Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

أساليب لدراسة Mrp4 تحتوي على المجمعات ضخم في تنظيم الخلايا الليفية الهجرة

Published: May 19, 2016 doi: 10.3791/53973
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2
1Division of Pulmonary Medicine, Department of Pediatrics, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

MRP4 ينظم العديد من الفعاليات الإشارات التي تعتمد على النوكليوتيدات دوري بما في ذلك دور توضيح مؤخرا في الهجرة الخلية. وصفنا نهج مباشرة، ولكن متعدد الأوجه لكشف أهداف جزيئية المصب MRP4 مما أدى إلى التعرف على interactome MRP4 الفريد الذي يلعب دورا رئيسيا في التنظيم صقل للهجرة الخلايا الليفية.

Abstract

أدوية المتعددة المقاومة بروتين 4 (MRP4) هو عضو في الأسرة كاسيت ATP ملزم لنقل غشاء وهو نقل هروب رأس المال الذاتية من النيوكليوتيدات الحلقية. عن طريق تحوير تركيز النوكليوتيدات الحلقية داخل الخلايا، يمكن MRP4 تنظيم العديد من الأحداث الخلوية دوري تعتمد على النوكليوتيدات بما في ذلك الهجرة الخلية. في السابق، أثبتنا أن في غياب MRP4، والخلايا الليفية تحتوي على مستويات أعلى من النيوكليوتيدات الحلقية داخل الخلايا، ويمكن أن تهاجر أسرع. لفهم الآليات الكامنة وراء هذه النتيجة، واعتمدنا نهجا مباشرا بعد متعدد الأوجه. أولا، نحن عزل بروتين المجمعات المتفاعل المحتملة للMRP4 من الإفراط في التعبير نظام خلية MRP4 باستخدام مناعي تليها مطياف الكتلة. بعد تحديد البروتينات فريدة من نوعها في interactome MRP4، نحن تستخدم الإبداع تحليل المسار (IPA) لاستكشاف دور هذه التفاعلات البروتين البروتين في سياق نقل الإشارة. نحن توضيح على بودور tential من بروتين معقد MRP4 في هجرة الخلايا والتعرف F-الأكتين كوسيط رئيسي للتأثير MRP4 على الهجرة الخلية. وأكد هذه الدراسة أيضا دور المخيم والمركب، بوصفها عنصرا رئيسيا في ظاهرة الهجرة. باستخدام المجهر عالية المحتوى، أجرينا فحوصات الخلية الهجرة وأشار إلى أن تأثير MRP4 بشأن الهجرة الخلايا الليفية وألغيت تماما من اختلال الهيكل الخلوي الأكتين أو تثبيط المخيم التي تعتمد كينيز (PKA). لتصور يشير التحويرات في خلية المهاجرة في الوقت الحقيقي، ونحن تستخدم جهاز استشعار القائم على الحنق لقياس النشاط PKA وجدت، وجود نشاط PKA أكثر استقطابا بالقرب من الحافة الأمامية من الهجرة Mrp4 - / - الليفية، مقارنة Mrp4 + / + الخلايا الليفية. وهذا بدوره زيادة تشكيل الأكتين القشرية وزيادته عملية الهجرة. نهجنا يمكن التعرف على البروتينات تعمل المصب إلى MRP4 ويوفر لنا مع علىنظرا لآلية المشاركة في التنظيم تعتمد-MRP4 للهجرة الخلايا الليفية.

Introduction

هجرة الخلية هي عملية متعددة الخطوات المعقدة. وقد أظهرت الدراسات أنه خلال خلايا الهجرة والاستقطاب في البادئة والزائدة الحواف. من خلال الالتزام المصفوفة خارج الخلية، وتنص على حافة الرائدة في الجر ضرورية لخلايا الجسم للمضي قدما. وأخيرا، فإن وراء إطلاق حافة إرفاق ملفات الخلفية واكتمال 1،2 دورة الهجرة.

وينظم الاستقطاب خلية للهجرة الخلايا كفاءة من خلال الفصل المكاني من الإشارات بين الخلايا. الخلوية رسل الثانية، مثل المخيم، توسط تجزئة الأحداث يشير اللازمة لضبطها غرامة الاتجاه 3،4 الهجرة الخلية. تراكمات التفضيلية للمخيم والتي تعتمد على مخيم كيناز النشاط PKA على حافة الرائدة تلعب أدوارا رئيسية في الاتجاه خلية الهجرة 5،6. بواسطة phosphorylating GTPases الصغيرة مثل الصلة رأس الركيزة C3 توكسين البوتولينوم (راك) والسيطرة على انقسام الخلايا بروتين 42 homolog أو Cdc42، PKوينشط المتعلقة الأكتين البروتين 2/3 (آرب 2/3) في طليعة والحث على تشكيل أقدام صفاحية 7-9. PKA أيضا phosphorylates وكيلا لمكافحة السد، حفز عائي بروتين فسفوري؛ فسوبروتين (VASP)، وبالتالي ينظم دورات متذبذبة التمديد الغشاء وتراجع 10،11.

في الخلايا، وينظم مستويات المخيم ثلاث عمليات رئيسية هي: ط) التوليفية التي محلقة محلقة، والثاني) التحلل بواسطة phosphodiesterases، وج) النقل عن طريق النقل هروب رأس المال بغشاء 3. أدوية المتعددة البروتين المقاومة 4 (MRP4)، وهو عضو في ATP ملزم كاسيت (ABC) أسرة من النقل الغشاء، وظائف باعتبارها الناقل هروب رأس المال الذاتية من النيوكليوتيدات الحلقية. لذلك، يمكن MRP4 تنظيم مستويات مخيم داخل الخلايا والخلوية التي تعتمد على المخيم مما يشير 11-13. لقد أظهرنا سابقا أن في Mrp4 - / - الليفية تحتوي على مستويات أعلى نسبيا من النيوكليوتيدات الحلقية وتهاجر أسرع جompared إلى Mrp4 + / + الخلايا الليفية 14. أبلغنا أيضا تأثير ثنائي الطور من النيوكليوتيدات الحلقية على الهجرة الليفية. وبناء على الدراسات السابقة وتقصي لدينا أن Mrp4 - / - الليفية تحتوي على المخيم أكثر استقطابا أثناء الهجرة، ونحن افترضنا أن هذا القانون بوساطة MRP4 للهجرة الخلايا الليفية هو المخيم التابعة. من أجل فهم آلية المصب، اتخذنا نهج مباشر حتى الآن على المتعدد الأوجه.

للتعرف على البروتينات المرتبطة بها وفي التفاعل مع MRP4، نحن immunoprecipitated المجمعات الجزيئات التي تحتوي على MRP4 من خلايا HEK293 التي تعبر عن مدى MRP4. باستخدام مطياف الكتلة، حددنا عدة بروتينات التفاعل MRP4 وتحليل الترابط الخاصة بهم باستخدام الإبداع تحليل المسار (IPA). IPA هو أداة مفيدة لتحليل التفاعلات البروتين البروتين (سواء الهيكلية والوظيفية) واستكشاف مساهماتها في الفسيولوجية والمرضية خاصةالأحداث على أساس الأدب والأدلة التجريبية 15،16. وأشار IPA أن F-الأكتين هو الهدف المصب الرئيسي للMRP4 في سياق الهجرة الخلية حيث المخيم والمركب هي مفتاح الجزيئات مما يشير 17. وقد تأكدت هذه المزيد من البيانات بواسطة المجهر عالية المحتوى. المجهر محتوى عال يمكن التقاط وتحليل سلوكيات الخلية مثل الهجرة خلية في أكثر ملاءمة ودقيقة وعالية الإنتاجية نحو 18 عاما. أظهرت بيانات المجهر عالية المحتوى الذي أثر MRP4 بشأن الهجرة الخلايا الليفية وألغيت تماما على اختلال الهيكل الخلوي الأكتين أو تثبيط PKA 17.

بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) القائم على استشعار PKA لمراقبة ديناميات PKA في الخلايا المهاجرة في الوقت الحقيقي. تتكون أجهزة الاستشعار كيناز القائم على الحنق عادة من الببتيدات الركيزة الفسفرة محددة يحيط بها CFP وfluorophores YFP 19-21. pmAKAR3 ومحسنة ولياستهدفت mbrane استشعار PKA أساس الحنق الذي يحتوي المصاحب forkhead نطاق 1 (FHA1) وتسلسل PKA الركيزة LRRATLVD 5،22. الفسفرة من pmAKAR3 من قبل PKA زيادات فرعية الحفازة الحنق إشارة بين CFP و YFP 19. الإدراج في مجال الدهن تعديل في استشعار يستهدف لغشاء البلازما لرصد ديناميات PKA، وتحديدا في مقصورة غشاء 23.

باستخدام pmAKAR3، أثبتنا أن حافة الرائدة في مجال الهجرة Mrp4 - / - الليفية عرضت النشاط PKA أكثر استقطابا من Mrp4 + / + الخلايا الليفية، والتي زادت بدورها تشكيل الأكتين القشرية على حافة الرائدة في الخلية 17. معا، وأسفرت هذه الأحداث في أفضل الاستقطاب الخلوي وهجرة الخلايا أسرع الاتجاه في غياب MRP4. حددت لدينا نهج محدد ومباشر أهداف المصب الرئيسية للMRP4 ويوفر مهم، ولكن كمامن بعد آلية غير المكتشفة لتنظيم تعتمد-MRP4 للهجرة الخلايا الليفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الإبداع تحليل المسار

  1. تحميل البروتين interactome الإدراجات
    1. إدراج البروتينات / الجينات من الاهتمام في جدول مع معرفات من الجينات فريدة من نوعها (ويفضل رموز الجينات وأرقام معرف الجين كما تم الحصول عليها مع البيانات الطيفي الشامل).
    2. تعيين عمود واحد في جدول البيانات عن عدد الجينات معرف وعمود واحد لقيمة الرصد (على سبيل المثال، أضعاف تغيير أو القيمة الاحتمالية). حدد 'يحتوي على رأس العمود "خيار لعرض عناوين الأعمدة.
    3. تحميل مجموعة البيانات على IPA عن طريق النقر على علامة التبويب تحميل مجموعة البيانات واختيار جدول البيانات المذكورة أعلاه. اختر علامة التبويب صيغة مرنة، واختيار الفئة المناسبة من معرف الجينات.
      ملاحظة: صيغة مرنة للبيانات يتغلب على مواصفات التنسيق للتحميل.
    4. بعد ظهور بيانات، تحديد الهوية والمراقبة الأعمدة. التأكد من أن جميع من البروتينات (MRP4 interactome كما حددها الشامل ليرة سوريةectrometry) يتم تعيينها عن طريق فحص على علامة التبويب ملخص البيانات. مجموعة البيانات هو الآن على استعداد لتحليل المطلوب.
  2. تحليل البيانات
    ملاحظة: وصفت هي الاستخدامات جزئية من الميزات IPA التي استخدمت في هذه الدراسة.
    1. بعد تحميل MRP4 interactome مع أسماء الجينات، كما معرفات فريدة من نوعها، انقر على الجديد واختيار التحليل الأساسي في القائمة العلوية اليسرى من البرنامج IPA.
    2. تعيين قيمة انقطاع التعبير عن شدة وفقا لنوع التجربة (ينصح قيمة كثافة 100 لتحليلها).
    3. حساب التغير أضعاف في التعبير في حين تستعد مجموعة البيانات إذا الرقابة والتجريبية الظروف المعنية وإدراجه كجزء من ملف بيانات إذا كان تحليل مقارنة يحتاج إلى أن يقوم (ينصح عادة قيمة قطع من 1.5 تغيير أضعاف للتحليل ).
      ملاحظة: بعد الانتهاء من التحليل الأساسي، مقاطع متعددة من التحليلات ويمكن الحصول على. تعرض علامة التبويب الأول ملخص عشره مجموع التحليلات ويقترح أعلى الممرات الكنسي، والمنظمين المنبع، وظائف الجزيئية والخلوية وشبكات وغيرها. كل محسوبة على أساس مستوى الثقة (القيمة ع) ومرتبة في ترتيب تصاعدي من قيمة ص.
    4. فتح الممرات الرئيسية الكنسي (باستخدام الخيار مسار مفتوح) شبكات الجزيئية الكبيرة والتي تظهر بالصور عبر الحديث، والتداخل، وأثرت على مسارات إشارات.
      نظرة على قائمة مسارات الكنسي التي مجورلي المعنية على أساس القيمة الاحتمالية (ع <يعتبر 0.05 بالمهم).
      ملاحظة: يتم حساب القيم أهمية لمسارات الكنسي بواسطة اختبار فيشر بالضبط الذيل بزر الماوس الأيمن. وتشير إلى أهمية احتمال ارتباط جزيئات من بيانات مع المسار الكنسي عن طريق الصدفة العشوائية وحدها.
    5. تأكيد البروتينات الإدخال (MRP4 interactome كما حددها مطياف الكتلة) ضمن قائمة من البروتينات المشاركة في كل مسار.
      ملاحظة: استخدام هذا OPTIOن، لوحظ أن الهيكل الخلوي أكتين شبكة الإشارات الخلوية هي مسار المتضررين الرئيسيين وكيف البروتينات المدخلات تنسجم مع ذلك (الشكل 1). هذا النهج يساعد على تحديد الشبكات التي الجزيئية شأنها أن تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا وتتأثر البروتينات الاختبار.
    6. استخدم علامة التبويب الشبكة في التحاليل للتعرف على أهم الأمراض والوظائف التي يحتمل أن تكون مرتبطة بشبكة البروتين معينة استنادا إلى عدد من الجزيئات التركيز.
      ملاحظة: يتم إعطاء قيمة النتيجة على أساس البروتينات المعروفة التي يتم تحديدها في إطار مثل الشبكة، والتجمع الخلوي وشبكة منظمة، من خلال المعرفة والأدب والأدلة التجريبية وتركز الجزيئات التي يتم تحديدها من مجموعة البيانات وتصبح جزءا من الشبكة. . من الآن فصاعدا، ويحصل على تصفية الشبكة في المقام الأول على أساس عدد من الجزيئات التركيز.

المجهر 2. المحتوى العالي

  1. إعداد الخلايا
    ملاحظة: تم إجراء جميع أعمال زراعة الخلايا تحت الأفقي تدفق الخلية هود الثقافة.
    1. استخدام 96-جيدا microplates للمقايسة التئام الجروح.
    2. معطف صفيحة مع 1٪ محلول فبرونيكتين (تشكيلها في برنامج تلفزيوني)، والحفاظ على لوحة في القياسية CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    3. إزالة Mrp4 - / - وMrp4 + / + ماوس الليفية الجنينية (MEFS) التي تزرع في 25 سم ² قوارير ثقافة خلية من الحاضنة، وغسل 1 مرة مع برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين الخلايا لمدة 5 دقائق باستخدام 1 مل من 4X حل التربسين-EDTA.
    4. غسل الخلايا مع المتوسطة كاملة (DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين) و resuspend منهم في 5 مل من المتوسط ​​الشامل.
    5. نضح الحل فبرونيكتين من الآبار. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات والبذور 30000 الخلايا (يحتاج عدد الخلايا إلى أن يكون الأمثل على أساس نوع من الخلايا) في كل بئر.
    6. تنمو الخلايا إلى 100٪ التقاء في مستوىCO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. خلق الجرح
    1. ضمان تمتلئ جميع الآبار مع الحل. ملء الآبار غير المستخدمة مع برنامج تلفزيوني لمنع الأضرار التي لحقت أداة جعل الجرح (على سبيل المثال، WoundMaker).
    2. بعد التأكد 100٪ خلية التقاء، وضع لوحة 96-جيدا داخل أداة جعل الجرح على قاعدة لوحة معدنية والضغط على كتلة دبوس 96-جيدا أسفل.
    3. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي خلايا فكها وإضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة.
    4. إضافة مركبات اختبار - H-89 (50 ميكرومتر، 1: 1000 تخفيف مع وسائل الإعلام كاملة باستخدام 50 الاسهم ملم في DMSO) أو Latrunculin ب (1 ميكرومتر، 1: 1000 تخفيف مع وسائل الإعلام كاملة باستخدام 1 الأسهم ملم في DMSO) في هذه المرحلة .
    5. وضع لوحة فحص داخل القارئ عند 37 درجة مئوية ومراقبة الهجرة خلال الفترة التجريبية.
  3. الهجرة خلية المراقبة
    ملاحظة: تم رصد هجرة الخلية باستخدام المجهر وبرامج العلاقات العامةovided مع نظام المجهر عالية المحتوى. استخدام 96-جيدا microplates يضمن أن الجروح تتم مراقبتها تلقائيا بواسطة المجهر وسجلت من قبل البرنامج.
    1. تعيين البرنامج لمسح لوحة فحص كل ساعة لفحوصات الترحيل باستخدام علامة التبويب جدول الفحص. تحديد وقت البدء لا يقل عن 15 دقيقة بعد وضع لوحة فحص داخل القارئ للسماح للموازنة قبل التصوير.
    2. حدد علبة واختيار نوع السفينة (96 جيدا صفيحة) ونوع التجربة (خدش الجرح).
    3. حدد الهدف 10X واختيار المعلمات التصوير على النقيض من المرحلة. حدد الآبار التي تحتاج إلى أن تفحص باستخدام الخيار تحرير مسح نمط.
    4. تحديد مجموعة من العلاجات وأي مكررات عن طريق اختيار علامة التبويب خصائص ووضع خريطة لوحة. المسح يمكن وقفها في أي وقت بناء على حالة تجريبية.
  4. تحليل البيانات
    1. بعد الانتهاء من المسح الضوئي، وحدد علامة التبويب عرض السفينة لوحة الفحص. Gس لتحليل المرافق المهمة وحدد إطلاق تحليل جديد وظيفة.
    2. تعيين الجرح الصفر كنوع العمل وتحديد النطاق الزمني ل(نقطة زمنية 0 إلى نقطة زمنية 24 ساعة) تحليل.
    3. حدد الآبار التي سيتم اختيارها لتحليلها من قبل بنقرة واحدة على البئر وانقر فوق "موافق" لبدء تحليل. وبمجرد الانتهاء من التحليل، بوضوح تصور البيانات النسبي كثافة الجرح (RWD) لكل بئر في كل نقطة زمنية باستخدام التصدير إلى الخيار الرسم البياني.
    4. عرض مجموعة الصور على النقيض من المرحلة من كل المقابلة بشكل جيد لمختلف نقاط وقت باستخدام علامة التبويب عرض صورة. اختر بئر معين عن طريق النقر على الخريطة لوحة، وتحديد نقطة زمنية محددة من علامة التبويب نطاق الوقت وانقر فوق علامة التبويب عرض صورة.

3. نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق)

  1. إعداد الخلايا
    1. معطف 35 ملم أطباق ذات قاع زجاجي مع 100 ميكرولتر من 1٪ محلول فبرونيكتين (كما هو موضح في القسم 2.1) والاحتفاظ بها فيمعيار CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    2. نضح الحل فبرونيكتين من لوحات وبأعداد متساوية البذور من خلايا HEK293 (10000 خلية / لوحة) في المتوسط ​​كاملة.
    3. تنمو الخلايا إلى 60-70٪ التقاء في الفيبرونكتين أطباق ذات قاع الزجاج المطلي في معيار CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. ترنسفكأيشن
    1. أداء جميع تعداء عابرة باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. قسامة 250 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة إلى قسمين 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي معقمة منفصلة لكل طبق 35 ملم.
    3. إضافة 2 ميكروغرام من الحمض النووي (pmAKAR3 أو pmAKAR3-TA) في أنبوب واحد و 5 ميكرولتر (2.5 أضعاف تركيز الحمض النووي) من كاشف ترنسفكأيشن في أنبوب آخر.
    4. احتضان الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم نقل الحمض النووي المخفف في ترنسفكأيشن أنبوب التي تحتوي على كاشف.
    5. تخلط جيدا واحتضان عند 37° مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
    6. نضح المتوسط ​​قبالة الخلايا وغسلها مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من خالية من المضادات الحيوية DMEM F-12 متوسطة تحتوي على 10٪ FBS إلى الخلايا.
    7. إضافة 507 ميكرولتر من المكورات الحمض النووي الدهون مع وسائل الإعلام إلى الخلايا في كل لوحة، وتخلط بلطف، والحفاظ في الحاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. استخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي (1 ميكروغرام / الأسهم ميكرولتر) والدهون 5 ميكرولتر ل10،000-50،000 الخلايا في كل لوحة.
  3. التصوير الخلية الحية
    1. بعد 48 ساعة من ترنسفكأيشن، وإزالة المتوسطة النمو وغسل الخلايا 2 مرات مع محلول ملحي متوازن هانك (HBSS، قبل تحسنت في 37 ° C). إضافة الحجم النهائي من 1.9 مل HBSS إلى خلايا غسلها وجبل لهم على نظام المجهر واسعة المجال المقلوب للتصوير الحنق داخل حسب الطلب 37 ° C حافظ غرفة.
      ملاحظة: في هذا النظام، يتم توفير ضوء الإثارة بواسطة مصباح 300 واط زينون الموهن مع مرشح الكثافة المحايدة مع 50٪ ضوء transmissأيون.
    2. استخدام الهدف 60X. التركيز يدويا على الخلايا وتحديد حقل الأمثل للعرض باستخدام المجهر. تنشيط الحقل المحدد للعرض على شاشة الكمبيوتر باستخدام خيار التركيز "F" على البرنامج. لأداء قياسات الحنق، حدد مجموعة السليم فلتر (CFP / YFP مرشح مع مجموعة 430/25 نانومتر تصفية الإثارة، مزدوج مزدوج اللون شعاع الخائن، والمرشحات الانبعاثات اثنين (470/30 نانومتر لCFP و535/30 نانومتر لالحنق) يدويا.
    3. تصور مضان عن طريق فحص أولا على الخيار قناة CFP / YFP / الحنق تليها النقر التبويب فلور مفتوحة. تحسين كثافة إشارة باستخدام أداة تكثيف في علامة التبويب الكاميرا.
    4. حدد الخلايا معربا عن pmAKAR3 أو pmAKAR3-TA تجنب تشبع من شدة إشارة. استخدام إطار القبض على الشروع في قياس الحنق.
    5. حدد الخيار مرور الزمن والإعداد وقت المسح لمدة 30 دقيقة مع فاصل زمني 30 ثانية. التحقق من الخيار الحنق وضبط الوقت التعرض في 100 مللي ثانية. أدخل تسمية صورةد الصحافة تبدأ لبدء القياس.
    6. بعد خمس نقاط من الوقت وإنشاء خط الأساس، إضافة 25 ميكرومتر من forskolin (5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر الأسهم في الإيثانول، المخفف مع 100 ميكرولتر من HBSS) إلى الخلايا دون إزعاج لوحة ومراقبة الخلايا ليصبح المجموع 30 دقيقة.
  4. تحليل البيانات
    ملاحظة: استخدام وحدة حساب ratiometric لتحليل البيانات.
    1. انقر على أداة مختارة على الجانب الأيسر من نافذة الصورة واختيار مستطيل الصلبة من القائمة المنسدلة. اسحب مستطيل على حقل صورة في منطقة خالية من خلية وانقر على الحق في ذلك لأنها مجموعة كخلفية لغرض الطرح الخلفية.
    2. انتقل إلى قناع واستخدام 'إنشاء جديد قناع' الخيار. انتقل إلى أداة اختيار واختيار القلم من القائمة المنسدلة لوضع قناع حول الخلية يدويا لتحديده لقياس. حدد على الأقل 4-6 خلايا لكل حالة.
    3. حدد علامة التبويب قناع وإجراء إحصاءات قناع.
    4. تحقق "قناع كامل، وتوسيع الخيار عبر قناة وحدد المانحة الحنق تطبيع (N-الحنق) (الحنق / CFP). قيمة N-الحنق هو ممثل النشاط PKA في غشاء البلازما.
    5. إضافة طوابع الوقت، ننظر متابعة الجدول وحجم شريط باستخدام شروحه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدراسة تأثير MRP4 بشأن الهجرة الخلايا الليفية، استخدمنا فحص التئام الجروح باستخدام عالية المحتوى المجهري 14. وقدمت الجروح دقيقة عن الطبقات الوحيدة متموجة من MEFS معزولة عن أي Mrp4 - / - أو اتخذت Mrp4 + / + الفئران، وصور في 1 فترات ساعة لمدة 24 ساعة. لاحظنا معدل الهجرة العالي للMrp4 - / - MEFS مقارنة Mrp4 + / + MEFS (الشكل 2). وتلتئم الجروح تماما في أقل من 15 ساعة لMrp4 - / - MEFS، في حين أن Mrp4 + / + MEFS يتطلب ما يقرب من 20 ساعة لتغطية الجروح.

تراكم الاستقطاب النشاط PKA في طليعة من الخلايا المهاجرة هو حدث في وقت مبكر رئيسيا للهجرة الاتجاه. يمكن رصد النشاط PKA في النقيب في الوقت الحقيقيز استشعار تستند الحنق-pmAKAR3 لPKA 5،17. للتحقق من خصوصية pmAKAR3 للنشاط PKA، كنا نعامل HEK293 الخلايا overexpressing pmAKAR3 أو نقطة متحولة pmAKAR3-TA، والذي يحتوي على طفرة ثريونين إلى ألانين في المنطقة الركيزة لPKA وبالتالي فهو لا يستجيب لPKA الفسفرة مع 25 ميكرومتر forskolin ، وكيل يحفز المخيم 14. لقد وجدنا زيادة في إشارة الحنق في خلايا overexpressing pmAKAR3، ولكن ظلت خلايا overexpressing pmAKAR3-TA دون تغيير (الشكل 3). القاعدية الحنق وكانت مستويات أعلى أيضا لخلايا معربا عن pmAKAR3 مقارنة مع الخلايا معربا عن pmAKAR3-TA. وأشارت هذه البيانات إلى أن pmAKAR3 غير محددة جدا للنشاط PKA.

وباختصار، فإن الطرق الموضحة في قسم البروتوكول هي أدوات مفيدة لدراسة الآلية الجزيئية المرتبطة مع الحدث الخلوي معين.

"الشكل تم التعرف الإبداع تحليل المسار (IPA) من MRP4 Interactome عن طريق IPA الهيكل الخلوي الأكتين المسار باعتباره واحدا من الممرات الكنسي الرئيسية تتأثر interactome MRP4: الشكل 1. تشير قدمت شبكة الأكتين إشارات بروتينات متصلة (أبيض) وعبر تواصلهم مع البروتينات التي تم تحديدها في interactome MRP4 (الوردي) يستدل من الأدب والتجريبية الأدلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
. الشكل 2: الفحص باستخدام الميكروسكوب نسبة عالية التئام الجروح Mrp4 + / + وMrp4 - / - كانت تزرع الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) على fibronectin المغلفة أطباق 96-جيدا، وقدمت الجروح في الطبقات الوحيدة على وجه التحديد باستخدام 96-دبوس الجرح صانع. وتظهر الصور التمثيلية في نقاط زمنية مختلفة مع التكبير 10x. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): فورستر الرنين نقل الطاقة (الحنق) القائم على قياس آخر PKA باستخدام pmAKAR3 مجسات التمثيلية الصور الزائفة لون N-الحنق مع 60X التكبير لHEK293 الخلايا transfected مع جهاز استشعار pmAKAR3 وأجهزة الاستشعار pmAKAR3-TA قبل وبعد العلاج forskolin هي. عرض (لوحات العليا). تم التقاط الصور في كل لوحة من نفس مجال الرؤية. يشير شريط اللون حجم N-الحنق. الرسم البياني خط (اللوحة السفلية) يمثل التغير في مستويات N-الحنق بعد المعاملهر مع forskolin. تمثل البيانات بمعدل لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة (يعني ± SEM، ن = 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 2000 Invitrogen(Carlsbad, CA)  11668-027
DMEM Invitrogen (Carlsbad, CA)  11965-092
IncuCyte Zoom Essen BioScience
96-well IncuCyte Image-Lock microplates  Essen BioScience 4493
Latrunculin B Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). L5288 Stock in DMSO
H-89 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) BML-EI196 Stock in DMSO
35 mm glass-bottomed dishes  (MatTek Corporation; Ashland, MA) P35G-1.5-20-C 
Fibronectin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). F1141
Opti-MEM Reduced Serum Media Invitrogen (Carlsbad, CA)  31985-088
FRET microscopy system Olympus inverted microscope (IX51)
CCD camera  Hamamatsu, Japan ORCA285
SlideBook software 5.5 Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)
Ingenuity Pathway Analysis software IPA, QIAGEN Redwood City,
Forskolin Tocris (Ellisville, MO).  1099 Stock in 100% EtOH
DMEM F-12   Invitrogen (Carlsbad, CA)  11330-057
HBSS Invitrogen (Carlsbad, CA)  14025-134
Excel Microsoft
PBS Invitrogen(Carlsbad, CA)  10010-023
Trypsin/EDTA Solution (TE) Invitrogen(Carlsbad, CA)  R-001-100
Penicillin-Streptomycin Invitrogen(Carlsbad, CA)  15140-122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  2. Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
  3. Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why? Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
  4. Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
  5. Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
  6. Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
  7. Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
  8. Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
  9. Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
  10. Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
  11. Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
  12. Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
  13. Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
  14. Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
  15. Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
  16. Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
  17. Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
  18. Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
  19. Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
  20. Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
  21. Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
  22. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
  23. Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
  24. Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
  25. Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
  26. Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
  27. Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
  28. Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 111، أدوية المتعددة المقاومة بروتين 4 (MRP4)، أكتين، التي تعتمد على مخيم بروتين كيناز (PKA)، الهجرة، الإبداع تحليل المسار (IPA)، عالية المحتوى المجهري، فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق).
أساليب لدراسة Mrp4 تحتوي على المجمعات ضخم في تنظيم الخلايا الليفية الهجرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinha, C., Arora, K., Naren, A. P.… More

Sinha, C., Arora, K., Naren, A. P. Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration. J. Vis. Exp. (111), e53973, doi:10.3791/53973 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter