Summary
Aqui mostramos plaquetas humanas isoladas podem ser usadas como uma acessível ex vivo modelo para estudar adaptações metabólicas em resposta ao inibidor do complexo I rotenona. Esta abordagem emprega rastreio isotópica e quantificação relativa por espectrometria de massa de cromatografia de líquido e pode ser aplicado a uma variedade de modelos de estudo.
Introduction
Metabolismo mitocondrial disfuncional tem sido implicada numa ampla variedade de doenças, incluindo a neurodegeneração, cancro, doenças cardiovasculares e 30. Como tal, um grande esforço foi colocado sobre a caracterização de defeitos metabólicos que contribuem para a patogénese da doença. Espectrometria de massa de cromatografia líquida-tandem (LC-MS / MS) é considerada o padrão-ouro para a quantificação de analitos a partir de matrizes biológicas complexas e muitas vezes é empregada para estudos metabólicos 8. No entanto, como é frequentemente o caso com estudos biomédicos, atingindo um modelo acessível e bem definida relevantes para doenças humanas é um desafio.
Muitos estudos empregam transformado modelos celulares para sondar o impacto de xenobióticos ou anormalidades genéticas no metabolismo celular 7,9. A reprogramação metabólica que ocorre em células cancerosas podem introduzir factores de confusão 21 e, portanto, não são ideais. Estas questões podem ser circumvented com modelos de células primárias, embora a obtenção de biomassa suficiente para análises metabólicas pode ser um desafio. Além disso, o impacto de elevadas quantidades de antibióticos utilizados na cultura tem sido destacado como estudos mitocondriais potencialmente de confusão 16.
Plaquetas humanas dar a oportunidade de utilizar um modelo de célula primária com conteúdo mitocondrial suficiente para estudos metabólicos 5,22,27,32. Em primeiro lugar, as plaquetas podem ser facilmente adquiridos, através de exames de sangue de doadores individuais, ou em grandes volumes de bancos de sangue e, portanto, fornecer um modelo em que fatores externos podem ser facilmente controlado. Em segundo lugar, devido ao seu pequeno tamanho, as plaquetas podem ser facilmente isolados a partir de outros componentes do sangue com o trabalho preparatório mínima em laboratórios mesmo minimamente equipados 5. Digno de nota, as plaquetas não contêm núcleo e pode, portanto, ser usadas para estudar alterações ao metabolismo independentemente da regulação da transcrição. Aqui nós mostramos queAlém de quantificação relativa de tioésteres de acil-coenzima A (CoA), o sistema de plaquetas isoladas podem ser usadas para analisar o metabolismo de carbono. Especificamente, nós relatamos o uso de marcação metabólica com isótopo estável (não radioativo) marcado [13 C 6] -glucose e [13 C 16] -palmitato para sondar incorporação da [13 C] -label para o importante acetil metabólito CoA através da glicólise ou da oxidação de ácidos gordos. Isto proporciona uma plataforma poderosa, generalizável, e versátil devido ao amplo envolvimento de espécies acil-CoA em vias bioquímicas 13,24 ea rastreabilidade deste sistema para testar outras variáveis, tais como a inibição do complexo I com rotenona 3,33. Além das informações fornecidas no protocolo a seguir, uma extensa descrição dos métodos utilizados para a rotulagem isótopo e para as análises baseadas em LC-MS pode ser encontrado em Basu e Blair 4.
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Protocol
Declaração de Ética: Todos os protocolos relativos ao tratamento de amostras humanas seguir as orientações do comitê de ética em pesquisa humana da Universidade da Pensilvânia.
1. Preparação de tampões e soluções de reserva 100X
- Prepare 1 litro de solução tampão de Tyrode de base. Combinar 8,123 g de NaCl, 1,428 g de NaHCO3, 0,466 g de CaCl 2 ∙ 2 H 2 O, 0,224 g de KCl, e 0,095 g de MgCl 2. Ajustar o volume total a 1 L com ddH 2 O. Filtro de esterilizar tampão de base de Tyrode.
- Preparar soluções de concentrado 100X de glicose e de ácido palmítico. Para 100x soluções de glicose, dissolver 100 mg de glicose ou [13 C 6] -glucose em 1 ml de DDH 2 O. Para soluções de palmitato de 100x, dissolve-se 2,56 mg de ácido palmítico ou 2,72 mg de [13 C 16] ácido -palmitic em 1 ml de etanol. Filtro de esterilizar 100x soluções estoque.
- Prepare Buffers é apropriado Enriched Tyrode
- Para os estudos de rotulagem de glicose, adicionar 1 ml de 100x [6 13 C] -glucose solução estoque e 1 ml de 100x solução mãe de ácido palmítico a 98 ml de tampão de Tyrode de base.
- Para os estudos de rotulagem ácido palmítico, adicionar 1 ml de solução de 100x da glucose e 1 ml de [13 C 16] da solução de ácido -palmitic a 98 ml de tampão de Tyrode de base.
- Prepara-se uma solução de estoque 10 mM de rotenona em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Para os estudos de dose-resposta não-marcação, passe para 1.4.3. Para os estudos de rotulagem em uma única dose, prossiga para 1.4.5.
- Efectuar uma diluição em série do stock de rotenona 10 mM em DMSO, para obter soluções com concentrações que variam de rotenona 1 nM a 100 uM. Estes são 100x estoques.
- Adicionar 50 ul de cada unidade de 5 ml de tampão de Tyrode base de glucose + ácido palmítico + a partir de 1.3.1 para preparar soluções com concentrações que variam de rotenona de 10 pM a 1 uM. Alternativamente, adicionar 50 ul de DMSO para servir como um controlo do veículo. Avance para o 2.1.
- Dilui-se a solução de stock 10 mM de 1000 vezes em DMSO para se obter uma solução de trabalho a 10 uM.
- Adicionar 50 ul deste estoque a 5 ml cada de tampão a base de Tyrode + [13 C 6] -glucose + ácido palmítico a partir de 1.3.2 e base de tampão de Tyrode + glucose + [13 C 16] ácido -palmitic de 1.3.3. A concentração final é de 100 nM de rotenona. Alternativamente, adicionar 50 ul de DMSO para cada um dos tampões para servir como controlos de veículo.
2. plaquetas Isolamento
Nota: Este método é passível de plaquetas derivadas quer de sangue total ou a partir de sacos de plaquetas. Os dados de exemplo contidas neste documento foi preparadousando plaquetas derivadas a partir de sacos de plaquetas. Por favor, veja Basu et al. 5 para obter mais detalhes sobre usando plaquetas isoladas de sangue total.
- Isolamento de plaquetas a partir de sangue inteiro
NOTA: Se isolar plaquetas de um saco de plaquetas, prossiga para 2.2.1.- Centrifugar o sangue total a 175 x g durante 15 min sem freios.
- Transferir 1 ml do plasma rico em plaquetas superior (PRP) camada para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Centrifuga-se o PRP a 400 x g durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e prossiga para a etapa 3.1 ou 3.2.
- Isolamento de plaquetas a partir de um saco de plaquetas
- Transferir 1 ml da suspensão de plaquetas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Centrifugar a suspensão a 400 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e prossiga para a etapa 3.1. ou 3.2.
3. executando uma experiência
- Para determinar o efeito de xenobióticostratamento (por exemplo, rotenona) sobre os níveis de um metabolito de interesse (por exemplo, acetil-CoA), proceder à 3.1.1. Para determinar o efeito de um xenobióticos (por exemplo., Rotenona) sobre a incorporação de um precursor metabólico para um metabolito de interesse a jusante, proceder à 3.2.1.
- Usando nada menos do que três repetições biológicas para cada condição, ressuspender pellet de plaquetas a partir do passo 2.1.4 ou 2.2.3 em 1 ml de cada solução do passo 1.4.4.
- Incubar plaquetas ressuspensas em uma incubadora de CO 2 com camisa de água fixada a 95% de humidade, 5% de CO 2 e 37 ° C durante 1 h. Avance para o passo 4.1
Nota: Aqui nós descrevemos um experimento de resposta à dose. Alternativamente, uma experiência ao longo do tempo poderia ser feito, em que a dose foi fixada e a duração da incubação foi variada em vez disso.
- Para determinar o efeito do tratamento de xenobióticos em incorporação de um precursor metabólico para um metabolito de interesse a jusante.
- vocêcantar nada menos que três repetições biológicas para cada condição, ressuspender pellet de plaquetas a partir do passo 2.1.4 ou 2.2.3 em 1 ml de cada formulação do tampão de Tyrode marcado a partir do passo 1.4.6.
- Incubar plaquetas ressuspensas em uma incubadora de CO 2 com camisa de água fixada a 95% de humidade, 5% de CO 2 e 37 ° C durante 1 h. Avance para o passo 4.1.
4. Têmpera e CoA Extração
- Sedimentar plaquetas por centrifugação a 3000 xg durante 3 min.
- Aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender em plaquetas de 750 ul de ácido gelado a 10% tricloroacético (w / v).
- Adicionar padrão interno marcada com isótopo estável apropriado. Por exemplo, se o objectivo é comparar os níveis das espécies CoA entre amostras, utilizar 100 ul de uma mistura de tioésteres de CoA marcados obtidos a partir de levedura tal como descrito anteriormente com isótopo estável (técnica SILEC) 29.
- Pulso-sonicado de cada amostra 30 vezes com impulsos de 0,5 seg.
- Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Apor colunas C18 de extracção em fase sólida (SPE) de tubagem de vácuo.
- Condicionar as colunas com 1 ml de metanol.
- Equilibrar as colunas com 1 ml DDH 2 O.
- Executar sobrenadante derivado de amostra (aproximadamente 850 ul neste caso) através das colunas.
- Lavar as colunas com água 1 ml.
- Carga de 10 ml tubos de centrífuga de vidro para o colector de vácuo para recolher fração de eluição.
- Elui-se as colunas com 1 ml de acetato de amónio 25 mM em metanol.
- eluato seco sob atmosfera de azoto.
- Ressuspender resíduos secos em 50 ul de 5% (w / v) de ácido 5-sulfossalicílico e transferir para frascos de HPLC.
Setup 5. HPLC
- Utilizando o software de controlo para o sistema de HPLC, criar um método de HPLC com as condições optimizadas para os analitos alvo e coluna utilizada, tal como listado na Tabela 1.
Nota: A coluna temperature usado para a geração de dados foi de 25 ° C, mas os parâmetros específicos variará pelo aparelho e no que diz respeito aos compostos de interesse. Para quantificação de acil-CoA, vários métodos de análise de LC-MS foram relatados, e validado para diferentes analitos em diferentes condições de LC 14,19,20. - Permitir que a HPLC para equilibrar de forma adequada.
Nota: Isto deve incluir tanto iniciação de solventes antes de anexar uma coluna e equilibração da coluna nas condições iniciais para o método de solvente. O volume de equilíbrio deve seguir as instruções do fabricante, e de efluentes resultante deve ser desviado para o lixo.
Nota: Consulte Basu e Blair 5 para obter mais detalhes sobre as configurações de HPLC.
Setup 6. Mass Spectrometer
- Utilizando o software de controlo para o espectrómetro de massa, criar um método para uma detecção de formas ionizadas dos compostos de interesse. Os parâmetros são apresentadosna Tabela 2.
Nota: os análogos isótopo estável destes compostos devem ser utilizados para determinar se um modo positivo ou negativo dá sensibilidade superior e para optimizar a fonte óptica e condição para a sua detecção. O tempo total de detecção do método de espectrómetro de massa deverá corresponder ao componente de tempo do método de HPLC associados.
Observação: Como mencionado anteriormente, vários métodos de análise de acil-CoA têm sido relatados, incluindo positivos 14 e negativos de ionização 15 e modos de uso de um espectrómetro de massa de alta resolução 17, em vez de um instrumento triplo quadrupolo 28. - Limpo e calibrar o instrumento, estabelecer uma pulverização estável no espectrómetro, e permitir tempo para a solução de calibração para dissipar de forma adequada a partir da fonte e a óptica de acordo com as instruções do fabricante.
- Configurar uma sequência para todas as amostras com o software de controle espectrômetro de massa. includes do nome ou identificadores numéricos e indicar o método de volume de injeção e instrumento adequado. Efectue um branco antes da primeira amostra, e executar outros espaços em branco e lavagens entre as amostras conforme necessário para mitigar reporte ou matriz efeitos.
Nota: Um método de processamento para a integração de pico dos cromatogramas líquidos "analitos seleccionados muitas vezes pode ser definido dentro desta sequência ou posteriormente aplicado no processamento de dados. - Iniciar a sequência e monitorar o sistema espectrômetro e HPLC em massa periodicamente para problemas, incluindo flutuações de pressão ou falhas do sistema e perda de intensidade do sinal durante a corrida.
Nota: Problemas graves ou falhas de execução persistentes podem exigir parar a corrida e purga e re-equilibrar o sistema HPLC, bem como a limpeza e calibrar o espectrômetro de massa. Consulte Basu e Blair 5 para obter mais detalhes sobre as configurações e dados MS processamento.
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Representative Results
Para demonstrar a utilidade desta metodologia reproduzimos a generalização de adaptação metabólica compensatória descrito anteriormente resultantes da exposição a rotenona. Este achado foi identificado previamente em modelos de cultura de células e esta investigação teve como objetivo testar se essa mudança metabólica também ocorre em plaquetas, que são anuclear e não propenso aos mesmos artefatos experimentais como cultura de células. Este trabalho foi realizado com plaquetas 6 dias de idade a partir da Penn Trauma Center, que tinha sido considerado demasiado velho para perfusão humana, embora eles mantiveram sua atividade metabólica. O isolamento foi realizado como se mostra na Figura 1. O fluxo de trabalho total pode ser dimensionado facilmente a partir de um número limitado de amostras clínicas ou condições experimentais para um maior rendimento com base placa de 96 poços, com a disponibilidade de plaquetas que não são mais úteis para infusão em pacientes.
(Figura 2). Especificamente, temos observado em células SH-SY5Y uma diminuição dependente da dose na succinil-CoA-redutase (IC50 = 25 nM) com um aumento simultâneo na β-hidroxibutiril (HB) -COA (ED 50 = 75 nM), enquanto que os níveis de acetil-CoA ficaram inalterados 1. A nossa análise de plaquetas humanas tratadas com rotenona revelou resultados altamente consistentes (Figura 3). Isto proporciona um conjunto único de dados experimentais em plaquetas humanas que apontam para a dependência mitocondrial da resposta de rotenona. Esta resposta não pode ser mediado através de mecanismos de transcrição convencionais porque as plaquetas não têm núcleos.
A quantificação relativa fornece uma dimensão de informação metabólica, masmarcação isotópica fornece uma visão complementar valiosa sobre a atividade de vias metabólicas específicas. Isto é crítico em estudos metabólicos porque múltiplos caminhos podem convergir através de um único intermediário. Para demonstrar este ponto, as plaquetas foram tratadas com 100 nM de rotenona ou DMSO na presença de ou [13 C 6] -glucose ou [13 C 16] -palmitato durante 1 h. A co-eluição de isotopólogos de acil-CoAs a partir da coluna de LC permite a determinação definitiva da composição isotópica dos analitos (Figura 4). Após correcção para a abundância natural dos isótopos pesados como descrito 11 esta abordagem mostrou uma diminuição significativa da produção glicolítica do acetil-CoA nas plaquetas, enquanto a incorporação de palmitato foi aumentada de forma significativa (Figura 5). Estes resultados são semelhantes aos observados anteriormente no modelo de cultura de células SH-SY5Y 33 e assim fornecem evidências adicionais tchapéu esta via pode ser importante in vivo.
| Tempo (min) | 0 | 0 | 1,5 | 5 | 12 | 17 | 18 | 23 | 25 | 30 |
| Fluxo total (mL / min) | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 250 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| % UMA | 98 | 98 | 98 | 80 | 0 | 0 | 0 | 0 | 98 | 98 |
| % B | 2 | 2 | 2 | 20 | 100 | 100 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| % C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
. Tabela 1. Cromatografia Líquida de Gradiente de Solvente A: 5 mM de acetato de amónio em água, solvente B: 5 mM de acetato de amónio em 95: 5 de ACN / água Solvente C: 80:20 ACN / água a 0,1% de ácido fórmico
| Parâmetro | Valor |
| Spray de Tensão (V) | 4.000 |
| Vaporizador de Temperatura (° C) | 400 |
| Pressão Bainha Gas | 35 |
| Pressão de gás auxiliar | 10 |
| Capilar Temperatura (° C) | 350 |
| Lens tubo Offset (V) | 100 |
Tabela 2. Mass Spectrometer Parameters.
Figura 1. Generalized fluxo de trabalho para preparação de amostras e de análise. Este esquema mostra o fluxo de trabalho para o isolamento de plaquetas e tratamento para estudos metabólicos por análise de LC-MS / MS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Esquema metabólico de glicose e lipídios do metabolismo e da corrente de transporte. Acetil-CoA podem ser sintetizados a partir de glicose ou palmitato. Rotenona inibe o vaivém adequada de electrões mitocondrial por complexo I.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53941/53941fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A determinação quantitativa de CoA-tioésteres em resposta ao tratamento com rotenona. Rotenona não afecta os níveis de acetil-CoA, mas induz uma diminuição dependente da dose da succinil-CoA-redutase (IC50 = 4,1 nM), com um aumento concomitante em βHB-CoA (ED 50 = 4,2 nM). As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM); n = 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Representante Cromatogramas Mostrando isotópica Rotulagem de palmitatoem acetil-CoA. tratamento Rotenone aumenta a incorporação de palmitato em acetil-CoA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Incorporação Relativa de [13 C 6] -glucose ou [13 C 16] -palmitato em tratamento Acetil-CoA. Rotenona diminui a incorporação de glicose em acetil-CoA e aumenta a incorporação de palmitato. As barras de erro representam SEM; n = 4. Os asteriscos denotam p <(teste t não pareado de Student) 0,05. Por favor clique aquipara ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui temos demonstrado a utilidade de plaquetas isoladas como uma plataforma para o estudo do metabolismo mitocondrial perturbado. Especificamente, temos caracterizado adaptação metabólica em resposta à inibição do complexo I por rotenona.
O presente estudo se estendeu resultados reportados anteriormente sobre o papel da inibição do complexo I por rotenona em linhas celulares para plaquetas humanas. Importante, este revelou que a formação de rotenona também inibida de plaquetas succinil-CoA, estimulou um aumento na contagem de plaquetas βHB-CoA e não teve efeito sobre os níveis de plaquetas de acetil-CoA.
Grande cuidado deve ser tomado para assegurar a validade e reprodutibilidade de qualquer análise deste tipo. Se as plaquetas são para ser isolado a partir de sangue total, o isolamento deve proceder exactamente como descrito acima, a fim de evitar a contaminação de linfócitos e a activação de plaquetas, com especial atenção dedicada ao deixar o creme leucocitário contendo os linfócitos Undisturbed. Para as curvas de resposta dose a ser significativa, diluições em série devem ser executadas com precisão, com mistura até à homogeneidade em cada passo. Após a nova suspensão de plaquetas, condições de incubação pode ser modificado a partir dos detalhados acima, mas eles devem ser rigorosamente padronizado em grupos de tratamento para permitir comparações significativas a serem feitas. Talvez o mais importante passo em qualquer análise quantitativa LC / MS-base é a utilização de isótopos estáveis padrões internos marcados.
O uso de padrões internos é fundamental neste cenário porque protege contra potencialmente confusão "efeitos de lote", tais como a eficiência de extração de variáveis e a estabilidade dos analitos através de amostras. A adição de padrão interno, (de novo, a mistura até à homogeneidade) tão cedo quanto possível no protocolo experimental reduz o potencial de artefactos. Finalmente, como em todas as experiências, a utilização de múltiplas réplicas para cada condição experimental é essencial e, se viável, Cálculos de energia com base em experiências-piloto pode ser útil.
As plaquetas podem ser rapidamente isolado a partir de fontes individuais ou agrupados 5,27,32, tornando esta abordagem passíveis de uma ampla gama de aplicações. É importante notar que a capacidade de realizar estudos que envolvem tanto a quantificação relativa e rotulagem isotópica permite uma caracterização mais detalhada de um sistema metabólico. Actualmente, isso exige dois ensaios separados, o que aumenta a procura de biomassa necessária para a experiência. Por esta razão, as plaquetas, os quais podem ser facilmente obtidos em grandes números, são mais eficientes do que outros modelos de cultura de células.
No entanto, apesar das numerosas vantagens conferidas pela utilização de plaquetas, existem desvantagens. Em primeiro lugar, é preciso ter cuidado na seleção de doadores humanos, porque há muitas doenças que afetam a fisiologia de plaquetas 25. Além disso, a activação de plaquetas durante o curso de amostrapreparação e análise é uma variável de confusão potencial em qualquer ensaio baseado em plaquetas. Por estas razões, a avaliação concomitante de marcadores da activação das plaquetas, por ELISA, 26, citometria de fluxo 1, ou ensaios tais como o ensaio de luz agregometria de transmissão (LTA) 34 poderia provar prudente.
Embora o presente estudo centrou-se na análise de tioésteres de acil-CoA, esta abordagem pode ser facilmente expandido para incluir uma gama mais ampla de analitos. Abordagens metabolômica irrelevantes estão fornecendo uma visão mecanicista em uma matriz de estados de doença 23. Aplicação de tais abordagens não segmentados para plaquetas modelos provavelmente irá fornecer esclarecimentos adicionais sobre os mecanismos bioquímicos subjacentes envolvidos no metabolismo celular desregulado.
Esta abordagem pode facilmente ser expandida para incluir investigações de outros produtos químicos ambientais e fármacos conhecidos por interferir com o metabolismo mitocondrial 6,12,18,31, bem como um sistema para testar os efeitos de xenobióticos como potenciais moduladores de metabolismo CoA 10. Além disso, a abordagem geral pode ser utilizada para estudar defeitos metabólicos em doenças genéticas, tais como ataxia de Friedreich, 5,32. Além disso, qualquer um dos modelos experimentais acima mencionados pode ser acoplado com um ensaio de respiração funcional, a fim de caracterizar de forma mais enérgica do estado de mitocôndrias em cada contexto 2. Assim, o acoplamento de isótopos estáveis e análise por LC-MS com estudos metabólicos em plaquetas isoladas é susceptível de proporcionar novas oportunidades para caracterizar melhor o metabolismo mitocondrial aberrante.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio do NIH subvenções P30ES013508 e T32ES019851.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
| 13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| 5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
| Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
| Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
| Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
| Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
| Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
| LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
| Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
| Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
| HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
| Source | Thermo Scientific | HESI II | |
| HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |
References
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