The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
צמחים נמצאים בשימוש נרחב כדי לייצר סחורות מזון כגון מיצי פרות, אבל הם יכולים גם להיות מפותחים כמו פלטפורמות לייצור מוצרי הביו-פרמצבטיקה בעלי ערך גבוה יותר 1-3. בשני המקרים, עיבוד במורד הזרם (DSP) לעתים קרובות מתחיל עם החילוץ של נוזלים מרקמות כגון עלים או פירות, ואחריו ההבהרה של תמציות-לאדן החלקיקים 4,5. לייצור תרופות ביולוגיים, העלויות של DSP יכולות להסביר עד 80% מעלויות הייצור הכוללים 6,7 וזאת חלק משקפת את ההווה נטל חלקיקים גבוהים תמציות הוכנו בשיטות משבשות כגון המגון להב מבוסס 8,9 . למרות הבחירה הרציונלית של שכבות מסננות כדי להתאים את התפלגות גודל חלקיקים בתמצית יכולה להגדיל את הקיבולת מסננת ולהפחית עלויות 10,11, השיפור לא יכול לחרוג מתקרת הקיבולת המוחלטת המוגדרת במספר החלקיקים חייבים להישמר לכליחידת שטח מסנן להשיג הבהרה.
התקרה ניתן להרים אם פחות חלקיקים מגיעים לפני השטח של מסנני משובחי הרכבת הסינון, זו יכולה להיות מושגת אם חלקיקים מפוזרים הם מעורבבים עם פולימרים המכונים flocculants המקדמים צבירה להקים flocs הגדול 12. flocs כזה ניתן להיעזר הזרם עוד יותר על ידי מסנני שק גס ופחות יקר, הפחתת הנטל חלקיק שהגיע עדינה ומסננים עומק יקר יותר. חייבים להיות פולימרי פרופילי בטיחות מתאימים ליישומים שלהם, למשל עבור הביופרמצבטיקה הם צריכים להיות תואמים ייצור נאות (GMP), ובדרך כלל הם חייבים להיות מסה טוחנת> 100 kDa והוא יכול גם להיות ניטראלי או טעון 13. בעוד flocculants הניטראלי פועל בדרך כלל על ידי cross-linking חלקיקים מפוזרים גרימת הצבירה שלהם ויצירת flocs בקטרים> 1 מ"מ 11, פולימרים טעונים לנטרל את המטען של דחלקיקי ispersed, הפחתת המסיסות שלהם ובכך גרמו ממטרים 14.
הפתתה ניתן לשפר על ידי התאמת פרמטרים כגון חיץ pH או מוליכות, ואת סוג הפולימר או ריכוז, כדי להתאים את המאפיינים של תמצית 15,16. תמציות טבק pretreated עם 0.5-5.0 גרם ל -1 polyethylenimine (PEI), גדול יותר מאשר גידול פי 2 ב קיבולת עומק מסנן נמסר בתהליך 100-L טייס מידה. עלות פולימר זה פחות מ -10 € קילו -1 כך החדרתו תהליך הביאה לחיסכון בעלויות של כ -6,000 € עבור מסננים מתכלה לכל תצווה 16 או אפילו יותר כאשר הוא משולב עם עזרי מסנן מבוסס תאי 17. אף על פי כן, מודלים חזויים נדרשים להעריך את ההטבות כלכליות אפריורי של flocculants כי הכללה יכול לדרוש צעדי אחיזה של 15-30 דקות 16,18, וכתוצאה מכך עלויות השקעה נוספות לאחסוןטנקים. עם זאת, אין כיום מודלים מכניסטית זמינים שיכול לחזות את התוצאה של ניסויים כאלה בשל האופי המורכב של הפתתה. לכן, מתאים יותר עיצוב של ניסויים (DOE) הגישה 19 פותחה כמתואר במאמר זה. פרוטוקול עבור הליך האיילה הכללי לאחרונה פורסם 20.
מכשירים בקנה מידה קטנה זמינים כעת עבור הקרנת התפוקה הגבוהה של תנאים הפתתה 21. עם זאת, מכשירים אלה לא יכולים לדמות תנאים מציאותיים במהלך הפתתה של תמציות צמחים כי ממד כלי התגובה (~ 7 מ"מ עבור בארות על צלחת 96-היטב) ואת החלקיקים או flocs יכול להיות פחות מ בסדר גודל זה מזה. הדבר עלול להשפיע על ערבוב דפוסים ובכך כוח הניבוי של המודל. יתר על כן, זה יכול להיות קשה כדי להקטין תהליכים מעורבים ממטרים עקב שינויים שאינו ליניארי בהתנהגות ערבוב STA המשקעbility 22. לכן, במאמר זה מתאר מערכת הקרנת ספסל העליונה בקנה מידה עם תפוקה של 50-75 דגימות ליום, מניב תוצאות שאינן מדרגים מכרך התגובה הראשוני 20 מיליליטר לתהליך 100 L טייס מידת 16. בשילוב עם גישת איילה, זה מאפשר מודלים המנבאים לשמש אופטימיזציה תהליך ותיעוד כחלק מושג איכות-ידי עיצוב.
השיטה המתוארת להלן עשויה גם להיות מותאמת ל תרופות ביולוגיות מיוצרות בתא תהליכי התרבות מבוססת, שבו flocculants גם נבחנים ככלי לחיסכון בעלויות 23. זה יכול גם לשמש מודל המשקע של חלבוני היעד מ תמצית גולמית כחלק מאסטרטגית טיהור, כפי שמודגם עבור β-glucuronidase מיוצר קנולה, תירס וסויה 24,25. תיאור מפורט של תכונות flocculant ניתן למצוא במקום אחר 16,26 וזה חשוב לוודא כי concentr הפולימרations הם או רעיל או מתחת לרמות מזיקות במוצר הסופי 11.
ההיבט החשוב ביותר שיש להביא בחשבון בעת הגדרת איילה לאפיין הפתתה חלקיקים הוא שהתכנון חייב עקרונית להיות מסוגל לזהות ולתאר את ההשפעות הצפויות או אפשריות 36,38, למשל השפעת pH, סוג הפולימר וריכוז פולימר 16. לכן, חשוב להעריך את החלק היחסי של מרחב תכנון (FDS) לפני…
The authors have nothing to disclose.
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |