Summary
MRP4- regelt verschiedene zyklische Nukleotid-abhängige Signalereignisse einschließlich einer kürzlich aufgeklärte Rolle bei der Zellmigration. Wir beschreiben eine direkte, aber vielschichtigen Ansatz, um die nachgelagerten molekularen Targets von MRP4- zu entwirren bei der Identifizierung eines einzigartigen MRP4- Interaktom führt, die Schlüsselrollen in der fein abgestimmten Regulierung der Fibroblasten-Migration spielt.
Abstract
Multidrug resistance protein 4 (MRP4-) ist ein Mitglied der ATP-bindenden Kassette Familie von Membrantransportern und ist ein endogenes Effluxtransporter zyklischer Nukleotide. Durch die Modulation der intrazellulären zyklischen Nukleotid-Konzentration kann MRP4- mehrere zyklische Nukleotid-abhängige zelluläre Ereignisse, einschließlich der Zellmigration regulieren. Zuvor haben wir gezeigt, in der Abwesenheit von MRP4, dass Fibroblastzellen höheren intrazellulären zyklischen Nukleotide enthalten und schneller migrieren können. Um die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Erkenntnis verstehen, nahmen wir einen direkten noch mehrdimensionalen Ansatz. Zunächst isolierten wir potentielle Interacting Protein-Komplexe von MRP4- aus einer MRP4- Überexpression Zellsystem Immunpräzipitation durch Massenspektrometrie gefolgt werden. Nach der Identifizierung einzigartigen Proteine im MRP4 Interaktom verwendeten wir Ingenuity Pathway Analysis (IPA), um die Rolle dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen im Rahmen der Signaltransduktion zu untersuchen. Wir erläutert die potential Rolle des MRP4 Proteinkomplex in Zellmigration und identifiziert F-Actin als Hauptmediator der Wirkung von MRP4 auf die Zellmigration. Diese Studie betonte auch die Rolle von cAMP und cGMP als wichtige Akteure in der Migrationsphänomene. Mit High-Content-Mikroskopie, führten wir Zell-Migration-Assays und beobachtet, dass die Wirkung von MRP4- auf Fibroblasten-Migration vollständig durch die Störung des Aktin-Zytoskelett oder Hemmung der cAMP-abhängige Kinase A (PKA) wird abgeschafft. Signalisierungs Modulationen in einem migrierenden Zellen in Echtzeit sichtbar zu machen, haben wir eine FRET-basierten Sensor zur Messung PKA - Aktivität verwendet , und die Anwesenheit von mehr polarisiertem PKA - Aktivität in der Nähe der Vorderkante des wandernden MRP4 gefunden - / - Fibroblasten, im Vergleich zu MRP4 + / + Fibroblasten. Dies wiederum kortikalen Aktin Bildung erhöht und verstärkt den Prozess der Migration. Unser Ansatz ermöglicht die Identifizierung der Proteine stromabwärts MRP4- wirkenden und bietet uns eine überAnsicht des Mechanismus in MRP4-abhängige Regulierung von Fibroblastenmigration beteiligt.
Introduction
Die Zellmigration ist ein kompliziertes Mehrstufenverfahren. Studien haben gezeigt, dass sich bei der Migration Zellen polarisiert in Vorder- und Hinterkanten. Durch die Einhaltung der extrazellulären Matrix stellt die Vorderkante die Traktion, die für die Zellkörper nach vorne zu bewegen. Schließlich rundet die Hinterkante Releases Nachläufer und den Migrationszyklus 1,2.
Zellpolarisation für eine effiziente Zellmigration wird durch räumliche Trennung von intrazellulären Signal geregelt. Cellular second messenger wie cAMP, vermitteln die Kompartimentierung der Signalereignisse , die für fein abgestimmte Richtungszellmigration 3,4. Bevorzugte Ansammlungen von cAMP und cAMP-abhängige Kinase PKA - Aktivität an der Vorderkante spielen Schlüsselrollen in Richtungszellmigration 5,6. Durch phosphorylating kleinen GTPasen wie Ras-bezogene C3 Botulinumtoxin Substrat (rac) und Zellteilungskontrollprotein 42 Homolog oder Cdc42, PKA aktiviert Aktin-verwandtes Protein 2/3 (Arp 2/3) an der Vorderkante und induziert die Bildung von Lamellipodien 7-9. PKA phosphoryliert auch eine anti-capping agent, stimuliert Vasodilatator Phosphoprotein (VASP), wodurch der 10,11 Schwingungszyklen von Membran Ausfahren und Einziehen steuert.
In den Zellen werden die cAMP - Spiegel durch drei wesentliche Prozesse geregelt: i) Synthese von Adenylatcyclase, ii) Abbau durch Phosphodiesterasen, und iii) Transport von membrangebundenen Efflux - Transporter 3. Multidrug resistance protein 4 (MRP4), ein Mitglied der ATP-bindende-Kassette (ABC) Familie von Membrantransportern, Funktionen als endogene Effluxtransporter cyclischer Nucleotide. Daher kann MRP4- intrazellulären cAMP - Spiegel regulieren und cAMP-abhängige zelluläre Signalgebung 13.11. Schneller c enthalten relativ höhere zyklische Nukleotide, Fibroblasten und wandern - / - Wir haben das in MRP4- zuvor gezeigt ,ompared zu MRP4 + / + 14 - Fibroblasten. Wir berichteten auch eine zweiphasige Wirkung zyklischer Nukleotide auf Fibroblasten-Migration. Basierend auf früheren Studien und unsere Feststellung , daß MRP4 - / - Fibroblasten im Verlauf der Migration polarisierter cAMP enthalten, die Hypothese aufgestellt , dass diese MRP4-vermittelte Regulation der Fibroblasten - Migration ist cAMP abhängig. Um den nachgeschalteten Mechanismus zu verstehen, haben wir einen direkten noch mehrdimensionalen Ansatz.
Um die Proteine im Zusammenhang und im Zusammenspiel mit MRP4- identifizieren, immunpräzipitierten wir MRP4- enthaltende makromolekulare Komplexe aus HEK293-Zellen, die über MRP4- auszudrücken. Mit Massenspektrometrie identifizierten wir mehrere MRP4--interagierende Proteine und analysiert, um ihre Vernetzung mit Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA ist ein nützliches Werkzeug Protein-Protein-Wechselwirkungen (sowohl strukturelle als auch funktionelle) und erkunden ihre Beiträge insbesondere physiologischen und pathologischen AnalyseEreignisse auf der Grundlage der Literatur und experimentelle Beweise 15,16. IPA zeigte , dass F-Aktin ein Hauptziel von Downstream MRP4 im Rahmen der Zellmigration ist , wo cAMP und cGMP die Schlüssel sind Signalmoleküle 17. Diese Daten wurden weiter bestätigt durch High-Content-Mikroskopie. High-Content - Mikroskopie kann die Zell Verhaltensweisen wie Zellmigration in eine bequemere, präzise und mit hohem Durchsatz 18 Art und Weise zu erfassen und zu analysieren. Die High-Content - Mikroskopie Daten zeigten , dass die Wirkung von MRP4 auf Fibroblasten - Migration vollständig auf Unterbrechung des Actin - Cytoskeletts oder Hemmung von PKA 17 aufgehoben wird.
Darüber hinaus haben wir ein Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte PKA Sensor die PKA Dynamik bei der Migration von Zellen in Echtzeit zu überwachen. FRET-Kinase - Sensoren bestehen meist aus spezifischen Phosphorylierungssubstrat Peptiden flankiert von CFP und YFP Fluorophore 19-21. pmAKAR3 ist eine verbesserte und michmbrane gezielte FRET-basierten PKA - Sensor, der forkhead-assoziierte Domäne 1 (FHA1) und der PKA Substratsequenz LRRATLVD 5,22 enthält. Die Phosphorylierung von pmAKAR3 durch die PKA katalytische Untereinheit erhöht FRET - Signals zwischen CFP und YFP 19. Insertion einer Lipidmodifikation Bereich in den Sensor richtet es an die Plasmamembran für PKA Dynamik überwacht wird , speziell an der Membrankammer 23 auf .
Mit pmAKAR3 haben wir gezeigt , dass die Vorderkante MRP4- der Migration - / - Fibroblasten zeigten mehr polarisiert PKA - Aktivität als MRP4- + / + Fibroblasten, was wiederum die kortikalen Aktin Formation 17 an der Zelle Vorderkante erhöht. Zusammen führten diese Ereignisse zu einer besseren zellulären Polarisation und schnellere Richtungszellmigration in Abwesenheit von MRP4-. Unsere spezifischen und direkten Ansatz Schlüssel nachgelagerten Ziele für MRP4- identifiziert und stellt eine wichtige, aber wieaus bislang unerforschten Mechanismus für MRP4--abhängige Regulation von Fibroblasten-Migration.
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Protocol
1. Ingenuity Pathway Analysis
- Hochladen von Protein-Interaktom Dataset
- Legen Sie die Proteine / Gene von Interesse in einer Tabelle mit ihrer einzigartigen Gen-IDs (vorzugsweise Gensymbole und Gen-ID-Nummern wie mit massenspektrometrischer Daten erhalten).
- Weisen Sie eine Spalte in der Tabelle für Gene Identifizierungsnummer und eine Spalte für Beobachtungswert (z. B. Falten-Änderung oder p-Wert). Wählen Sie die 'enthält Spaltenüberschrift' Option, um die Spaltenüberschriften zu sehen.
- Laden Sie den Datensatz auf der IPA, indem Sie auf den Upload-Datensatzes Registerkarte klicken und die Auswahl die Tabelle oben erwähnt. Wählen Sie das flexible Registerkarte Format, und wählen Sie die entsprechende Kategorie der Gen-Kennung.
Hinweis: Ein flexibles Format des Datensatzes überwindet die Formatierungsangaben für das Hochladen. - Nachdem der Datensatz angezeigt wird, wählen ID und Beobachtung Spalten. Stellen Sie sicher, dass die Proteine alle (MRP4- Interaktom identifiziert, wie durch Massen spectrometry) werden durch die Überprüfung auf dem Datensatz Zusammenfassung Registerkarte abgebildet. Der Datensatz ist nun bereit für die gewünschte Analyse.
- Datenanalyse
Anmerkung: Beschrieben werden die Teil Verwendungen von IPA Funktionen, die für diese Studie verwendet wurden.- MRP4- Interaktom mit ihren Gen Namen wie die eindeutige Kennungen, klicken Sie auf neu und wählen Kernanalyse in der oberen linken Menü von IPA-Software Nach dem Hochladen.
- Stellen Sie den Ausdruck Cutoffs Wert für Intensität in Übereinstimmung mit dem Experiment Typ (Intensitätswert von 100 ist für die Analyse empfohlen).
- Berechnen Sie den fold change in Ausdruck, während die Datenmenge vorbereitet, wenn die Kontrolle und experimentellen Bedingungen beteiligt sind, und schließen Sie sie als Teil des Datensatzes Datei, wenn eine Vergleichsanalyse durchgeführt werden muss (A Cut-off-Wert von 1,5-fache Veränderung ist in der Regel für die Analyse empfohlen ).
Anmerkung: Nach Beendigung der Kernanalyse kann mehrere Abschnitte von Analysen erhalten werden. Die erste Registerkarte zeigt die Zusammenfassung der the Gesamt Analysen und schlägt oben kanonische Wege, Upstream-Regulatoren, molekulare und zelluläre Funktionen und Netzwerke unter anderem; jeweils bezogen auf das Konfidenzniveau (p-Wert) und angeordnet in aufsteigender Reihenfolge von p-Wert berechnet. - Öffnen Sie die wichtigsten kanonischen Pfade (die offene Bahn-Option) als große molekulare Netzwerke, die bildlich Übersprechen zeigen, überlappende, und die betroffenen Signalwege.
Schauen Sie sich die Liste der kanonischen Pfade, die auf der p-Wert majorly beteiligt sind, basieren (p <0,05 als signifikant betrachtet).
Hinweis: Die Bedeutung Werte für die kanonische Wege berechnet werden von Fisher-Test rechts-tailed. Die Bedeutung gibt die Wahrscheinlichkeit der Assoziation von Molekülen aus dem Datensatz mit dem kanonischen Weg durch Zufall allein. - Bestätigen Sie die Eingabe-Proteine (MRP4- Interaktom wie durch Massenspektrometrie identifiziert) unter der Liste der Proteine, die in jedem Weg beteiligt.
Hinweis: Mit dieser Option, wurde beobachtet , dass die zelluläre Aktin - Zytoskelett Signalisierungsnetz der Haupt betroffenen Weg ist und wie die Eingangs Proteine hineinpassen (Abbildung 1). Dieser Ansatz hilft festzustellen, welche würden molekulare Netzwerke eng und durch die Testproteine betroffen zugeordnet werden. - Verwenden der Registerkarte Netzwerk in den Analysen, die oben Krankheiten und Funktionen zu identifizieren, die möglicherweise an ein bestimmtes Protein Netzwerk von der Anzahl der Fokusmolekülen verknüpft sind.
Hinweis: Ein Score - Wert wird auf den bekannten Proteine gegeben , welche im Rahmen eines Netzwerks zum Beispiel bestimmt werden, Zellaufbau und Organisationsnetzwerk, durch die Literatur Wissen und experimentelle Beweise und konzentrieren sich Moleküle , die aus dem Datensatz identifiziert und zu einem Teil des Netzwerks. . Von nun an wird das Netz in erster Linie auf der Anzahl der Fokusmolekülen filtriert.
2. High-Content-Mikroskopie
- Herstellung von Zellen
Hinweis: Alle Zellkulturarbeiten wurden unter der Horizontalen-Flow Zellkultur Haube getan.- Verwenden Sie 96-well Mikrotiterplatten für den Wundheilungstest.
- Bestreichen Sie die Mikrotiterplatte mit 1% Fibronektin - Lösung (Rekonstitution in PBS), und halten Sie die Platte in einem Standard - CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 2 Stunden.
- Entfernen MRP4 - / - und MRP4 + / + Maus embryonale Fibroblasten (MEF) in 25 cm² Zellkulturflaschen aus dem Inkubator gezüchtet, wäscht 1 mal mit PBS und trypsinize die Zellen für 5 min unter Verwendung von 1 ml 4x Trypsin-EDTA - Lösung.
- Waschen der Zellen mit vollständigem Medium (DMEM, enthaltend 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin) und resuspendieren sie in 5 ml des vollständigen Mediums.
- Saugen Sie das Fibronektin-Lösung aus den Vertiefungen. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Samen 30.000 Zellen (Zellzahl muss optimiert werden, basierend auf Zelltyp) in jede Vertiefung.
- Wachsen die Zellen zu 100% Konfluenz in einer StandardCO 2 Inkubator bei 37 ° C für 24 Std.
- Erstellen Wunde
- Stellen Sie sicher, alle Brunnen mit Lösung gefüllt sind. Füllen Sie die nicht verwendeten Wells mit PBS Schäden an der Wunde zu machen Werkzeug zu verhindern (z. B. WoundMaker).
- Nach der Bestätigung, nach unten zu 100% Zellkonfluenz, legen Sie die 96-Well-Platte in der Wunde zu machen Werkzeug auf der Metallgrundplatte und drücken Sie den 96-Loch-Stiftblock.
- Waschen Sie die Zellen drei Mal mit PBS keine abgelöste Zellen zu entfernen, und 100 ul vollständigem Medium hinzufügen.
- Fügen Sie die Testverbindungen - H-89 (50 & mgr; M; 1: 1000 Verdünnung mit kompletter Medien unter Verwendung von 50 mM Lager in DMSO) oder Latrunculin B (1 & mgr; M; 1: 1000 Verdünnung mit komplettem Medium mit 1 mM Lager in DMSO) in diesem Stadium .
- Legen Sie die Testplatte im Inneren des Lesers bei 37 ° C und überwachen Migration über den Versuchszeitraum.
- Überwachung Zellmigration
Hinweis: Die Zellmigration wurde das Mikroskop und Software pr überwacht mitovided mit Mikroskopiesystem mit hohem Gehalt. Die Verwendung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wird sichergestellt, dass die Wunden durch das Mikroskop automatisch überwacht werden und die von der Software eingetragen.- Stellen Sie die Software jede Stunde die Testplatte für Migrationsassays Reiter den Zeitplan Scan zu scannen. Wählen Sie eine Startzeit mindestens 15 Minuten nach der Testplatte im Inneren des Lesers Platzierung Ausgleich vor der Bildgebung zu ermöglichen.
- Wählen Sie das Fach und wählen Schiffstyp (96-Well-Mikroplatten) und Experiment-Typ (Scratch Wunde).
- 10X-Objektiv auswählen und Phasenkontrast-Bildgebung Parameter wählen. Wählen Sie die Vertiefungen, die mit dem Bearbeiten Scanmuster Option gescannt werden müssen.
- Geben Sie die Behandlungen Gruppen und alle Replikate von den Eigenschaften Registerkarte Auswahl und eine Platte Karte einrichten. Das Scannen kann jederzeit auf der experimentellen Bedingung basierend gestoppt werden.
- Datenanalyse
- Nach Abschluss der Prüfung durchgeführt wird, wählen Sie die vessel Registerkarte für die Assayplatte. Go auf die Analyse Job-Dienstprogramme und wählen Sie Start neue Analyse Job.
- Stellen Kratzwunde als Job-Typ und wählen Sie den Zeitbereich für die Analyse (0 Zeitpunkt bis 24 Stunden Zeitpunkt).
- Wählen Sie die Wells werden für die Analyse durch einen einzigen Klick auf den gut gewählt und klicken Sie auf "OK", um die Analyse zu starten. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, visualisiert grafisch relativ Wunde Dichte (RWD) Daten für jeden gut zu jedem Zeitpunkt in die Grafik-Option Export.
- Sehen Sie sich die Phasenkontrast-Bild Satz von jeder Vertiefung zu unterschiedlichen Zeitpunkten entsprechen, die Ansicht Bild Reiter. Wählen Sie einen bestimmten gut auf dem Teller Karte klicken, wählen Sie einen bestimmten Zeitpunkt aus dem Bereich Registerkarte Zeit und klicken Sie auf die Ansicht Registerkarte Bild.
3. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
- Herstellung von Zellen
- Mantel 35 mm Glasbodenschalen mit 100 ul 1% Fibronektin-Lösung (wie in Abschnitt 2.1) und halten sie inein Standard - CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 2 Stunden.
- Saugen Sie das Fibronektin-Lösung von den Platten und Samen zu gleichen Teilen aus HEK293-Zellen (10.000 Zellen / Platte) in komplettem Medium.
- Wachsen die Zellen zu 60-70% Konfluenz in den mit Fibronectin beschichteten Glasbodenschalen in einem Standard - CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 24 Std.
- Transfection
- Führen Sie alle transienten Transfektionen Kommerzielle Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Aliquot 250 ul vollständigem Medium in zwei getrennte 1,5 ml sterilen Zentrifugenröhrchen für jede 35-mm-Schale.
- In 2 ug DNA (pmAKAR3 oder pmAKAR3-TA) in einem Rohr und 5 ul (2,5 die DNA-Konzentration fach) von Transfektionsreagenz in ein anderes Rohr.
- Inkubieren der Röhrchen für 20 min bei Raumtemperatur und anschließend die verdünnte DNA in das Transfektionsreagenz enthaltende Rohr übertragen.
- Gut mischen und bei 37° C für weitere 30 min.
- Saugen Sie das Medium aus den Zellen und waschen Sie sie einmal mit PBS. 1 ml antibiotikafreies DMEM F-12 Medium mit 10% FBS zu den Zellen.
- In 507 & mgr; l DNA-Lipid - Konjugat mit Medien zu den Zellen in jeder Platte, vorsichtig mischen und halten in der CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 48 Stunden. Verwenden Sie 2 ug DNA (1 ug / ul Lager) und 5 ul Lipid für 10.000-50.000 Zellen in jeder Platte.
- Live-Cell-Imaging-
- Nach 48 Stunden der Transfektion Wachstumsmedium zu entfernen und die Zellen 2 mal mit Hanks Balanced Salt Solution waschen (HBSS, bei 37 vorgewärmt ° C). Fügen Sie ein Endvolumen von 1,9 ml HBSS zu den gewaschenen Zellen und montieren sie auf einem invertierten Weitfeldmikroskop für die FRET-Bildgebung in einem maßgeschneiderten 37 ° C gehalten Kammer.
Hinweis: In diesem System wird das Anregungslicht durch eine 300 W Xenon-Lampe mit einem Neutraldichtefilter mit 50% Lichttransmiss abgeschwächt bereitgestelltIon. - Verwenden Sie 60X Ziel. Fokus manuell auf die Zellen und stellen ein optimales Sichtfeld des Mikroskops. Aktivieren Sie den gewählten Sichtfeld auf dem Computer-Bildschirm auf der Software des Fokus "F" Option. FRET-Messungen Zur Durchführung, wählen Sie die richtige Filtersatz (CFP / YFP-Filter-Set mit einem 430/25 nm Anregungsfilter, ein Doppel dichroitischer Strahlteiler und zwei Emissionsfiltern (470/30 nm für CFP und 535/30 nm für FRET) manuell.
- Visualisieren Fluoreszenz durch erste Überprüfung auf der Kanaloption CFP / YFP / FRET gefolgt von offenen fluor Registerkarte klicken. Verbessern Sie die Signalintensität durch die Intensivierung Werkzeug in der Kamera Reiter.
- Markieren Sie die Zellen exprimieren pmAKAR3 oder pmAKAR3-TA Sättigung der Signalintensität zu vermeiden. Verwenden Sie das Aufnahmefenster FRET-Messung zu initiieren.
- Wählen Sie die Zeitraffer-Option und das Setup eine zeit Scan für 30 Minuten mit 30 Sekunden Intervall. Überprüfen Sie die FRET-Option und stellen Sie die Belichtungszeit bei 100 ms. Geben Sie das Bild ein Etikettd starten, drücken Sie die Messung zu starten.
- Nach fünf Zeitpunkten und die Errichtung einer Basislinie, fügen Sie 25 & mgr; M Forskolin (5 ul 10 uM Lager in Ethanol, verdünnt mit 100 ul HBSS) zu den Zellen, ohne die Platte zu stören und die Zellen für insgesamt 30 Minuten zu überwachen.
- Nach 48 Stunden der Transfektion Wachstumsmedium zu entfernen und die Zellen 2 mal mit Hanks Balanced Salt Solution waschen (HBSS, bei 37 vorgewärmt ° C). Fügen Sie ein Endvolumen von 1,9 ml HBSS zu den gewaschenen Zellen und montieren sie auf einem invertierten Weitfeldmikroskop für die FRET-Bildgebung in einem maßgeschneiderten 37 ° C gehalten Kammer.
- Datenanalyse
Hinweis: Verwenden Sie ratiometrischem Berechnungsmodul für die Datenanalyse.- Klicken Sie auf das Auswahlwerkzeug auf der linken Seite des Bildfensters und wählen Sie ein festes Rechteck aus dem Drop-Down-Menü. Ziehen Sie das Rechteck auf dem Bildfeld in einem zellfreien Bereich und rechten Maustaste darauf, sie als Hintergrund zu setzen für die Zwecke der Untergrundsubtraktion.
- Gehen Sie auf die Maske und verwenden "erstellen Sie eine neue Maske 'Option. Gehen Sie auf die Auswahlwerkzeug und wählen Sie aus dem Dropdown-Menü einen Stift von Hand um die Zelle eine Maske zu ziehen, um sie auszuwählen für eine Messung. Wählen Sie mindestens 4-6 Zellen pro Bedingung.
- Wählen Sie die Registerkarte Maske und führen Maske Statistiken.
- Prüfen "Gesamte Maske ', erweitern Cross-Channel-Option und wählen Spender normalisierte FRET (N-FRET) (FRET / CFP). Der N-FRET-Wert ist repräsentativ für PKA-Aktivität an der Plasmamembran.
- In Zeitmarken, Look-Up-Tabelle und Maßstabsleiste die Anmerkungen verwenden.
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Representative Results
Um die Wirkung von MRP4- auf Fibroblasten - Migration untersuchen, verwendeten wir eine Wundheilungsassay unter Verwendung von High-Content - Mikroskopie 14. Precise Wunden wurden auf konfluenten Monolayern von MEFs hergestellt , isoliert aus entweder MRP4 - / - oder MRP4 + / + Mäusen, und die Bilder wurden in 1 h Intervallen für 24 h entnommen. Wir beobachteten eine höhere Migrationsrate für MRP4- - / - MEFs im Vergleich zu MRP4- + / + MEF (Abbildung 2). Die Wunden wurden in weniger als 15 Stunden für die MRP4- vollständig geheilt - / - MEFs, während die MRP4- + / + MEFs fast 20 Stunden benötigt , um die Wunden abzudecken.
Polarisiert Anhäufung von PKA-Aktivität an der Vorderkante Zellen der Migration ist ein Schlüssel frühes Ereignis für die gerichtete Migration. PKA-Aktivität kann in Echtzeit überwacht werden using der pmAKAR3 FRET-basierten Sensor für PKA 5,17. Um die Spezifität von pmAKAR3 für PKA-Aktivität überprüfen behandelten wir HEK293-Zellen überexprimieren pmAKAR3 oder die Punktmutante pmAKAR3-TA, die eine Threonin-zu-Alanin-Mutation an der Substratbereich für PKA enthält und deshalb ist irresponsive an PKA-Phosphorylierung mit 25 & mgr; M Forskolin , ein cAMP-induzierenden Mittel 14. Wir fanden eine Zunahme in FRET - Signal in Zellen pmAKAR3 überexprimieren, aber Zellen pmAKAR3-TA überexprimieren blieb unverändert (Abbildung 3). Die basale FRET Niveaus für Zellen auch höher waren pmAKAR3 exprimieren im Vergleich zu den Zellen pmAKAR3-TA exprimieren. Diese Daten zeigten, dass pmAKAR3 ist sehr spezifisch für PKA-Aktivität.
Zusammenfassend sind die Methoden in dem Protokoll beschrieben nützliche Werkzeuge, um den molekularen Mechanismus mit einer spezifischen zellulären Ereignis zugeordnet zu studieren.
Abb . 1: Ingenuity Pathway Analysis (IPA) von MRP4- Interaktom Mit IPA Aktinzytoskelett Weg wurde als eine der wichtigsten kanonischen Wege identifiziert durch MRP4- Interaktom betroffen. Präsentiert Aktin Signalisierungsnetz zeigt verbundenen Proteine (weiß) und deren Querkommunikation mit der identifizierten Proteine in der MRP4- Interaktom (pink) abgeleitet aus der Literatur und experimentelle Beweise. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur sehen.
. Abbildung 2: Wundheilungs Assay High Content Mikroskopie mit MRP4- + / + und MRP4- - / - embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) wurden auf fibrone gewachsen96-Well-Platten CTIN beschichtet, und Wunden in den Monoschichten wurden genau mit dem 96-poligen wundBauers. Repräsentative Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten werden mit 10 - facher Vergrößerung dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3 Bild: Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -basierte Messung der PKA - Aktivität unter Verwendung von pmAKAR3 Sensoren Repräsentative Pseudo-Farbbilder von N-FRET mit 60X Vergrößerung für HEK293 Zellen , die mit pmAKAR3 Sensor und pmAKAR3-TA - Sensor vor und nach Forskolin Behandlung. gezeigt (oben Platten). Bilder in jeder Platte wurden aus dem gleichen Sichtfeld erfasst. Farbbalken zeigt die Größe der N-FRET. Das Liniendiagramm (unten) stellt die Änderung in N-FRET-Spiegel nach treatment mit Forskolin. Die Daten stellen den Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten (Mittelwert ± SEM, n = 3). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35 mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in 100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
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