Summary
MRP4 regelt diverse cyclisch nucleotide-afhankelijke signalering evenementen, waaronder een recent opgehelderd rol in cel migratie. We beschrijven een directe, maar veelzijdige benadering van de downstream-moleculaire doelwitten van MRP4 resulteert in de identificatie van een unieke MRP4 interactoom die een belangrijke rol in de fine tuned regulering van de fibroblast migratie speelt ontrafelen.
Abstract
Multidrug resistentie eiwit 4 (MRP4) is een lid van de ATP-bindende cassette familie van membraan transporters en een endogeen effluxtransporter van cyclische nucleotiden. Door het moduleren van de intracellulaire cyclische nucleotide concentratie, kan MRP4 reguleren meerdere cyclisch nucleotide-afhankelijke cellulaire evenementen, waaronder celmigratie. Eerder demonstreerden we dat in afwezigheid van MRP4, fibroblastcellen bevatten hogere niveaus van intracellulaire cyclische nucleotiden en sneller migreren. Om de onderliggende mechanismen van deze bevinding begrijpen, we goedkeuring gehecht aan een directe maar toch veelzijdige aanpak. Ten eerste, die we potentiële inwerkende eiwitcomplexen van MRP4 uit een MRP4 overexpressie cel systeem met behulp van immunoprecipitatie gevolgd door massa-spectrometrie. Na het identificeren van unieke eiwitten in het MRP4 interactoom, gebruikten we Ingenuity Pathway Analysis (IPA) om de rol van deze proteïne-proteïne interacties staand in verband met signaaltransductie. We opgehelderd de potentieel rol van de MRP4 eiwitcomplex bij celmigratie geïdentificeerd F-actine als een belangrijke mediator van het effect van MRP4 op celmigratie. Deze studie benadrukte ook de rol van cAMP en cGMP als belangrijke spelers in het migratiefenomenen. Met behulp van hoge-gehalte microscopie, voerden wij cel-migratie assays en merkte op dat het effect van MRP4 op fibroblastmigratie volledig afgeschaft door verstoring van de actine cytoskelet of remming van cAMP-afhankelijke kinase A (PKA). Visualiseren signalering modulaties in een migrerende cel in real time, gebruikten we een FRET-gebaseerde sensor voor het meten van PKA activiteit en vond de aanwezigheid van polarisatie PKA activiteit bij bovenrand van het migreren MRP4 - / - fibroblasten, in vergelijking met MRP4 + / + fibroblasten. Hierdoor steeg corticale actine vorming en vergroot het migratieproces. Onze aanpak maakt de identificatie van de eiwitten downstream optreden om MRP4 en biedt ons een overGezien het mechanisme betrokken bij MRP4-afhankelijke regulatie van fibroblast migratie.
Introduction
Celmigratie is een ingewikkeld proces van meerdere stappen. Studies hebben aangetoond dat tijdens migratiecellen gepolariseerd in voorste en achterste randen. Door vast te houden aan de extracellulaire matrix, de leading edge levert de tractie nodig zijn voor de cel lichaam om vooruit te komen. Tot slot, de achterrand releases achter bijlagen en completeert de migratie cyclus 1,2.
Cel polarisatie voor een efficiënte celmigratie wordt gereguleerd door ruimtelijke segregatie van intracellulaire signalering. Cellulaire tweede messengers, zoals cAMP, bemiddelen de compartimentering van de signalering gebeurtenissen die nodig zijn voor fine-tuned directionele celmigratie 3,4. Preferentiële ophopingen van cAMP en cAMP-afhankelijke kinase PKA activiteit op de voorrand een belangrijke rol spelen in directionele celmigratie 5,6. Door fosforylatie kleine GTPases zoals Ras-gerelateerde C3 botulinum toxine substraat (Rac) en celdeling controle-eiwit 42 homoloog of Cdc42, PKEen activeert actine-gerelateerd eiwit 2/3 (Arp 2/3) aan de voorste rand en induceert de vorming van lamellipodia 7-9. PKA fosforyleert ook een anti-capping middel, vaatverwijdende gestimuleerd fosfoproteïne (VASP), waardoor regelt de oscillerende cycli van membraan uitbreiding en intrekken 10,11.
In cellen, zijn cAMP niveaus geregeld door drie belangrijke processen: i) synthese door adenylaatcyclase, ii) degradatie door fosfodiësterasen, en iii) het vervoer door membraangebonden transporters 3. Multidrug resistentie eiwit 4 (MRP4), een lid van de ATP-bindende cassette (ABC) familie van membraantransporteiwitten, functioneert als een endogene effluxtransporter van cyclische nucleotiden. Daarom kan MRP4 intracellulaire cAMP niveaus reguleren en cAMP-afhankelijke cellulaire signalering 11-13. We hebben eerder aangetoond dat MRP4 - / - fibroblasten bevatten relatief hogere niveaus van cyclische nucleotiden en migreren sneller compared tot MRP4 + / + fibroblasten 14. Ook rapporteerde een bifasisch effect van cyclische nucleotiden op fibroblastmigratie. Op basis van eerdere studies en onze bevinding dat MRP4 - / - fibroblasten bevatten meer gepolariseerd cAMP tijdens migratie veronderstelden we dat MRP4-gemedieerde regulering van de fibroblast migratie cAMP afhankelijke. Om de stroomafwaartse mechanisme te begrijpen, hebben we een directe nog veelzijdige benadering.
Om de eiwitten in verband en in samenspel met MRP4 identificeren, we immunogeprecipiteerd-MRP4 bevattende macromoleculaire complexen uit HEK293 cellen die overexpressie MRP4. Met behulp van massaspectrometrie, we geïdentificeerd multiple-MRP4 interactie eiwitten en hun interconnectiviteit geanalyseerd met behulp van Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA is een nuttig instrument om eiwit-eiwit interacties (zowel structurele en functionele) te analyseren en hun bijdragen in het bijzonder fysiologische en pathologische verkennenevents op basis van de literatuur en experimentele bewijzen 15,16. IPA vermeld dat F-actine is een belangrijke doelstelling van MRP4 stroomafwaarts in de context van celmigratie waarbij cAMP en cGMP zijn de belangrijkste signaalmoleculen 17. Deze gegevens werden verder bevestigd door een hoge gehalte microscopie. High-inhoud microscopie kan vastleggen en analyseren van cel gedrag, zoals cel migratie in een handiger, nauwkeuriger en high-throughput wijze 18. De high content microscopie gegevens tonen dat het effect van MRP4 op fibroblastmigratie volledig ingetrokken na verstoring van de actine cytoskelet of remming van PKA 17.
Daarnaast gebruikten we een Förster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde PKA sensor om de PKA dynamiek monitoren migrerende cellen in real time. -FRET gebaseerde kinase sensoren bestaan meestal uit specifieke fosforylering substraat peptiden geflankeerd door GVB en YFP fluoroforen 19-21. pmAKAR3 is een verbeterde en mijmbrane gerichte FRET-gebaseerde PKA sensor die-forkhead bijbehorende domein 1 (FHA1) en de PKA substraat sequentie LRRATLVD 5,22 bevat. Fosforylering van pmAKAR3 door de PKA katalytische subunit toeneemt FRET signaal tussen GVB en YFP 19. Insertie van een lipide wijzigingsdomein in sensor richt naar de plasmamembraan toezicht PKA dynamiek, specifiek op het membraancompartiment 23.
Gebruik pmAKAR3 hebben we aangetoond dat de voorrand van het migreren MRP4 - / - fibroblasten vertoonden polarisatie PKA activiteit dan MRP4 + / + fibroblasten, waardoor de vorming corticale actine in de cel voorrand 17 verhoogd. Samen vormen deze gebeurtenissen resulteerde in betere cellulaire polarisatie en sneller gerichte celmigratie in de afwezigheid van MRP4. Onze specifieke en directe aanpak geïdentificeerd belangrijke downstream targets voor MRP4 en vormt een belangrijke, maar alsnog van onontgonnen mechanisme voor MRP4-afhankelijke regulering van de fibroblast migratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ingenuity Pathway Analyse
- Uploaden Protein-interactoom Dataset
- Steek de eiwitten / genen van belang in een spreadsheet met hun unieke gen identifiers (bij voorkeur gen symbolen en gen-identificatie nummers zoals verkregen met massaspectrometrische gegevens).
- Wijs een kolom in de spreadsheet voor Gene identificatienummer en één kolom voor observationele waarde (bijv., Fold-change of p-waarde). Selecteer de 'bevat kolomkop' optie om de kolomkoppen te bekijken.
- Upload de dataset op de IPA door te klikken op de tab upload dataset en het selecteren van de bovengenoemde spreadsheet. Kies het tabblad flexibel formaat, en selecteer de juiste categorie van gen-identificatie.
Opmerking: Een flexibele indeling van de dataset overwint de opmaak specificaties voor het uploaden. - Na de dataset weergegeven, selecteert u ID en observatie columns. Zorg ervoor dat alle van de eiwitten (MRP4 interactoom zoals geïdentificeerd door massa-spectrometry) worden in kaart gebracht door het controleren op het tabblad Samenvatting dataset. De dataset is nu klaar voor de gewenste analyse.
- Gegevensanalyse
Opmerking: Beschreven zijn de gedeeltelijke gebruik van IPA eigenschappen die werden gebruikt voor deze studie.- Na het uploaden van MRP4 interactoom met hun gen namen als unieke identifiers, klik op nieuwe en kies kernanalyse in de top linkermenu van de IPA-software.
- Stel de expressie cutoffs waarde voor intensiteit overeenkomstig het experiment type (intensiteit waarde van 100 wordt aanbevolen voor analyse).
- Bereken de veelvoudverandering in expressie wanneer het de dataset als controle- en experimentele omstandigheden zijn betrokken en het als deel van de dataset bestand als een vergelijking analyse moet worden uitgevoerd (A cut-off waarde van 1,5 voudige verandering wordt meestal aanbevolen voor analyse ).
Opmerking: Na voltooiing van de kern analyse kan meerdere secties analyseresultaten worden verkregen. Het eerste tabblad toont de samenvatting van the totale analyses en stelt top canonieke paden, stroomopwaarts toezichthouders, moleculaire en cellulaire functies, en netwerken onder anderen; allemaal berekend op basis van het vertrouwen niveau (p-waarde) en gerangschikt in oplopende volgorde van de p-waarde. - Open de belangrijkste canonieke paden (met behulp van de open pad optie) als grote moleculaire netwerken die pictorially kruis praten, overlapping tonen, en de getroffen signaalwegen.
Bekijk de lijst van de canonieke paden die majorly betrokken zijn gebaseerd op de p-waarde (p <0,05 wordt als significant beschouwd).
Opmerking: De betekenis waarden voor de canonieke paden worden berekend door Fisher's exact test rechts staart. De betekenis geeft aan de waarschijnlijkheid van associatie van moleculen uit de dataset met de canonieke route door toeval alleen. - Bevestig de invoer eiwitten (MRP4 interactoom zoals geïdentificeerd door massa-spectrometrie) in de lijst van eiwitten die betrokken zijn in elk traject.
Opmerking: Met behulp van deze Option, werd waargenomen dat de cellulaire actine cytoskelet signalisatienetwerk de belangrijkste route getroffen en hoe de input eiwitten in past (figuur 1). Deze aanpak helpt bij het identificeren welke moleculaire netwerken nauw verbonden zouden zijn en beïnvloed door de test eiwitten. - Gebruik de netwerk de analyses boven ziekten en functies die mogelijk zijn gekoppeld aan een bepaald eiwit netwerk op basis van het aantal onscherpe moleculen te identificeren.
Opmerking: Een score waarde toegekend op basis van de bekende eiwitten die worden bepaald als onderdeel van een netwerk bijvoorbeeld cellulaire assemblage en bedrijfsnetwerk via literatuurkennis en experimentele bewijzen en focus moleculen die zijn geïdentificeerd van de dataset en deel uitmaken van het netwerk. . Voortaan wordt het netwerk gefilterd in de eerste plaats gebaseerd op het aantal van de focus moleculen.
2. High-gehalte Microscopie
- Bereiding van Cellen
Opmerking: Alle celkweek werk werd onder de horizontale flow celkweek kap gedaan.- Gebruik 96 putjes microplaten voor wondgenezing assay.
- Coat de microplaat met 1% fibronectine-oplossing (gereconstitueerd in PBS), en houdt de plaat in een standaard CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Verwijder MRP4 - / - en MRP4 + / + muis embryonale fibroblasten (MEF) gekweekt in 25 cm² celkweek kolven uit de incubator, was 1 uur met PBS en trypsinize de cellen gedurende 5 min met behulp van 1 ml van 4x trypsine-EDTA-oplossing.
- Was de cellen met compleet medium (DMEM met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine) en resuspendeer ze in 5 ml compleet medium.
- Zuig het fibronectine uit de putjes. Aantal cellen met een hemocytometer en zaden 30.000 cellen (aantal cellen moet worden geoptimaliseerd op basis van celtype) in elk putje.
- Groeien de cellen tot 100% confluentie in een standaardCO2 incubator bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- Het creëren van Wound
- Zorg ervoor dat alle de putten zijn gevuld met de oplossing. Vul gebruikte putjes met PBS om schade aan de wond om gereedschap te voorkomen (bijv., WoundMaker).
- Na bevestiging 100% cel samenvloeiing, plaatst u de 96-well plaat in de wond waardoor tool op de metalen bodemplaat en druk op de 96-pin goed blok verderop.
- Was de cellen drie keer met PBS om alle losgeraakte cellen te verwijderen en voeg 100 ul volledig medium.
- Voeg de testverbindingen - H-89 (50 micrometer, 1: 1000 verdunning met volledige media met behulp van 50 mM voorraad in DMSO) of latrunculine B (1 micrometer; 1: 1000 verdunning met volledige media met behulp van 1 mM voorraad in DMSO) in dit stadium .
- Plaats de assay plaat in de lezer bij 37 ° C en bewaken migratie over de experimentele periode.
- Monitoring Cell Migratie
Let op: de cel migratie werd gecontroleerd met behulp van de microscoop en software provided met high-gehalte microscopie-systeem. Het gebruik van 96-well microplaten, zodat de wonden automatisch wordt gecontroleerd door de microscoop en de software geregistreerd.- Stel de software om de assay plaat scant elk uur voor de migratie testen met het tabblad schema scan. Selecteer een starttijd ten minste 15 min na het plaatsen van de testplaat in de lezer equilibratiebuffer voorafgaand aan beeldvorming mogelijk.
- Selecteer de lade en kies het type schip (96-well microplaat) en type experiment (Scratch Wound).
- Selecteer 10X objectieve en kies fase-contrast beeldvorming parameters. Selecteer de bronnen die moeten worden gescand met behulp van de optie bewerken scan patroon.
- Geef de behandelingen groepen en eventuele herhalingen door het tabblad eigenschappen en het opzetten van een bord kaart. Het scannen kan worden gestopt op elk moment op basis van de experimentele conditie.
- Gegevensanalyse
- Na het scannen wordt gedaan, selecteert u het tabblad voor de testplaat vat uitzicht. Go de analyse job nutsbedrijven en selecteer lancering nieuwe analyse baan.
- Stel scratch wond als type werk en selecteer de tijd bereik voor de analyse (0 tijdstip tot 24 uur tijdstip).
- Selecteer de putten voor analyse te worden gekozen door een enkele klik op de bron en klik op 'OK' om de analyse te starten. Zodra de analyse wordt uitgevoerd, grafisch visualiseren relatieve dichtheid wond (RWD) gegevens voor elk putje op elk tijdstip via uitvoer naar de optie grafiek.
- Bekijk de fase-contrast beeld De reeks van elk goed overeenkomen met verschillende tijdstippen via het tabblad afbeelding uitzicht. Selecteer een bepaald goed door te klikken op de plaat kaart, selecteer een bepaald tijdstip op het tabblad tijdbereik en klik op het tabblad afbeelding uitzicht.
3. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
- Bereiding van Cellen
- Coat 35 mm glazen bodem gerechten met 100 ul van 1% fibronectine-oplossing (zoals beschreven in paragraaf 2.1) en bewaar ze instandaard CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Zuig het fibronectine-oplossing uit de platen en zaad gelijke aantallen HEK293-cellen (10.000 cellen / plaat) in compleet medium.
- Groeien de cellen 60-70% confluentie in fibronectine gecoate glazen bodem gerechten in een standaard CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- transfectie
- Voer alle transiënte transfecties met een commerciële transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant.
- Aliquot 250 ul volledig medium in twee 1,5 ml steriele centrifugebuizen per 35 mm schaal.
- Voeg 2 ug DNA (pmAKAR3 of pmAKAR3-TA) in één buis en 5 pi (2,5 maal de DNA concentratie) van transfectiereagens in een andere buis.
- Incubeer de buizen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens over de verdunde DNA in de transfectie-reagens bevattende buis.
- Meng goed en incubeer bij 37° C gedurende nog 30 min.
- Zuig het medium uit de cellen en was ze eenmaal met PBS. Voeg 1 ml antibiotica-vrij DMEM F-12 medium dat 10% FBS aan de cellen.
- Voeg 507 ul van DNA-lipide-conjugaat met media om de cellen in elke plaat, meng voorzichtig en in de CO2 incubator laten 37 ° C gedurende 48 uur. Gebruik 2 ug DNA (1 ug / ul voorraad) en 5 ul lipide voor 10.000-50.000 cellen in elke plaat.
- Live-cell imaging
- Na 48 uur transfectie, verwijder kweekmedium en was de cellen 2 keer met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, voorverwarmd bij 37 ° C). Voeg een eindvolume van 1,9 ml HBSS de gewassen cellen en brengen ze op een omgekeerde wide-field microscoop voor FRET beeldvorming in een maat 37 ° C gehandhaafd kamer.
Opmerking: In dit systeem, het excitatielicht wordt verzorgd door een 300 W xenon lamp verzwakt met een Neutral Density filter met 50% licht transmission. - Gebruik 60X objectief. Handmatig scherp te stellen op de cellen en stel een optimaal gezichtsveld met behulp van de microscoop. Activeer het geselecteerde gebied van mening op het computerscherm met behulp van de "F" optie Focus op de software. Voor het uitvoeren van FRET metingen, selecteert u de juiste filter set (CFP / YFP filter ingesteld met een 430/25 nm excitatie filter, een dubbele dichroïsche bundelsplitser, en twee emissie-filters (470/30 nm voor GVB en 535/30 nm voor FRET) handmatig.
- Visualiseer fluorescentie door eerst te controleren op het kanaal optie CFP / YFP / FRET, gevolgd door te klikken op het tabblad geopend fluor. Het verbeteren van de intensiteit van het signaal met behulp van de intensivering gereedschap in de tab camera.
- Selecteer de cellen die pmAKAR3 of pmAKAR3-TA vermijden van verzadiging van het signaal intensiteit. Gebruik het venster om FRET-meting te starten.
- Selecteer de time-lapse-optie en het inrichten van een time-scan voor 30 min 30 sec interval. Vink de optie FRET en stel de belichtingstijd bij 100 msec. Voer het label eend Druk op START om de meting te starten.
- Na vijf tijdstippen en instelling van een basislijn, voeg 25 uM forskoline (5 pl 10 pM voorraad in ethanol, verdund met 100 pi HBSS) aan de cellen zonder de plaat te verstoren en controleren de cellen gedurende in totaal 30 min.
- Na 48 uur transfectie, verwijder kweekmedium en was de cellen 2 keer met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, voorverwarmd bij 37 ° C). Voeg een eindvolume van 1,9 ml HBSS de gewassen cellen en brengen ze op een omgekeerde wide-field microscoop voor FRET beeldvorming in een maat 37 ° C gehandhaafd kamer.
- Gegevensanalyse
Opmerking: Gebruik ratiometrische berekeningsmodule voor data-analyse.- Klik op de select tool op de linkerkant van het venster afbeelding en kies een solide rechthoek uit het drop down menu. Sleep de rechthoek op het veld afbeelding in een cel vrij gebied en klik met de rechtermuisknop op het aan te stellen als achtergrond voor het doel van de achtergrond aftrekken.
- Ga naar het masker en het gebruik van 'een nieuwe masker' optie. Ga naar de select gereedschap en kies een pen in het drop down menu om een masker rond de cel handmatig op te vestigen voor een meting te selecteren. Kies ten minste 4-6 cellen per conditie.
- Selecteer het tabblad Mask en voer statistieken masker.
- Vink 'Gehele masker', uit te breiden cross-channel optie en selecteer donor genormaliseerde FRET (N-FRET) (FRET / GVB). De N-FRET waarde representeert PKA activiteit op het plasmamembraan.
- Voeg tijd-stempels, look-up tafel en de omvang bar met behulp van de annotaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het effect van MRP4 op fibroblastmigratie onderzoeken, gebruikten we een wondhelend assay gebruik high content 14 microscopie. Precieze wonden werden gemaakt op confluente monolagen van MEFs geïsoleerd uit ofwel MRP4 - / - of MRP4 + / + muizen en beelden werden 1 uur intervallen van 24 uur. We namen een migratie hoger tarief voor MRP4 - / - MEF opzichte MRP4 + / + MEF (figuur 2). De wonden werden volledig genezen in minder dan 15 uur voor de MRP4 - / - MEF, terwijl de MRP4 + / + MEF vereist bijna 20 uur om de wonden te dekken.
Gepolariseerde accumulatie van PKA activiteit bij de voorrand van migrerende cellen is een belangrijke vroege gebeurtenis voor gerichte migratie. PKA activiteit kan worden gecontroleerd in real time using de pmAKAR3 FRET-gebaseerde sensor voor PKA 5,17. Om de specificiteit van pmAKAR3 voor PKA activiteit controleren, behandelden wij HEK293 cellen overexpressie pmAKAR3 of puntmutant pmAKAR3-TA, die een threonine-naar-alanine mutatie op het substraatgebied voor PKA bevat en daarom ongevoelig voor PKA fosforylering met 25 uM forskoline een cAMP-inducerend middel 14. We vonden een toename van FRET signaal overexpressie pmAKAR3, maar overexpressie pmAKAR3-TA bleef ongewijzigd (figuur 3). De basale FRET niveaus waren ook hoger voor cellen die pmAKAR3 vergelijking met de cellen die pmAKAR3-TA. Deze gegevens gaven aan dat pmAKAR3 is zeer specifiek voor PKA activiteit.
Samengevat, in de sectie protocol beschreven werkwijzen zijn nuttig om het moleculaire mechanisme geassocieerd met een specifieke cellulaire gebeurtenis bestuderen.
Figuur 1:. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) van MRP4 Interactoomanalyse gebruik van IPA actine cytoskelet pathway werd geïdentificeerd als een van de belangrijkste canonieke paden beïnvloed door MRP4 interactoom. Gepresenteerd actine signalering netwerk geeft aangesloten eiwitten (wit) en hun kruis communicatie met de eiwitten die in de MRP4 interactoom (roze) afgeleid uit de literatuur en experimentele bewijzen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 2: wondgenezing Assay met behulp van High Content Microscopie MRP4 + / + en MRP4 - / - muis embryonale fibroblasten (MEF) werden gekweekt op fibroneCTIN-gecoate 96-well gerechten, en wonden in de monolagen werden precies gemaakt met behulp van de 96-pin wond-maker. Representatieve beelden op verschillende tijdstippen zijn opgenomen met 10x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Förster Resonance Energy Transfer (FRET) gebaseerde meting van PKA activiteit met pmAKAR3 Sensoren Representatieve pseudo-kleurenafbeeldingen N-FRET met 60X vergroting voor HEK293-cellen getransfecteerd met pmAKAR3 sensor en pmAKAR3 TA-sensor voor en na forskoline behandeling. weergegeven (bovenste panelen). Afbeeldingen in elk paneel werden gevangen uit hetzelfde gezichtsveld. Kleur balk geeft de grootte van de N-FRET. De lijn grafiek (onderste paneel) vertegenwoordigt de verandering in N-FRET levels na treatment met forskoline. Gegevens stellen het gemiddelde van ten minste drie onafhankelijke experimenten (gemiddelde ± SEM, n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35 mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in 100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why? Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
