The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
Planter er mye brukt til å produsere mat varer som fruktjuicer, men de kan også utvikles som plattformer for produksjon av høyere verdi biofarmasøytisk produkter 1-3. I begge tilfeller nedstrømsprosessering (DSP) begynner ofte med utvinning av væsker fra vev som blader eller frukter, etterfulgt av rensing av partikkelladede ekstrakter 4,5. For fremstilling av Biopharmaceuticals, kan kostnadene ved DSP utgjøre opptil 80% av de totale produksjonskostnadene 6,7, og dette delvis skyldes den høye partikkelbelastningen til stede i ekstrakter fremstilt av forstyrrende metoder så som blad-baserte homogenisering 8,9 . Selv om rasjonelt valg av filterlag som passer til partikkelstørrelsesfordelingen i ekstraktet kan øke filterkapasiteten og redusere kostnadene 10,11, kan forbedringen aldri overstige taket av absolutt kapasitet definert av antall partikler som må bibeholdes perenhet av filterområdet for å oppnå avklaring.
Taket kan løftes hvis færre partikler nå overflaten av de fineste filtrene i filtrerings toget, og dette kan oppnås hvis dispergerte partikler blandes med polymerer som er kjent som flokkuleringsmidler som fremmer aggregering for å danne store fnokker 12. Slike fnokker kan beholdes lenger oppstrøms av grovere og mindre kostbare posefiltre, redusere partikkelbelastningen nå finere og mer kostbare dybdefiltre. Polymerene skal ha sikkerhetsprofil som passer for sine applikasjoner, for eksempel for Biopharmaceuticals de må være i samsvar med god framstillingspraksis (GMP), og vanligvis de må ha en molekylvekt> 100 kDa og kan enten være nøytral eller belastes 13. Mens nøytrale flocculants generelt opptre ved kryssbinding spredt partikler forårsaker deres aggregering og dannelsen av flokker med diameter> 1 mm 11, ladede polymerer nøytralisere ansvaret for dispersed partikler, noe som reduserer deres løselighet og dermed forårsaker utfelling 14.
Flokkulering kan forbedres ved å justere parametere som buffer pH eller ledningsevne, og polymeren type eller konsentrasjon, for å samsvare med egenskapene til ekstraktet 15,16. For tobakkekstrakter forbehandlet med 0,5-5,0 g L -1 polyetylenimin (PEI), større enn 2 ganger økning i dybdefilter kapasitet ble rapportert i en 100 L pilot-skala prosess. Kostnaden for denne polymer er mindre enn € 10 kg -1 så sin innføring i prosessen resulterte i kostnadsbesparelser på rundt € 6000 for filtre og forbruksvarer per batch 16 eller enda mer når den kombineres med cellulosebasert filter hjelpemidler 17. Likevel er prediktive modeller nødvendig for å evaluere en priori økonomiske fordelene av flokkuleringsmidler fordi deres inkludering kan kreve hold trinn på 15-30 min 16,18, noe som resulterer i ytterligere investeringskostnader for lagringtanker. Men det er ikke mekanistiske modeller som kan forutsi utfallet av slike eksperimenter på grunn av den komplekse natur flokkulering. Derfor ble en mer hensiktsmessig utforming-av-eksperimenter (DoE) tilnærming 19 utviklet som beskrevet i denne artikkelen. En protokoll for den generelle DoE prosedyren har nylig blitt publisert 20.
Småskala enheter er nå tilgjengelig for high-throughput screening av flokkulering forhold 21. Imidlertid kan disse anordninger ikke realistisk å simulere forholdene under flokkulering av plante-ekstrakter fordi dimensjonene på reaksjonsbeholderen (~ 7 mm til brønnene på en 96-brønns plate), og partiklene eller fnokkene kan være mindre enn en størrelsesorden fra hverandre. Dette kan påvirke blande mønstre og dermed prediktiv kraft av modellen. Videre kan det være vanskelig å skalere ned prosesser som involverer utfelling som skyldes ikke-lineære endringer i blande oppførsel og bunnfallet staheten 22. Derfor skisserer denne artikkelen en benk-top-skala screening system med en gjennomstrømning på 50-75 prøver per dag, noe som gir resultater som er skalerbar fra den innledende 20 ml reaksjonsvolum til en 100 L pilot-skala prosess 16. Når det kombineres med en DoE tilnærming, gjør dette at prediktive modeller som skal brukes til prosessoptimalisering og dokumentasjon som en del av en kvalitet-for-designkonsept.
Metoden er beskrevet nedenfor, kan også tilpasses Biopharmaceuticals produsert i cellekultur-baserte prosesser, hvor flokkuleringsmidler også vurderes som et kostnadsbesparende verktøy 23. Den kan også brukes til å modellere utfelling av target-proteiner fra et urent ekstrakt som en del av en rensestrategi, som vist for β-glukuronidase produsert i raps, mais og soyabønner 24,25. En detaljert beskrivelse av flokkuleringsmiddel egenskaper kan finnes andre steder 16,26, og det er viktig å sikre at polymeren konsentrasjonersjoner er enten ikke-toksiske eller skadelige nivåer under i det endelige produkt 11.
Det viktigste å vurdere når du setter opp en DoE å karakterisere partikkel flokkulering er at design skal i prinsippet kunne oppdage og beskrive forventede eller mulige effekter 36,38, f.eks påvirkning av pH, polymertype og polymerkonsentrasjon 16. Derfor er det viktig å evaluere brøkdel av design plass (FDS) før de egentlige eksperimenter. FDS er den brøkdel av det flerdimensjonale eksperimentelle plass (dekket av konstruksjonsfaktorer, for eksempel pH) innenfor hvilken d…
The authors have nothing to disclose.
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |