica 11010110 Homogenization device with custom blade tool
Protein A Life technologies 10-1006 Antibody binding protein
Sodium chloride Carl Roth GmbH P029.2 Media component
Synergy HT BioTek SIAFRT Fluorescence plate reader
TRIS Carl Roth GmbH 4855.3 Media component
Tween-20 Carl Roth GmbH 9127.3 Media component
VelaPad 60 Pall VP60G03KNH4 Filter housing
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 DLS particle size distribution measurement

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References

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Vorgehensweise Um die Effizienz von Flockungsmittel für die Beseitigung von Dispersed Partikel aus Pflanzenextrakten zur Bewertung
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Buyel, J. F. Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts. J. Vis. Exp. (110), e53940, doi:10.3791/53940 (2016).More

Buyel, J. F. Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts. J. Vis. Exp. (110), e53940, doi:10.3791/53940 (2016).

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