Här visar vi isolerade humana trombocyter kan användas som en tillgänglig ex vivo modell för att studera metaboliska anpassningar som svar på det komplexa I-inhibitor rotenon. Detta tillvägagångssätt utnyttjar isotopisk spårning och relativ kvantifiering genom vätskekromatografi-masspektrometri och kan appliceras på en mängd olika studiedesign.
Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.
Dysfunktionell mitokondriell metabolism har varit inblandad i ett stort antal olika sjukdomar inkluderande neurodegeneration, cancer och hjärt-kärlsjukdom 30. Som sådan har stora ansträngningar lagts på att karakterisera metaboliska defekter som bidrar till sjukdomen patogenes. Vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS / MS) anses vara den gyllene standarden för kvantifiering av analyter från komplexa biologiska matriser och ofta används för metaboliska studier 8. Men som ofta är fallet med biomedicinska studier, uppnå en tillgänglig och väldefinierad modell gäller människors sjukdom är en utmaning.
Många studier anställer omvandlas cellulära modeller för sondera effekterna av xenobiotika eller genetiska avvikelser på cellulär metabolism 7,9. Den metaboliska omprogrammering som sker i cancerceller kan införa confoundingfaktorer 21 och är därför inte idealiskt. Dessa frågor kan vara circumvented med primära cellmodeller, men att få tillräckligt med biomassa för metabola analyser kan vara en utmaning. Dessutom har effekterna av höga halter av antibiotika som används i odling lyfts fram som potentiellt störande mitokondrie studier 16.
Humana blodplättar ge möjlighet att utnyttja en primär cellmodell med tillräcklig mitokondrie innehåll för metaboliska studier 5,22,27,32. För det första kan trombocyter lätt förvärvas genom bloddragningar från enskilda givare, eller i stora volymer från blodbanker, och ger därmed en modell där externa faktorer kan lätt kontrolleras. För det andra, på grund av sin ringa storlek, blodplättar kan lätt isoleras från andra blodkomponenter med minimal förberedande arbete med minimalt utrustade laboratorier 5. Notera gör blodplättar innehåller kärnor och kan därför användas för att studera förändringar i metabolism oberoende av transkriptionell reglering. Här visar vi attförutom relativ kvantifiering av acyl-koenzym A (CoA) tioestrar, kan isoleras systemet plätt användas för att undersöka kolmetabolism. Specifikt rapporterar vi användning av metabolisk märkning med stabil isotop (icke-radioaktiv) märkt [13 C 6] glukos och [13 C 16] -palmitate att sondera inkorporering av [13 C] -märkt i den viktiga metaboliten acetyl- CoA via glykolys eller fettsyra oxidation. Detta ger ett kraftfullt, generaliserbar och mångsidig plattform på grund av den omfattande engagemang av acyl-CoA arter i biokemiska vägar 13,24 och spårbarhet av detta system att testa andra variabler, såsom hämning av komplex I med rotenon 3,33. Förutom de uppgifter som lämnats i protokollet nedan kan hittas en omfattande beskrivning av de metoder som används för isotopmärkning och för LC-MS-baserade analyser i Basu och Blair 4.
Här har vi visat användbarheten av isolerade blodplättar som en plattform för att studera perturbed mitokondriell metabolism. Specifikt har vi karaktäriseras metabolic anpassning som svar på komplexa I hämning av rotenon.
Den aktuella studien har förlängt tidigare rapporterade resultaten på sig rollen av komplexa I hämning av rotenon i cellinjer till humana blodplättar. Viktigt har detta visat att rotenon också hämmade trombocyter succinyl-CoA bildning, stimulerade en ökning a…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stöd av NIH bidrag P30ES013508 och T32ES019851.
Reagent | |||
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
2 mL Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
10 mL Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
Source | Thermo Scientific | HESI II | |
HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |