The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
Les plantes sont largement utilisées pour produire des produits alimentaires tels que les jus de fruits, mais ils peuvent aussi être développés comme des plates – formes pour la fabrication de plus forte valeur ajoutée des produits biopharmaceutiques 1-3. Dans les deux cas, le traitement en aval (DSP) commence souvent par l'extraction de liquides à partir de tissus tels que les feuilles ou les fruits, suivie par la clarification des extraits chargés de particules de 4,5. Pour la fabrication de produits biopharmaceutiques, les coûts de DSP peuvent représenter jusqu'à 80% des coûts de production globaux 6,7 et cela reflète en partie la forte charge des particules présentes dans des extraits préparés par des méthodes perturbatrices telles que l' homogénéisation à base de lame 8,9 . Bien que la sélection rationnelle des couches de filtre pour correspondre à la distribution des tailles de particules dans l'extrait peut augmenter la capacité de filtrage et de réduire les coûts 10,11, l'amélioration ne peut jamais dépasser la limite de capacité absolue définie par le nombre de particules qui doivent être retenues parunité de surface de filtre pour obtenir des éclaircissements.
Le plafond peut être levée si moins de particules atteignent la surface des meilleurs filtres dans le train de filtration, et ceci peut être réalisé que si les particules dispersées sont mélangées avec des polymères connus comme agents floculants qui favorisent l' agrégation pour former de grands floculats 12. Ces flocs peuvent être conservés plus en amont par des filtres grossiers et moins coûteux sac, ce qui réduit la charge de particules atteignant la plus fine et les filtres de profondeur plus chers. Les polymères doivent avoir des profils de sécurité adaptés à leurs applications, par exemple pour les produits biopharmaceutiques , ils doivent être conformes aux bonnes pratiques de fabrication (BPF), et généralement , ils doivent avoir une masse molaire> 100 kDa et peut être soit neutre ou chargé 13. Considérant que floculants neutres agissent généralement par réticulation des particules dispersées provoquant leur agrégation et la formation de flocs avec des diamètres> 1 mm 11, des polymères chargés de neutraliser la charge de dparticules ispersed, réduisant leur solubilité et provoquant ainsi la précipitation 14.
La floculation peut être améliorée en ajustant des paramètres tels que le pH du tampon ou de la conductivité et du type de polymère ou de concentration, en fonction des propriétés de l'extrait 15,16. Pour les extraits de tabac prétraités avec 0,5-5,0 g L -1 polyéthylènimine (PEI), une augmentation de plus de 2 fois la capacité de filtration en profondeur a été rapporté dans un processus à l' échelle pilote 100-L. Le coût de ce polymère est inférieure à 10 € kg -1 de sorte que son introduction dans le processus ont entraîné des économies de coûts d'environ € 6.000 pour les filtres et consommables par lot 16 ou encore plus lorsqu'il est combiné avec base de cellulose filtre aides 17. Même ainsi, les modèles prédictifs sont nécessaires pour évaluer les a priori des avantages économiques de floculants parce que leur inclusion peut nécessiter des étapes de maintien de 15-30 min 16,18, ce qui entraîne des coûts supplémentaires d'investissement pour le stockageles chars. Cependant, il n'y a pas de modèles mécanistes disponibles qui peuvent prédire les résultats de ces expériences en raison de la nature complexe de la floculation. Par conséquent, une expérience de conception de-plus appropriés (DoE) approche 19 a été développé comme décrit dans cet article. Un protocole pour la procédure générale DoE a récemment été publiée 20.
Dispositifs à petite échelle sont maintenant disponibles pour le criblage à haut débit des conditions de floculation 21. Toutefois, ces dispositifs ne peuvent pas simuler de façon réaliste les conditions au cours de la floculation des extraits de plantes, car les dimensions du récipient de réaction (~ 7 mm pour les puits sur une plaque à 96 puits) et les particules ou flocs peuvent être inférieur à un ordre de grandeur d'intervalle. Cela peut affecter le mélange des modèles et donc la puissance prédictive du modèle. En outre, il peut être difficile de réduire les processus impliquant la précipitation en raison de changements non linéaires dans la conduite de mélange et le précipité stabilité 22. Par conséquent, cet article décrit un système de criblage paillasse échelle avec un débit de 50-75 échantillons par jour, ce qui donne des résultats qui sont évolutives à partir du volume de réaction de 20 ml initiale à un processus à l'échelle pilote 100 L 16. Lorsqu'il est combiné avec une approche DoE, ce qui permet aux modèles prédictifs pour être utilisés pour l'optimisation des processus et de la documentation dans le cadre d'un concept de qualité par la conception.
La méthode décrite ci – dessous peut également être adapté aux produits biopharmaceutiques produites dans des procédés à base de culture cellulaire, où les floculants sont également considérés comme un outil de réduction des coûts 23. Il peut également être utilisé pour modéliser la précipitation des protéines cibles à partir d' un extrait brut dans le cadre d'une stratégie de purification, comme l'a démontré pour la β-glucuronidase produite dans le canola, le maïs et le soja 24,25. Une description détaillée des propriétés de floculant peut se trouver ailleurs 16,26 et il est important de veiller à ce que le polymère concentrations sont soit non toxique ou au- dessous des niveaux nocifs dans le produit final 11.
L'aspect le plus important à considérer lors de la mise en place d' un DoE pour caractériser la floculation des particules est que la conception doit en principe être en mesure de détecter et de décrire les effets prévus ou possibles 36,38, par exemple l'influence du pH, le type de polymère et la concentration de polymère 16. Par conséquent, il est important d'évaluer la fraction de l'espace de conception (FDS) avant de commencer les expériences réelles. Fd…
The authors have nothing to disclose.
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |