Summary
MRP4 regulerer forskellige cykliske nukleotid-afhængig signalering arrangementer, herunder en nylig belyst rolle i celle migration. Vi beskriver en direkte, men flerstrenget tilgang at optrævle de nedstrøms molekylære mål for MRP4 resulterer i identifikation af et unikt MRP4 interactome der spiller centrale roller i finjusteret regulering af fibroblast migration.
Abstract
Multilægemiddelresistens protein 4 (MRP4) er et medlem af ATP-bindende kassette-familien af membrantransportører og er en endogen efflukstransporteren af cykliske nukleotider. Ved at modulere intracellulær cyklisk nukleotid koncentration, kan MRP4 regulere flere cykliske nukleotid-afhængige cellulære begivenheder, herunder celle migration. Tidligere påviste vi, at i fravær af MRP4, fibroblastceller indeholder højere niveauer af intracellulære cykliske nukleotider og kan migrere hurtigere. For at forstå de underliggende mekanismer af dette fund, vedtog vi en direkte alligevel flerstrenget tilgang. Først, vi isoleret potentielle interagerende protein komplekser af MRP4 fra en MRP4 overekspression celle system ved hjælp af immunpræcipitation efterfulgt af massespektrometri. Efter identifikation unikke proteiner i MRP4 interactome, vi udnyttet Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for at undersøge den rolle, disse protein-protein interaktioner i forbindelse med signaltransduktion. Vi belyst den potiale rolle MRP4 proteinkompleks i cellemigrering og identificeret F-actin som en vigtig mediator af virkningen af MRP4 på cellemigrering. Denne undersøgelse understregede også betydningen af cAMP og cGMP som centrale aktører i de vandrende fænomener. Ved hjælp af høj-indhold mikroskopi, udførte vi celle-migration assays og observerede, at virkningen af MRP4 på fibroblast migration er helt afskaffet ved afbrydelse af actincytoskelettet eller inhibering af cAMP-afhængig kinase A (PKA). At visualisere signalering modulationer i en vandrende celle i realtid, vi udnyttet en FRET-baseret sensor til måling PKA aktivitet og fandt, at tilstedeværelsen af mere polariseret PKA aktivitet nær forkanten af migrerende Mrp4 - / - fibroblast, sammenlignet med Mrp4 + / + fibroblaster. Dette vil til gengæld øget kortikal actin dannelse og augmented processen med migration. Vores tilgang gør det muligt at identificere de proteiner, der virker nedstrøms til MRP4 og giver os en overbetragtning af den involveret i MRP4-afhængig regulering af fibroblast migration mekanisme.
Introduction
Cell migration er en kompliceret multi-trins proces. Undersøgelser har vist, at under migration celler polariseret i for- og bagkanten. Ved at følge den ekstracellulære matrix, den førende kant giver trækkraft er nødvendig for cellen kroppen at bevæge sig fremad. Endelig efterstillede kant udgivelser bag vedhæftede filer og fuldender migration cyklus 1,2.
Cell polarisering til effektiv cellemigration reguleres af rumlig adskillelse af intracellulær signalering. Cellular second messengers, såsom cAMP, mægle opdeling af signalering begivenheder, der kræves for finjusteret retningsbestemt celle migration 3,4. Differentieret ophobninger af cAMP og cAMP-afhængig kinase PKA aktivitet på forkant spiller nøgleroller i retningsbestemt cellemigration 5,6. Ved phosphorylering små GTPaser såsom Ras-relateret C3 botulinustoksin substrat (Rac) og celledeling kontrolprotein 42 homolog eller Cdc42, PKA aktiverer actin-relateret protein 2/3 (Arp 2/3) ved forkanten og inducerer dannelsen af lamellipodia 7-9. PKA phosphorylerer også en anti-capping agent, vasodilator stimuleret phosphoprotein (VASP), derved regulerer oscillerende cyklusser af membran udvidelse og tilbagetrækning 10,11.
I celler, der cAMP-niveauer reguleres af tre hovedprocesser: i) syntese ved adenylatcyclase, ii) nedbrydning af phosphodiesteraser, og iii) transport af membranbundne effluxtransportører 3. Multilægemiddelresistens protein 4 (MRP4), et medlem af ATP-bindende kassette (ABC) familie af membrantransportører, funktioner som en endogen efflukstransporteren af cykliske nukleotider. Derfor kan MRP4 regulere intracellulære cAMP-niveauer og cAMP-afhængig cellulær signalering 11-13. Vi har tidligere vist, at i Mrp4 - / - fibroblaster indeholder relativt højere niveauer af cykliske nukleotider og migrere hurtigere compared til Mrp4 + / + fibroblaster 14. Vi rapporteret også en bifasisk effekt af cykliske nukleotider på fibroblast migration. Baseret på tidligere studier og vores fund, at Mrp4 - / - fibroblaster indeholder mere polariseret cAMP i løbet af migration, vi hypotese, at dette MRP4-medieret regulering af fibroblast migration er cAMP-afhængig. For at forstå den nedstrøms mekanisme, tog vi en direkte alligevel flerstrenget tilgang.
For at identificere de proteiner, der er forbundet og i samspil med MRP4, vi immunopræcipiterede MRP4-holdige makromolekylære komplekser fra HEK293 celler at over udtrykker MRP4. Brug massespektrometri, identificerede vi flere MRP4-interagerende proteiner og analyseret deres sammenkobling hjælp Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA er et nyttigt værktøj til at analysere protein-protein interaktioner (både strukturelle og funktionelle) og udforske deres bidrag, især fysiologiske og patologiskebegivenheder baseret på litteraturen og eksperimentelle beviser 15,16. IPA indikerede, at F-actin er et stort nedstrømsmål af MRP4 i forbindelse med cellemigrering hvor cAMP og cGMP er nøglen signalmolekyler 17. Disse data blev yderligere bekræftet ved højinformativ mikroskopi. High-indhold mikroskopi kan fange og analysere celle adfærd, såsom celle migration i en mere bekvem, nøjagtig og high-throughput måde 18. De høje-indhold mikroskopi data viste, at virkningen af MRP4 på fibroblast migration er helt afskaffes ved afbrydelse af actincytoskelettet eller inhibering af PKA 17.
Desuden har vi brugt en Forster resonans (FRET) -baserede PKA sensor til at overvåge PKA dynamik i migrerende celler i realtid. FRET-baserede kinase sensorer består normalt af specifikke phosphoryleringssubstrat peptider flankeret af den fælles fiskeripolitik og YFP fluoroforer 19-21. pmAKAR3 er en forbedret og migmbrane målrettet FRET-baserede PKA sensor, der indeholder forkhead-associerede domæne 1 (FHA1) og PKA substrat sekvens LRRATLVD 5,22. Phosphorylering af pmAKAR3 af PKA katalytiske subunit stigninger FRET signal mellem FFP og YFP 19. Indsættelse af et lipid modifikation domæne ind i sensoren målretter det til plasmamembranen til overvågning PKA dynamik, specielt mod membranen kammer 23.
Brug af pmAKAR3, demonstrerede vi at forkanten migrere Mrp4 - / - fibroblaster udviste mere polariseret PKA aktivitet end Mrp4 + / + fibroblaster, som igen udbyggede kortikale actin formationen ved cellens førende kant 17. Tilsammen udgør disse begivenheder resulterede i bedre cellulær polarisering og hurtigere retningsbestemt celle migration i fravær af MRP4. Vores specifikke og direkte tilgang identificeret vigtige downstream mål for MRP4 og giver en vigtig, men somendnu uudforskede mekanisme til MRP4-afhængig regulering af fibroblast migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ingenuity Pathway Analysis
- Upload Protein-interactome Datasæt
- Sæt proteiner / gener af interesse i et regneark med deres unikke gen-id'er (helst gen symboler og gen-identifikationsnumre som opnået med massespektrometriske data).
- Tildel en kolonne i regnearket for Gene id-nummer og en kolonne for observationelle værdi (f.eks., Fold-ændring eller p-værdi). Vælg "indeholder kolonneoverskriften 'mulighed for at se kolonneoverskrifterne.
- Upload datasættet på IPA ved at klikke på fanen upload datasæt og vælge regnearket nævnt ovenfor. Vælg fanen fleksibelt format, og vælg den relevante kategori af gen-id.
Bemærk: En fleksibel format datasættet overvinder formatering specifikationer for upload. - Efter datasættet vises, skal du vælge id og observation kolonner. Sikre, at alle proteinerne (MRP4 interactome som identificeret ved masse-spectrometry) er kortlagt ved at kontrollere på fanen resumé datasæt. Datasættet er nu klar til den ønskede analyse.
- Dataanalyse
Bemærk: Beskrevet er de partielle anvendelser af IPA funktioner, der blev anvendt til denne undersøgelse.- Efter upload MRP4 interactome med deres gen navne som entydige identifikatorer, klik på ny og vælge core analyse i øverste venstre menu af IPA-software.
- Indstil udtrykket cutoffs værdi for intensitet efter eksperimentet type (Intensity værdi på 100 anbefales til analyse).
- Beregn fold-ændringen i udtryk samtidig forbereder datasættet, hvis kontrol- og eksperimentelle betingelser er involveret, og medtage den som en del af datasættet fil, hvis en sammenligning analyse skal udføres (A cut-off værdi på 1,5 gange ændring er normalt anbefales til analyse ).
Bemærk: Efter afslutning af kernen analyse, kan der opnås flere sektioner af analyser. Den første fane viser sammenfatningen af the samlede analyser og foreslår top kanoniske veje, opstrøms regulatorer, molekylære og cellulære funktioner og netværk blandt andre; alle beregnet baseret på tillid niveau (p-værdi) og arrangeret i stigende rækkefølge af p-værdi. - Åbn de store kanoniske veje (ved hjælp af den åbne vej option) som store molekylære netværk, der billedligt viser cross taler, overlappende, og påvirkede signalveje.
Kig på listen over de kanoniske veje, der er majorly involveret baseret på p-værdi (p <0,05 betragtes som signifikant).
Bemærk: De betydning værdier for de kanoniske veje beregnes ved Fishers eksakte test lige-tailed. Betydningen angiver sandsynligheden for association af molekyler fra datasættet med den kanoniske pathway ved tilfældig chance alene. - Bekræft input proteiner (MRP4 interactome som identificeret ved massespektrometri) blandt listen over proteiner involveret i hver sti.
Bemærk: Brug af denne Option, blev det observeret at den cellulære actin cytoskeleton signalering netværk er den vigtigste berørte pathway og hvordan input proteiner passer ind i det (figur 1). Denne tilgang hjælper med at identificere hvilke molekylære netværk ville være tæt forbundet, og påvirket af test proteiner. - Brug fanen netværk i analyserne for at identificere de øverste sygdomme og funktioner, der potentielt er knyttet til et bestemt protein-netværk baseret på antallet af fokus molekyler.
Bemærk: En score værdi givet baseret på de kendte proteiner, som er bestemt som en del af et netværk f.eks cellulære samling og organisation netværk, gennem litteratur viden og eksperimentelle beviser og fokusere molekyler, der er identificeret fra datasættet og blive en del af netværket. . Fremover bliver netværket filtreret i første omgang baseret på antallet af fokus molekyler.
2. High-indhold Microscopy
- Fremstilling af celler
Bemærk: Alle cellekultur arbejde blev udført under det horisontale flow cellekultur hætte.- Brug mikroplader med 96 brønde for sårheling assay.
- Coat mikropladen med 1% fibronectin opløsning (rekonstitueret i PBS), og holde pladen i en standard CO2-inkubator ved 37 ° C i 2 timer.
- Fjern Mrp4 - / - og Mrp4 + / + mus embryonale fibroblast (MEF) dyrket i 25 cm² celle kultur flasker fra inkubatoren, vaske 1 gang med PBS, og Trypsinisér cellerne i 5 minutter ved anvendelse af 1 ml 4x trypsin-EDTA-opløsning.
- Vask cellerne med komplet medium (DMEM indeholdende 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin) og resuspender dem i 5 ml komplet medium.
- Aspirer fibronectin løsning fra brøndene. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og frø 30.000 celler (celle nummer skal optimeres baseret på celletype) i hver brønd.
- Grow cellerne til 100% konfluens i en standardCO2-inkubator ved 37 ° C i 24 timer.
- Oprettelse Wound
- Sørg for at alle brøndene er fyldt med løsning. Fyld ubrugte brønde med PBS for at forhindre beskadigelse af såret gør værktøjet (f.eks., WoundMaker).
- Efter bekræftelse 100% cellekonfluens placere 96-brønds plade inden i såret gør værktøj på metalbundpladen og tryk på 96-brønds pin blok ned.
- Vask cellerne tre gange med PBS for at fjerne eventuelle fjernede celler, og 100 pi komplet medium.
- Tilføj testforbindelserne - H-89 (50 pM; 1: 1.000 fortynding med komplette medier ved anvendelse af 50 mM stamopløsning i DMSO) eller Latrunculin B (1 uM; 1: 1.000 fortynding med komplette medier ved anvendelse af 1 mM stamopløsning i DMSO) på dette tidspunkt .
- Placer assaypladen inde læseren ved 37 ° C og overvåge migration over forsøgsperioden.
- Overvågning Cell Migration
Bemærk: Cellemigrering følges under mikroskop og software provided med højinformativ mikroskopi system. Anvendelsen af 96-brønds mikroplader sikrer, at sårene automatisk overvåges af mikroskopet og registreret af softwaren.- Indstil softwaren til at scanne assaypladen hver time for migration analyser ved hjælp af fanen tidsplan scanning. Vælg et starttidspunkt i mindst 15 min efter anbringelse assaypladen inde læseren at der opnås ligevægt før billeddannelse.
- Vælg den bakke, og vælg skibstype (96 brønde mikroplade) og eksperimentere type (Scratch Wound).
- Vælg 10X objektiv og vælg fase-kontrast imaging parametre. Vælg brøndene, der skal scannes med skannemønstret edit mulighed.
- Angiv de behandlinger grupper og eventuelle gentagelser ved at vælge fanen egenskaber, og oprette en tallerken kortet. Scanning kan stoppes til enhver tid er baseret på den eksperimentelle tilstand.
- Dataanalyse
- Når scanningen er færdig, skal du vælge fanen fartøj udsigt til analysen pladen. Go til analysen job forsyningsselskaber og vælg lancering ny analyse job.
- Angiv scratch sår som jobtype og vælg tidsintervallet for analysen (0 tidspunkt til 24 timers tidspunkt).
- Vælg brøndene at blive valgt til analyse ved et enkelt klik på godt og klik på 'OK' for at starte analysen. Når analysen er færdig, grafisk visualisere relativ sår densitet (RWD) data for hver brønd på hvert tidspunkt ved hjælp eksport til grafen mulighed.
- Se fase-kontrast billede sæt hver brønd svarende til forskellige tidspunkter ved hjælp af fanen view billedet. Vælg en bestemt godt ved at klikke på pladen kortet, vælg bestemt tidspunkt fra fanen tidsinterval og klik på fanen view billedet.
3. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
- Fremstilling af celler
- Coat 35 mm glas-bund retter med 100 ul 1% fibronektin løsning (som beskrevet i afsnit 2.1), og holde dem ien standard CO2-inkubator ved 37 ° C i 2 timer.
- Aspirer fibronectin løsning fra pladerne og frø lige mange HEK293-celler (10.000 celler / plade) i komplet medium.
- Grow cellerne til 60-70% konfluens i fibronectin- coatede glas-bund retter i en standard CO2-inkubator ved 37 ° C i 24 timer.
- Transfektion
- Udføre alle transiente transfektioner under anvendelse af en kommerciel transfektionsreagens i henhold til producentens anvisninger.
- Aliquot 250 pi komplet medium i to separate 1,5 ml sterile centrifugerør for hver 35 mm skål.
- Tilsæt 2 pg DNA (pmAKAR3 eller pmAKAR3-TA) i et rør og 5 pi (2,5 gange den DNA-koncentrationen) af transfektionsreagens i et andet rør.
- Inkuber rørene i 20 minutter ved stuetemperatur og derefter overføre den fortyndede DNA i transfektionsreagens-holdige rør.
- Bland grundigt og inkuberes ved 37° C i yderligere 30 minutter.
- Aspirer mediet fra cellerne og vaskes én gang med PBS. Tilsæt 1 ml antibiotikum-frit DMEM F-12-medium indeholdende 10% FBS til cellerne.
- Tilføj 507 pi DNA-lipid-konjugat med medier til cellerne i hver plade, bland forsigtigt og holde i CO2-inkubator ved 37 ° C i 48 timer. Brug 2 pg DNA (1 pg / pl stock) og 5 pi lipid for 10.000-50.000 celler i hver plade.
- Levende celler Imaging
- Efter 48 timer af transfektion, fjerne vækstmedium og vaske cellerne 2 gange med Hanks balancerede saltopløsning (HBSS, forvarmet ved 37 ° C). Tilføj et slutvolumen på 1,9 ml HBSS til de vaskede celler og montere dem på en omvendt wide-field mikroskop for FRET billeddannelse inde i en specialfremstillet 37 ° C opretholdes kammer.
BEMÆRK: I dette system er excitation lys fra en 300 W Xenon-lampe svækket med en Neutral Density filter med 50% lys transmission. - Brug 60X objektiv. Manuelt fokusere på cellerne og indstille en optimal synsfelt ved hjælp af mikroskop. Aktiver valgte synsfelt på computerskærmen ved hjælp af Focus "F" option på softwaren. For at udføre FRET målinger, skal du vælge den korrekte filter sæt (CFP / YFP filter sæt med en 430/25 nm excitation filter, en dobbelt dikroisk stråledeler, og to emissioner filtre (470/30 nm for FFP og 535/30 nm for FRET) manuelt.
- Visualiser fluorescens ved først at tjekke på den kanal option fælles fiskeripolitik / YFP / FRET efterfulgt ved at klikke åben fane fluor. Forbedre signal intensitet ved hjælp af intensivering værktøjet i fanen kameraet.
- Marker cellerne udtrykker pmAKAR3 eller pmAKAR3-TA undgå mætning af signalintensiteten. Brug capture vinduet at indlede FRET måling.
- Vælg time-lapse indstilling og opsætning en tid-scanning i 30 min med 30 sek interval. Kontroller FRET option og indstille eksponeringen tid på 100 ms. Indtast billedet label end Tryk på Start for at starte målingen.
- Efter fem tidspunkter og etablering af en basislinie, tilsættes 25 pM forskolin (5 pi 10 pM stamopløsning i ethanol, fortyndet med 100 pi HBSS) til cellerne uden at forstyrre pladen og overvåge cellerne i i alt 30 minutter.
- Efter 48 timer af transfektion, fjerne vækstmedium og vaske cellerne 2 gange med Hanks balancerede saltopløsning (HBSS, forvarmet ved 37 ° C). Tilføj et slutvolumen på 1,9 ml HBSS til de vaskede celler og montere dem på en omvendt wide-field mikroskop for FRET billeddannelse inde i en specialfremstillet 37 ° C opretholdes kammer.
- Dataanalyse
Bemærk: Brug ratiometrisk beregningsmodul til dataanalyse.- Klik på markeringsværktøjet i venstre side af vinduet billedet, og vælg en solid rektangel fra drop down menuen. Træk rektangel på billedfeltet i en celle område og højreklik på den for at indstille det som baggrund med henblik på baggrunden subtraktion.
- Gå til masken og bruge "oprette en ny maske 'muligheden. Gå til markeringsværktøjet og vælge en pen fra drop down menu til manuelt at tegne en maske omkring cellen for at vælge den til en måling. Vælge mindst 4-6 celler pr tilstand.
- Vælg fanen Mask og udfører maske statistik.
- Check 'Hele maske', ekspandere på tværs af kanaler option og vælg donor normaliseret FRET (N-FRET) (FRET / CFP). Den N-FRET værdi repræsenterer PKA aktivitet ved plasmamembranen.
- Tilføj tidsstempler, look-up tabel og skala bar ved hjælp af anmærkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at undersøge virkningen af MRP4 på fibroblast migration, anvendte vi en sårhelende assay under anvendelse højinformativ mikroskopi 14. Præcise sår blev foretaget på sammenflydende monolag af MEF'er isoleret fra enten Mrp4 - / - eller Mrp4 + / + mus, og billeder blev taget ved 1 intervaller time i 24 timer. Vi observerede en højere vandringshastighed for Mrp4 - / - MEF'er sammenlignet med Mrp4 + / + MEF'er (figur 2). Sårene blev fuldstændig helbredt i mindre end 15 timer til Mrp4 - / - MEF'er, mens Mrp4 + / + MEF'er krævede næsten 20 timer at dække sår.
Polariseret ophobning af PKA aktivitet på forkant med at migrere celler er en vigtig tidlig begivenhed for retningsbestemt migration. PKA aktivitet kan overvåges i realtid using den pmAKAR3 FRET-baserede sensor til PKA 5,17. For at kontrollere specificitet pmAKAR3 for PKA-aktivitet, vi behandlede HEK293 celler, der overudtrykker pmAKAR3 eller det punkt mutant pmAKAR3-TA, som indeholder en threonin-til-alanin-mutation på underlaget region for PKA og derfor er uansvarlige til PKA fosforylering med 25 pM forskolin , en cAMP-inducerende middel 14. Vi fandt en stigning i FRET signal i celler, der overudtrykker pmAKAR3, men celler, der overudtrykker pmAKAR3-TA forblev uændret (figur 3). Den basale FRET niveauer var også højere for celler, der udtrykker pmAKAR3 sammenlignet med de celler, der udtrykker pmAKAR3-TA. Disse data viste, at pmAKAR3 er meget specifik for PKA-aktivitet.
Sammenfattende beskrevet i protokollen metodeafsnittet er nyttige værktøjer til at studere den molekylære mekanisme er forbundet med en specifik cellulær hændelse.
Figur 1:. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) i MRP4 Interactome Brug IPA aktincytoskelettet vej blev identificeret som en af de store kanoniske veje ramt af MRP4 interactome. Præsenteret actin signalering netværk indikerer tilsluttede proteiner (hvid) og deres kors kommunikation med proteiner identificeret i MRP4 interactome (lyserød) udledes litteratur og eksperimentelle beviser. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2: sårheling Assay hjælp High Content Microscopy Mrp4 + / + og Mrp4 - / - muse embryonale fibroblaster (MEF'er) blev dyrket på fibroneCtIN-coatede 96-brønds skåle, og sår i monolagene blev foretaget nøjagtigt under anvendelse af 96-bens sår-maker. Repræsentative billeder på forskellige tidspunkter er vist med 10X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -baserede Måling af PKA-aktivitet ved anvendelse pmAKAR3 Sensorer Repræsentative pseudo-farvebilleder af N-FRET med 60X forstørrelse til HEK293-celler transficeret med pmAKAR3 sensor og pmAKAR3-TA sensor før og efter forskolin behandling er. vist (top paneler). Billeder i hvert panel blev indfanget fra den samme synsfelt. Farvestang angiver størrelsen af N-FRET. Linjegrafen (nederste panel) repræsenterer ændringen i N-FRET-niveauer efter treatment med forskolin. Dataene repræsenterer gennemsnittet af mindst tre uafhængige forsøg (Middelværdi ± SEM, n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35 mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in 100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why? Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
