Summary
MRP4 regulerer ulike sykliske nukleotid-avhengige signal hendelser, inkludert en nylig belyst rolle i celle migrasjon. Vi beskriver en direkte, men mangefasettert tilnærming for å løse nedstrøms molekylære mål av MRP4 resulterer i identifikasjon av en unik MRP4 interactome som spiller nøkkelroller i finjustert regulering av fibroblast migrasjon.
Abstract
Multiresistens protein 4 (MRP4) er et medlem av ATP-bindende kassett familie av membran transportører og er en endogen effluks transportør av sykliske nukleotider. Ved moduler intracellulær syklisk nukleotid konsentrasjon, kan MRP4 regulere flere sykliske nukleotid-avhengige cellulære hendelser, inkludert celle migrasjon. Tidligere viste vi at i fravær av MRP4, fibroblastceller inneholde høyere nivåer av intracellulære cykliske nukleotider og kan migrere raskere. For å forstå de underliggende mekanismene for dette funnet, vedtok vi en direkte ennå mangefasettert tilnærming. For det første isolerte vi mulige samvirkende proteinkomplekser av MRP4 fra en MRP4 overekspresjon cellesystemet ved hjelp av immunpresipitering etterfulgt av massespektrometri. Etter å identifisere unike proteiner i MRP4 interactome, benyttet vi oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) for å utforske rollen til disse protein-protein interaksjoner i sammenheng med signaltransduksjon. Vi belyst potensial rolle MRP4 proteinkomplekset på cellemigrering og identifisert F-aktin som en viktig mediator av effekten av MRP4 på cellemigrering. Denne studien understreket også rollen cAMP og cGMP som sentrale aktører i trekk fenomener. Ved hjelp av høy-innhold mikroskopi, utførte vi celle-migrering analyser og observert at virkningen av MRP4 på fibroblast-migrasjon er fullstendig opphevet ved avbrudd av aktin cytoskjelettet eller inhibering av cAMP-avhengig kinase A (PKA). For å visualisere signale modulasjoner i en migrere celle i sanntid, benyttet vi et FRET-baserte sensor for måling av PKA-aktivitet og ble funnet, at tilstedeværelse av mer polarisert PKA aktivitet nær den fremre kant av migrere Mrp4 - / - fibroblast, sammenlignet med Mrp4 + / + fibroblaster. Dette i sin tur øket kortikal aktin dannelse og utvidet prosessen med migrasjon. Vår tilnærming muliggjør identifisering av proteiner som virker nedstrøms til MRP4 og gir oss en overriss av mekanismen som er involvert i MRP4 avhengig regulering av fibroblast migrasjon.
Introduction
Cellemigrering er en komplisert flertrinnsprosess. Studier har vist at i løpet av migrasjons celler er polarisert i forkant og bakkant. Ved å følge den ekstracellulære matrise, gir forkanten trekkraft nødvendig for cellen kroppen å bevege seg fremover. Endelig bakkanten utgivelser sykkelstativ og fullfører migrasjonssyklus 1,2.
Celle polarisasjon for effektiv cellemigrering er regulert av romlig atskillelse av intracellulær signalisering. Cellular andre budbringere, som cAMP, megle compartmentalization av signalanlegg hendelser som kreves for finjustert retnings celle migrasjon 3,4. Fortrinnsrett ansamlinger av cAMP og cAMP-avhengig kinase PKA aktivitet i forkant spiller sentrale roller i retnings celle migrasjon 5,6. Ved å fosforylere små GTPases som Ras-relaterte C3 botulinumtoksin substrat (Rac) og celledeling kontroll protein 42 homolog eller Cdc42, PKEn aktiverer aktin-relatert protein 2/3 (Arp 2/3) ved den fremre kant og induserer dannelsen av lamellipodia 7-9. PKA fosforylerer også en anti-korkende middel, vasodilator stimulert fosfoprotein (VASP) for derved regulerer svingnings sykluser av membranen utskyt- 10,11.
I celler, er cAMP-nivåer reguleres av tre hovedfremgangsmåter: i) syntese av adenylatsyklase, ii) nedbrytning av fosfodiesteraser, og iii) transport av membranbundne efflux transportører 3. Multidrug resistance protein 4 (MRP4), et medlem av ATP-bindende kassett (ABC) familie av membran transportører, fungerer som en endogen effluks transportør av sykliske nukleotider. Derfor kan MRP4 regulere intracellulære cAMP-nivåer og cAMP-avhengig cellulære signale 11-13. Vi har tidligere vist at i Mrp4 - / -, fibroblaster inneholder relativt høyere nivåer av cykliske nukleotider og vandrer raskere compared til Mrp4 + / + fibroblaster 14. Vi rapporterte også en bifasisk effekt av sykliske nukleotider på fibroblast migrasjon. Basert på tidligere studier, og våre funn at Mrp4 - / - fibroblaster inneholde mer polarisert cAMP i løpet av migrasjon, hypotese vi at dette MRP4-mediert regulering av fibroblast migrasjon er cAMP-avhengig. For å forstå den nedstrøms mekanisme, tok vi en direkte ennå mangefasettert tilnærming.
For å identifisere proteiner assosiert og i samspill med MRP4, immunopresipitert vi MRP4 holdige makromolekylære komplekser fra HEK293 celler som over uttrykker MRP4. Ved hjelp av massespektrometri, identifiserte vi flere MRP4-samspill proteiner og analysert deres tilkoblinger ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA). IPA er et nyttig verktøy for å analysere protein-protein interaksjoner (både strukturelle og funksjonelle) og utforske sine bidrag spesielt fysiologisk og patologiskhendelser basert på litteratur og eksperimentelle bevis 15,16. IPA viste at F-aktin er et viktig mål nedstrøms av MRP4 i sammenheng med cellemigrering hvor cAMP og cGMP er nøkkelen signalmolekyler 17. Disse dataene ble ytterligere bekreftet ved høyt innhold av mikroskopi. Høy innhold mikroskopi kan fange opp og analysere celle atferd som for eksempel celle migrasjon i en mer praktisk, nøyaktig og høy gjennomstrømming måte 18. De høye innhold mikroskopi data viser at virkningen av MRP4 på fibroblast-migrasjon er fullstendig opphevet ved forstyrrelse av aktin cytoskjelettet eller inhibering av PKA 17.
I tillegg brukte vi en Förster resonans energi overføring (FRET) -baserte PKA sensor til å overvåke PKA dynamikken i trekkende celler i sanntid. FRET-baserte kinase sensorer består vanligvis av spesifikke fosforylering underlaget peptider flankert av CFP og YFP fluorophores 19-21. pmAKAR3 er en forbedret og megmbrane målrettet FRET baserte PKA sensor som inneholder gaffelhode-forbundet domene 1 (FHA1) og PKA underlaget sekvens LRRATLVD 5,22. Fosforylering av pmAKAR3 av PKA katalytiske subenheten øker FRET signal mellom CFP og YFP 19. Innsetting av en lipid modifikasjon domene inn i sensoren er rettet mot det til plasmamembranen for overvåkning av PKA dynamikk, spesielt ved membran rommet 23.
Ved hjelp av pmAKAR3, vi demonstrert at den fremre kant av migrere Mrp4 - / - fibroblaster oppviste mer polarisert PKA aktivitet enn Mrp4 + / + fibroblaster, som i sin tur økte det kortikale aktin formasjonen ved cellens ledende kant 17. Sammen utgjør disse hendelsene resulterte i bedre cellulært polarisasjon og raskere retningscellemigrering i fravær av MRP4. Våre konkrete og direkte tilnærming identifisert viktige nedstrøms mål for MRP4 og gir et viktig, men somforeløpig uutforsket mekanisme for MRP4 avhengig regulering av fibroblast migrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oppfinnsomhet Pathway Analysis
- Opplasting Protein-interactome Datasett
- Sett proteiner / gener av interesse i et regneark med sine unike genet identifikatorer (helst genet symboler og genet identifikasjonsnumre som er oppnådd med massespektrometri data).
- Tildele en kolonne i regnearket for Gene identifikator nummer og en kolonne for observasjonsverdi (f.eks., Fold-endring eller p-verdi). Velg "inneholder kolonneoverskriften alternativet for å vise kolonneoverskriftene.
- Last opp datasettet på IPA ved å klikke på fanen opplasting datasettet og velge regnearket som er nevnt ovenfor. Velg fanen fleksibelt format, og velg riktig kategori av genet identifikator.
Merk: En fleksibel format av datasettet seirer formateringsspesifikasjonene for opplasting. - Etter datasettet vises, velger du ID og observasjons kolonner. Sørg for at alle proteiner (MRP4 interactome som er identifisert av masse-spectrometry) kartlegges ved å sjekke på fanen datasett sammendraget. Datasettet er nå klar for den ønskede analysen.
- Dataanalyse
Merk: Beskrevet er delvis bruk av IPA-funksjoner som ble benyttet for denne studien.- Etter opplasting MRP4 interactome med sine genet navn som de unike identifikatorer, klikk på nytt og velge kjerneanalyse i øvre venstre meny av IPA programvare.
- Innstill uttrykk cutoffs verdi for intensitet i samsvar med forsøket typen (Intensitet verdi på 100 er anbefalt for analyse).
- Beregn fold-endring i uttrykket mens han forberedte datasett om kontroll og eksperimentelle forhold er involvert og ta det som en del av datasettet filen hvis en sammenligning analyse må utføres (A cut-off verdi på 1,5 ganger endring er vanligvis anbefalt for analyse ).
Merk: Etter fullførelse av kjerneanalyse kan flere deler av analyser oppnås. Den første kategorien viser sammendrag av the samlede analyser og antyder topp kanoniske trasé, oppstrøms regulatorer, molekylære og cellulære funksjoner, og nettverk blant andre; alt beregnet basert på tillit nivå (p-verdi) og ordnet i stigende rekkefølge av p-verdi. - Åpne de store kanoniske trasé (ved hjelp av den åpne veien alternativet) som store molekylære nettverk som billedlig viser korset snakke, overlappende, og påvirkes signalveier.
Se på listen over de kanoniske trasé som er majorly involvert basert på p-verdien (p <0,05 regnes som signifikant).
Merk: Betydningen verdier for de kanoniske trasé er beregnet ved Fishers eksakte test høyre-tailed. Betydningen indikerer sannsynligheten for foreningen av molekyler fra datasettet med den kanoniske veien ved tilfeldig sjanse alene. - Bekreft inngangs proteiner (MRP4 interactome som er identifisert av massespektrometri) blant listen av proteiner som er involvert i hver vei.
Merk: Bruk av denne OPTIOn, ble det observert at den cellulære aktin cytoskjelettet aliserte nettverk er den viktigste berørte veien, og hvor inngangs proteinene passer inn i den (figur 1). Denne tilnærmingen bidrar til å identifisere hvilke molekylære nettverk vil være nært knyttet og påvirkes av test proteiner. - Bruk kategorien nettverk i analysene for å identifisere de beste sykdommer og funksjoner som er potensielt knyttet til et bestemt protein nettverk basert på antall fokus molekyler.
Merk: En score verdi er gitt basert på de kjente proteiner som fastsettes som en del av et nettverk for eksempel mobilenheten og organisasjon nettverk, gjennom litteratur kunnskap og eksperimentelle bevis og fokus molekyler som er identifisert fra datasettet og bli en del av nettverket. . Heretter blir nettverket filtrert i første omgang basert på antall fokus molekyler.
2. Høy innhold Mikros
- Utarbeidelse av celler
Merk: Alle cellekultur arbeidet ble gjort under den horisontale-flow cellekultur hette.- Bruke 96-brønners mikroplater for den sårhelende analysen.
- Belegge mikro med 1% oppløsning fibronektin (rekonstituert i PBS), og holder platen på en standard CO2 inkubator ved 37 ° C i 2 timer.
- Fjern Mrp4 - / - og Mrp4 + / + mus embryo fibroblast (MEFs) dyrket i 25 cm² cellekulturflasker fra inkubatoren, vaskes en gang med PBS, og trypsineres cellene i 5 min ved anvendelse av 1 ml av 4x trypsin-EDTA-oppløsning.
- Vask cellene med komplett medium (DMEM inneholdende 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin) og resuspender dem i 5 ml fullstendig medium.
- Aspirer fibronektin oppløsning fra brønnene. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og frø 30.000 celler (celle nummer må være optimalisert basert på celletype) i hver brønn.
- Dyrke cellene til 100% konfluens i en standardCO2 inkubator ved 37 ° C i 24 timer.
- Opprette Wound
- Sørg for at alle brønnene er fylt med løsningen. Fyll ubrukte brønner med PBS for å hindre skade på såret tagningsverktøy (f.eks., WoundMaker).
- Etter å ha bekreftet 100% celle samløpet, plasserer 96-brønns plate inne i såret gjør verktøyet på metallbunnplaten og trykk på 96 brønner pin blokk ned.
- Vask cellene tre ganger med PBS for å fjerne eventuelle løsrevne celler og tilsett 100 ul av fullstendig medium.
- Legg testforbindelsene - H-89 (50 M, 1: 1000 fortynning med komplett medier med 50 mM lager i DMSO) eller Latrunculin B (1 mikrometer, 1: 1000 fortynning med komplett medier med 1 mM lager i DMSO) på dette stadiet .
- Plasser analyseplaten inne i leseren ved 37 ° C og overvåke overføringen i løpet av den eksperimentelle perioden.
- Overvåking Cell Migration
Merk: Cell migrasjon ble overvåket ved hjelp av mikroskop og programvare provided med høyt innhold av mikroskopi system. Anvendelse av 96-brønners mikroplater sikrer at sårene blir automatisk overvåket av mikroskopet og registrert av programvaren.- Sett programvare for å skanne analysen plate hver time for migrasjon analyser ved hjelp av fanen timeplan skanningen. Velg en starttid i minst 15 minutter etter at du plasserer analyseplaten inne leseren til å tillate likevekt før bildebehandling.
- Velg skuffen og velge båttype (96-brønns mikro) og eksperimentere type (Scratch Wound).
- Velg 10X objektiv og velge fase kontrast bildeparametere. Velg brønnene som må skannes ved hjelp av alternativet redigere skanning mønster.
- Angi behandlinger grupper og eventuelle replikater ved å velge fanen egenskaper og sette opp en plate kartet. Skanning kan stoppes når som helst basert på den eksperimentelle tilstand.
- Dataanalyse
- Etter at skanningen er ferdig, velg kategorien fartøy visning for analyseplaten. Go til analysejobb verktøy og velger lansering ny analyse jobb.
- Sett scratch sår som jobbtype, og velg tidsperioden for analysen (0 tidspunkt til 24 timers tidspunkt).
- Velg brønnene for å bli valgt for analyse av et enkelt klikk på godt og klikk "OK" for å starte analysen. Når analysen er ferdig, grafisk visual relativ såret tetthet (RWD) data for hver brønn ved hvert tidspunkt ved hjelp av eksport til grafen alternativet.
- Se fasekontrastbilde sett hver brønn som tilsvarer forskjellige tidspunkter ved å bruke kategorien visningsbildet. Velg godt ved å klikke på kartet plate Velg tidspunkt fra kategorien tidsperioden og klikk på fanen visningsbildet.
3. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
- Utarbeidelse av celler
- Coat 35 mm glassbunn retter med 100 ul 1% fibronektin løsning (som beskrevet i avsnitt 2.1) og holde dem ien standard CO2 inkubator ved 37 ° C i 2 timer.
- Aspirer fibronektin løsning fra platene og frø like mange HEK293 celler (10.000 celler / plate) i komplett medium.
- Dyrke cellene til 60-70% konfluens i fibronektin belagte glassbunn retter i en standard CO2 inkubator ved 37 ° C i 24 timer.
- transfeksjon
- Utføre alle forbigående transfections ved hjelp av en kommersiell transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner.
- Delmengde 250 mL av komplett medium i to separate 1,5 ml sterile sentrifugerør for hver 35 mm tallerken.
- Tilsett 2 ug DNA (pmAKAR3 eller pmAKAR3-TA) i en tube og 5 pl (2,5 ganger den DNA-konsentrasjon) av transfeksjon reagens i et annet rør.
- Inkuber rørene i 20 minutter ved romtemperatur og deretter overføre den fortynnede DNA i transfeksjon reagensholdige rør.
- Bland godt og inkuber ved 37° C i ytterligere 30 min.
- Aspirer medium av cellene og vaskes en gang med PBS. Tilsett 1 ml av antibiotika-fritt DMEM F-12 medium inneholdende 10% FBS til cellene.
- Legg 507 ul DNA-lipid-konjugatet med mediet til cellene i hver plate, bland forsiktig, og holder i CO 2 inkubator ved 37 ° C i 48 timer. Bruk to mikrogram av DNA (1 ug / ul lager) og 5 ul lipid for 10,000-50,000 celler i hver plate.
- Levende celler Imaging
- Etter 48 timer av transfeksjon, fjerne vekstmedium og vaske cellene 2 ganger med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, forvarmet ved 37 ° C). Legge til et sluttvolum på 1,9 ml HBSS til de vaskede celler og montere dem på en omvendt bred-felt mikroskop system for avbildning FRET inne i et spesiallaget 37 ° C opprettholdes kammer.
Merk: I dette systemet, er eksitasjon lys fra en 300 W Xenon lampe dempes med en nøytral tetthet filter med 50% lys transmitterion. - Bruk 60X objektiv. Manuell fokus på cellene og sette en optimal synsfelt bruke mikroskop. Aktiver valgt synsfeltet på skjermen ved hjelp av Focus "F" på programvaren. For å utføre FRET målinger, velge riktig filter sett (CFP / YFP filtersett med en 430/25 nm eksitasjon filter, en dobbel dichroic stråledeler, og to emisjonsfiltre (470/30 nm for CFP og 535/30 nm for FRET) manuelt.
- Visualiser fluorescens ved først å sjekke om kanalvalg CFP / YFP / FRET fulgt ved å klikke åpent fluor tab. Forbedre signal intensitet ved hjelp av intensive verktøy i kategorien kameraet.
- Velg celler som uttrykker pmAKAR3 eller pmAKAR3-TA unngå metning av signalintensitet. Bruk fangstvinduet for å starte FRET måling.
- Velg time-lapse alternativ og sette opp en tid-scan i 30 min med 30 sek intervall. Merk av for alternativet gnage og sette eksponeringstiden på 100 millisekunder. Angi bilde etiketten end Trykk på Start for å starte målingen.
- Etter fem tidspunkter og etablering av et grunnlinje, tilsett 25 uM forskolin (5 pl av 10 pM lager i etanol, fortynnet med 100 ul HBSS) til cellene uten å forstyrre platen og overvåke cellene for en total av 30 min.
- Etter 48 timer av transfeksjon, fjerne vekstmedium og vaske cellene 2 ganger med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, forvarmet ved 37 ° C). Legge til et sluttvolum på 1,9 ml HBSS til de vaskede celler og montere dem på en omvendt bred-felt mikroskop system for avbildning FRET inne i et spesiallaget 37 ° C opprettholdes kammer.
- Dataanalyse
Merk: Bruk proporsjonal beregning modul for dataanalyse.- Klikk på markeringsverktøyet på venstre side av bildevinduet og velge en solid rektangel fra rullegardinmenyen. Dra rektangelet på bildefeltet i et cellefritt område og høyreklikk på den for å sette den som bakgrunn for det formål bakgrunn subtraksjon.
- Gå til masken og bruke "lage en ny maske alternativet. Gå til markeringsverktøyet, og velg en penn fra rullegardinmenyen for å tegne en maske rundt cellen manuelt å velge det for en måling. Velg minst 4-6 celler pr tilstand.
- Velg fanen Mask og utføre maske statistikk.
- Sjekk 'Hele maske ", utvide tvers av kanaler valg, og velg donor normalisert FRET (N-FRET) (FRET / CFP). N-FRET verdi er representativ for PKA aktivitet på plasmamembranen.
- Legg tidsangivelser, look-up table og skala bar med de merknader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å studere effekten av MRP4 på fibroblast migrasjon, brukte vi en sårhelende analysen utnytte høy-innhold mikros 14. Nøyaktige sår ble laget på konfluente monosjikt av MEFs isolert fra enten Mrp4 - / - eller Mrp4 + / + mus, og bilder ble tatt ved 1 time intervaller i 24 timer. Vi har observert en høyere migrasjonshastighet for Mrp4 - / - MEFs forhold til Mrp4 + / + MEFs (figur 2). Sårene ble fullstendig helbredet i mindre enn 15 timer for Mrp4 - / - MEFs, mens Mrp4 + / + MEFs kreves nesten 20 timer for å dekke sår.
Polarisert akkumulering av PKA aktivitet ved den fremre kant av migrerende celler er en nøkkel tidlig begivenhet for retnings migrasjon. PKA aktivitet kan overvåkes i sanntid using den pmAKAR3 FRET basert sensor for PKA 5,17. For å undersøke spesifisiteten av pmAKAR3 for PKA aktivitet, behandlet vi HEK293-celler som overuttrykker pmAKAR3 eller punktet mutant pmAKAR3-TA, som inneholder en treonin-til-alanin-mutasjon i substratet regionen for PKA og derfor er irresponsive til PKA fosforylering med 25 uM forskolin , en cAMP-induserende middel 14. Vi har funnet en økning i FRET signal i celler som overuttrykker pmAKAR3, men celler som overuttrykker pmAKAR3-TA forble uforandret (figur 3). Den basale FRET nivåer var også høyere i celler som uttrykker pmAKAR3 sammenlignet med de celler som uttrykker pmAKAR3-TA. Disse data indikerte at pmAKAR3 er svært spesifikke for PKA aktivitet.
I sammendrag, metodene beskrevet i protokollen seksjon er nyttige verktøy for å studere de molekylære mekanismen i forbindelse med en spesifikk cellulær hendelse.
Figur 1:. Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) av MRP4 interactome Bruke IPA aktin cytoskjelettet veien ble identifisert som en av de store kanoniske trasé berørt av MRP4 interactome. Presentert aktin signale nettverk tyder tilkoblede proteiner (hvite) og deres kors kommunikasjon med proteiner identifisert i MRP4 interactome (rosa) utledes fra litteratur og eksperimentelle bevis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 2: sårhelende analyse ved hjelp av høyt innhold Mikros Mrp4 + / + og Mrp4 - / - mus embryonale fibroblaster (MEFs) ble dyrket på fibronectin-belagte 96-brønners retter, og sår i monolagene ble gjort nøyaktig ved bruk av 96-pin sår-maker. Representative bilder på ulike tidspunkter vises med 10X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -baserte Måling av PKA aktivitet ved hjelp pmAKAR3 Sensorer Representative pseudo-fargebilder av N-FRET med 60x forstørrelse for HEK293 celler transfektert med pmAKAR3 sensor og pmAKAR3-TA sensor før og etter forskolin behandling er. vist (øverst paneler). Bilder i hvert panel ble tatt fra samme synsfelt. Color bar indikerer omfanget av N-bånd. Linjen grafen (nederst panel) representerer endringen i N-FRET nivåer etter treatment med forskolin. Data representerer gjennomsnittet av minst tre uavhengige forsøk (Mean ± SEM, n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35 mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in 100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why? Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
