Summary
MRP4 reglerar olika cykliska nukleotid-beroende signalering händelser inklusive en nyligen klar roll i cellmigration. Vi beskriver en direkt, men olika angreppssätt för att reda ut nedströms molekylära mål av MRP4 resulterar i identifiering av en unik MRP4 interactome som spelar nyckelroller i finjusteras reglering av fibroblast migration.
Abstract
Multiresistens protein 4 (MRP4) är en medlem av den ATP-bindande kassett familj av membrantransportörer och är en endogen effluxtransportören av cykliska nukleotider. Genom att modulera intracellulär cyklisk nukleotid koncentration, kan MRP4 reglera flera cykliska nukleotid-beroende cellulära händelser, inklusive cellmigration. Tidigare visade vi att i avsaknad av MRP4, fibroblastceller innehåller högre halter av intracellulära cykliska nukleotider och kan migrera snabbare. För att förstå de bakomliggande mekanismerna för detta konstaterande, antog vi en direkt ändå mångfacetterad strategi. Först isolerade vi potentiella samverkande proteinkomplex av MRP4 från en MRP4 överuttryck cellsystem med hjälp av immunoprecipitation följt av masspektrometri. Efter att ha identifierat unika proteiner i MRP4 interactome, utnyttjade vi Påhittighet Pathway Analysis (IPA) för att utforska rollen av dessa protein-proteininteraktioner i samband med signaltransduktion. Vi klar potial roll MRP4 proteinkomplexet i cellmigrering och identifierade F-aktin som en viktig mediator av effekten av MRP4 på cellmigration. Denna studie underströk också betydelsen av cAMP och cGMP som nyckelspelare i migrationsfenomenet. Med hjälp av hög halt mikroskopi, utförde vi cellmigrationsanalyser och observerade att effekten av MRP4 på fibroblast migration är helt avskaffas genom avbrott i aktincytoskelettet eller inhibering av cAMP-beroende kinas A (PKA). Att visualisera signalering modulationer i en vandrande cell i realtid, utnyttjade vi en FRET-baserad sensor för mätning av PKA-aktivitet och fann, närvaron av mer polariserad PKA aktivitet i närheten av den främre kanten av migrerande Mrp4 - / - fibroblaster, jämfört med Mrp4 + / + fibroblaster. Detta i sin tur ökad kortikal aktin bildning och förstärkt processen för migration. Vår strategi möjliggör identifiering av proteinerna som agerar nedströms till MRP4 och ger oss en överutsikt över deltar i MRP4 beroende reglering av fibroblast migration mekanism.
Introduction
Cellmigration är en komplicerad flerstegsprocess. Studier har visat att under migrationsceller är polariserade i främre och bakre kanter. Genom att följa den extracellulära matrisen, ger framkant drag nödvändig för cellkroppen att röra sig framåt. Slutligen bakkants släpper bakre fästen och slutför migreringen cykeln 1,2.
Cell polarisering för effektiv cellmigration regleras av rumslig segregering av intracellulär signalering. Cellular andra budbärare, såsom cAMP, medierar uppdelning av de signaleringshändelser som erfordras för finjusteras riktad cellmigration 3,4. Preferens ansamlingar av cAMP och cAMP-beroende kinas PKA aktivitet i framkant spelar nyckelroller i riktad cell migration 5,6. Genom fosforylering små GTPaser såsom Ras relaterade C3 botulinumtoxin substrat (Rac) och celldelning kontrollprotein 42 homolog eller Cdc42, PKA aktiverar aktin-relaterat protein 2/3 (Arp 2/3) vid framkanten och inducerar bildandet av lamellipodia 7-9. PKA fosforylerar också en anti-kapslingsmedel, vasodilator stimulerade fosfoprotein (VASP), därigenom reglerar oscillerande cykler av membran förlängning och indragning 10,11.
I celler, är cAMP-nivåer regleras av tre huvudprocesser: i) syntes genom adenylatcyklas, ii) nedbrytning av fosfodiesteraser, och iii) transport av membranbundna uttransportörer 3. Multiresistens protein 4 (MRP4), en medlem av ATP-bindande kassett (ABC) familj av membrantransportörer, fungerar som en endogen effluxtransportören av cykliska nukleotider. Därför kan MRP4 reglera intracellulära cAMP-nivåer och cAMP-beroende cellulära signalerings 11-13. Vi har tidigare visat att i Mrp4 - / - fibroblaster innehåller relativt höga halter av cykliska nukleotider och migrera snabbare compared till Mrp4 + / + fibroblaster 14. Vi rapporterade också en bifasisk effekt av cykliska nukleotider på fibroblast migration. Baserat på tidigare studier och vår slutsats att Mrp4 - / - fibroblaster innehåller mer polariserad cAMP under migration, hypotes vi att detta MRP4-medierad reglering av fibroblast migration är cAMP-beroende. För att förstå nedströms mekanismen, tog vi en direkt ändå mångfacetterad strategi.
För att identifiera proteiner associerade och i samspel med MRP4, immunoprecipiterade vi MRP4 innehållande makromolekylära komplex från HEK293-celler som överuttrycker MRP4. Använda masspektrometri identifierade vi flera MRP4-interagerande proteiner och analyseras deras sammankoppling med hjälp av Uppfinningsrikedom Pathway Analysis (IPA). IPA är ett användbart verktyg för att analysera protein-proteininteraktioner (både strukturella och funktionella) och utforska sina bidrag i synnerhet fysiologiska och patologiskahändelser baserade på litteratur och experimentella bevis 15,16. IPA indikerade att F-aktin är en stor nedströms mål av MRP4 inom ramen för cellmigration där cAMP och cGMP är nyckeln signalmolekyler 17. Dessa data bekräftades ytterligare genom hög halt mikroskopi. Hög halt mikroskopi kan fånga och analysera cell beteenden såsom cellmigration i ett mer praktiskt, noggrann och hög genomströmning sätt 18. Mikroskopi data av hög-innehåll visade att effekten av MRP4 på fibroblast migration är helt avskaffas vid avbrott i aktin cytoskelettet eller hämning av PKA 17.
Dessutom använde vi en Förster resonansenergiöverföring (FRET) -baserade PKA sensor för att övervaka de PKA dynamiken i migrerande celler i realtid. FRET-baserade kinas sensorer består vanligtvis av särskilda fosforylering substratpeptider flankerad av GFP och YFP fluoroforer 19-21. pmAKAR3 är en förbättrad och jagmbrane riktade FRET-baserade PKA sensor som innehåller forkhead-associerad domän 1 (FHA1) och PKA substratsekvensen LRRATLVD 5,22. Fosforylering av pmAKAR3 av PKA katalytiska subenheten ökningar FRET signal mellan GFP och YFP 19. Införing av en lipid modifiering domän i sensorn är inriktad den till plasmamembranet för att övervaka PKA dynamik, speciellt på membranavdelningen 23.
Med användning pmAKAR3 visade vi att den främre kanten av migrerande Mrp4 - / - fibroblaster uppvisade mer polariserad PKA aktivitet än Mrp4 + / + fibroblaster, vilket i sin tur ökade den kortikala aktin bildning vid cellens främre kant 17. Tillsammans utgör dessa händelser lett till bättre cellulär polarisering och snabbare riktad cellmigrering i frånvaro av MRP4. Vår specifika och direkt metod identifierat viktiga nedströms mål för MRP4 och utgör en viktig, men somav ännu outforskade mekanism för MRP4 beroende reglering av fibroblast migration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Påhittighet Pathway Analys
- Uppladdning Protein-interactome dataset
- Sätt i proteiner / generna av intresse i ett kalkylblad med sina unika gen identifierare (företrädesvis gen symboler och gen identifikationsnummer som erhållits med spektrometriska uppgifter mass).
- Tilldela en kolumn i kalkylbladet för Gene identifieringsnummer och en kolumn för observationell värde (eg., Vik-förändring eller p-värde). Välj "innehåller kolumnrubriken" alternativ för att visa kolumnrubrikerna.
- Ladda upp dataset på IPA genom att klicka på fliken uppladdnings dataset och välja kalkylblad som nämns ovan. Välj fliken flexibelt format, och välja lämplig kategori av genen identifierare.
Obs: Ett flexibelt format för dataset vinner formaterings specifikationer för uppladdning. - Efter dataset visas väljer ID och observations kolumner. Se till att alla av proteinerna (MRP4 interactome identifierad genom mass-spectrometry) kartläggs genom att kontrollera på fliken dataset sammanfattningen. Den dataset är nu redo för den önskade analysen.
- Dataanalys
Notera: Beskrivna är de partiella användningar av IPA funktioner som har använts för denna studie.- Efter uppladdning MRP4 interactome med sina gen namn som unika identifierare, klicka på nytt och välja kärn analys i övre vänstra menyn av programvara IPA.
- Ställa in expressions cutoffs värde för intensiteten i enlighet med den typ experimentet (Intensitet värde på 100 rekommenderas för analys).
- Beräkna flerfaldiga förändringen i uttryck vid utarbetandet av dataset om kontroll och experimentella betingelser är inblandade och inkludera det som en del av dataset filen om en jämförelseanalys måste utföras (A cut-off värde av 1,5 gånger förändring brukar rekommenderas för analys ).
Obs: Efter fullbordan av kärnan analys kan flera avsnitt av analyser erhållas. Den första fliken visar sammanfattningen av the totalt analyser och föreslår bästa kanoniska vägar, uppströms tillsynsmyndigheter, molekylära och cellulära funktioner och nätverk bland andra; alla beräknats baserat på en konfidensnivå (p-värde) och anordnade i stigande ordning efter p-värde. - Öppna stora kanoniska vägar (genom den öppna vägen tillval) som stora molekylära nätverk som bildmässigt visar tvär prata, överlappande, och påverkade signalvägar.
Titta på listan över de kanoniska vägar som majorly är inblandade baserat på p-värde (p <0,05 anses vara signifikant).
Obs: betydelsen värdena för de kanoniska vägar beräknas genom Fishers exakta test höger tailed. Betydelsen anger sannolikheten för sammanslutning av molekyler från datamängden med den kanoniska vägen genom slumpen ensam. - Bekräfta ingångs proteiner (MRP4 interactome som identifieras genom masspektrometri) bland listan av proteiner involverade i varje bana.
Obs: Med den här option, observerades det att den cellulära aktin cytoskelettet signaleringsnätet är den huvudsakliga drabbade vägen och hur de inmatade proteiner passa in i den (fig 1). Detta tillvägagångssätt hjälper till att identifiera vilka molekylära nätverk skulle vara nära knutet till och påverkas av testproteiner. - Använd fliken nätet i de analyser för att identifiera de bästa sjukdomar och funktioner som potentiellt är kopplade till ett speciellt protein nät baserat på antal fokus molekyler.
Obs: En poäng värde ges baserat på de kända proteiner som bestäms som en del av ett nätverk t.ex. cellulär montering och organisationens nätverk, genom litteratur kunskap och experimentella bevis och fokusera molekyler som identifieras från dataset och bli en del av nätverket. . Hädanefter blir det nätverk filtreras i första hand baserad på antal fokus molekyler.
2. Hög halt Mikroskopi
- Beredning av celler
Obs: Alla cellodlings arbete skedde under den horisontella flödescellkultur huva.- Använda 96-brunnars mikroplattor för sårläknings analysen.
- Belägga mikroplattan med en% fibronektin lösning (rekonstituerades i PBS), och hålla plattan i en standard CO2-inkubator vid 37 ° C under 2 h.
- Remove Mrp4 - / - och Mrp4 + / + mus embryonala fibroblaster (MEF) odlas i 25 cm ^ cellodlingsflaskor från inkubatorn, tvätta en gång med PBS och trypsinize cellerna under 5 min med användning av en ml av 4x trypsin-EDTA-lösning.
- Tvätta cellerna med fullständigt medium (DMEM innehållande 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin) och återsuspendera dem i 5 ml komplett medium.
- Aspirera fibronektin lösningen från brunnarna. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer och utsäde 30.000 celler (mobilnummer måste optimeras baserat på celltyp) i varje brunn.
- Odla cellerna till 100% sammanflytning i en standardCO2-inkubator vid 37 ° C under 24 h.
- skapa Sår
- Se till samtliga brunnar är fyllda med lösning. Fyll oanvända brunnar med PBS för att förhindra skador på såret gör verktyget (eg., WoundMaker).
- Efter att ha bekräftat 100% cellsammanflödet, placera 96-brunnar inne i såret gör verktyget på metallplatta och tryck på 96-brunns stift kvarter ner.
- Tvätta cellerna tre gånger med PBS för att avlägsna eventuella lösgjorda celler och tillsätt 100 pl komplett medium.
- Lägg testföreningarna - H-89 (50 ^ M; 1: 1000 utspädning med kompletta media med 50 mM lager i DMSO) eller Latrunculin B (1 ^ M; 1: 1000 utspädning med komplett media med 1 mM lager i DMSO) i detta skede .
- Placera analysplattan i läsaren vid 37 ° C och övervaka migration under försöksperioden.
- Övervakning Cell Migration
Obs: Cellmigration övervakades med hjälp av mikroskop och programvara provided med hög halt mikroskopi systemet. Användning av 96-brunnars mikroplattor säkerställer att såren automatiskt övervakas av mikroskopet och registreras av mjukvaran.- Ställ in programvara för att skanna analysplattan varje timme för migrationsanalyser med hjälp av fliken schema skanningen. Välj en starttid åtminstone 15 minuter efter placering av analysplattan inuti läsaren att tillåta jämvikt före avbildning.
- Välj facket och välja fartygstyp (96 brunnar mikro) och experimentera typ (Scratch sår).
- Välj 10X objektiv och välj faskontrast avbildning parametrar. Välj de brunnar som ska skannas med alternativet redigera avsökningsmönstret.
- Ange behandlingar grupper och eventuella upprepningar genom att välja fliken egenskaper och inrätta en platta karta. Skanning kan stoppas när som helst baserat på den experimentella villkor.
- Dataanalys
- Efter skanningen är klar väljer du fartyget rutnät för analysplattan. Go analysjobb verktyg och välj lansering ny analys jobb.
- Ställ scratch sår som typ jobb och välj tidsintervall för analysen (0 tidpunkt till 24 timmar tidpunkt).
- Välj brunnarna som väljs för analys av ett enkelt klick på brunnen och klicka på "OK" för att initiera analysen. När analysen är klar, grafiskt visualisera data relativ sår densitet (RWD) för varje brunn vid varje tidpunkt med hjälp av export till grafen alternativet.
- Visa faskontrast bild uppsättning av varje brunn motsvarar olika tidpunkter med hjälp av flikvy bilden. Välj en specifik brunn genom att klicka på plattan kartan, välj en specifik tidpunkt på fliken tidsintervall och klicka på fliken visa bilden.
3. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
- Beredning av celler
- Coat 35 mm glas botten rätter med 100 pl 1% fibronektin lösning (som beskrivs i avsnitt 2.1) och hålla dem ien standard CO2-inkubator vid 37 ° C under 2 h.
- Aspirera fibronektin lösning från plattorna och utsädes lika antal HEK293-celler (10000 celler / platta) i komplett medium.
- Odla cellerna till 60-70% konfluens i fibronektin belagda glas botten rätter i en standard CO2-inkubator vid 37 ° C under 24 h.
- transfektion
- Utför alla transienta transfektioner med användning av ett kommersiellt transfektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner.
- Alikvotera 250 pl komplett medium i två separata 1,5 ml sterila centrifugrör för varje 35 mm skål.
- Tillsätt 2 mikrogram av DNA (pmAKAR3 eller pmAKAR3-TA) i ett rör och 5 pl (2,5 gånger den DNA-koncentrationen) av transfektionsreagens i ett annat rör.
- Inkubera rören i 20 minuter vid rumstemperatur och sedan överföra den utspädda DNA i transfektionsreagens innehållande rör.
- Blanda väl och inkubera vid 37° C under ytterligare 30 minuter.
- Aspirera mediet bort från cellerna och tvätta dem en gång med PBS. Tillsätt 1 ml antibiotikafritt DMEM F-12-medium innehållande 10% FBS till cellerna.
- Lägg 507 pl av DNA-lipid-konjugat med media till cellerna i varje platta, blanda försiktigt, och hålla i CO-2-inkubator vid 37 ° C under 48 h. Använda 2 ^ g av DNA (1 | ig / | il lager) och 5 | il lipid för 10,000-50,000 celler i varje platta.
- Live-cell imaging
- Efter 48 h av transfektion, avlägsna tillväxtmedium och tvätta cellerna 2 gånger med Hanks balanserade saltlösning (HBSS, förvärmd vid 37 ° C). Lägg till en slutlig volym av 1,9 ml HBSS till de tvättade cellerna och montera dem på ett inverterat brett fält mikroskop system för FRET avbildning inuti en skräddarsydd 37 ° C upprätthålls kammaren.
Obs: I detta system är excitation ljuset från en 300 W Xenon-lampa dämpas med ett neutralt densitetsfilter med 50% ljus transmissJon. - Använd 60X mål. Manuellt fokusera på cellerna och ställa in en optimal synfält med hjälp av mikroskop. Aktivera vald synfältet på datorskärmen med hjälp av fokus "F" alternativet på programvaran. För att utföra FRET mätningar välja rätt filteruppsättningen (GFP / YFP filter in med en 430/25 nm excitationsfilter, en dubbel dikroitisk strålsplittrare, och två emissionsfilter (470/30 nm för GFP och 535/30 nm för FRET) manuellt.
- Visualisera fluorescens genom att först kontrollera om kanalalternativ GFP / YFP / FRET följt genom att klicka på öppna fliken fluor. Förbättra signalintensiteten med hjälp av intensifiering verktyget på fliken kamera.
- Väljer celler som uttrycker pmAKAR3 eller pmAKAR3-TA undvika mättnad av signalintensiteten. Använd inspelningsfönstret för att initiera FRET mätning.
- Välj time-lapse alternativ och konfigurera en tids genomsökning efter 30 minuter med 30 sek intervall. Markera alternativet FRET och ställa exponeringstiden på 100 ms. Ange bildetiketten end tryck på start att påbörja mätningen.
- Efter fem tidpunkter och fastställande av en baslinje, tillsätt 25 ^ M av forskolin (5 | il av 10 | iM lager i etanol, utspäddes med 100 ul av HBSS) till cellerna utan att störa plattan och övervaka cellerna under totalt 30 min.
- Efter 48 h av transfektion, avlägsna tillväxtmedium och tvätta cellerna 2 gånger med Hanks balanserade saltlösning (HBSS, förvärmd vid 37 ° C). Lägg till en slutlig volym av 1,9 ml HBSS till de tvättade cellerna och montera dem på ett inverterat brett fält mikroskop system för FRET avbildning inuti en skräddarsydd 37 ° C upprätthålls kammaren.
- Dataanalys
Obs: Använd ratiometrisk beräkningsmodul för dataanalys.- Klicka på markeringsverktyget på den vänstra sidan av bildfönstret och välj en solid rektangel från rullgardinsmenyn. Dra rektangeln på bildfältet i ett cellfritt område och högerklicka på den för att ställa in den som bakgrund för att bakgrunden subtraktion.
- Gå till masken och använda "skapa en ny mask" alternativet. Gå till markeringsverktyget och välj en penna från rullgardinsmenyn för att rita en mask runt cellen manuellt välja det för en mätning. Välj minst 4-6 celler per tillstånd.
- Välj fliken Mask och utföra mask statistik.
- Kontrollera "Hela mask", expandera flera kanaler alternativ och välj givare normaliserad FRET (N-FRET) (FRET / GFP). N-FRET värdet är representativt för PKA-aktivitet vid plasmamembranet.
- Lägg tidsstämplar, uppslagstabell och skala bar med hjälp av anteckningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att studera effekten av MRP4 på fibroblast migration, använde vi en sårläkande analys som utnyttjar hög halt mikroskopi 14. Precisa sår gjordes på sammanflytande monoskikt av MEFs isolerade från antingen Mrp4 - / - eller Mrp4 + / + möss och bilder togs vid 1 h intervall under 24 h. Vi observerade en högre migrationshastighet för Mrp4 - / - MEF jämfört med Mrp4 + / + MEF (Figur 2). Såren helt läkt på mindre än 15 timmar för Mrp4 - / - MEF, medan Mrp4 + / + MEF krävs nästan 20 timmar för att täcka sår.
Polariserad ansamling av PKA aktivitet i framkant av migrerande celler är en viktig tidig händelse för riktad migration. PKA-aktivitet kan övervakas i realtid using den pmAKAR3 FRET-baserad sensor för PKA 5,17. För att kontrollera specificiteten hos pmAKAR3 för PKA-aktivitet behandlade vi HEK293-celler som överuttrycker pmAKAR3 eller punktmutant pmAKAR3-TA, som innehåller ett treonin-till-alanin-mutationen vid substratregion för PKA och därför är irresponsive till PKA fosforylering med 25 | iM forskolin , ett cAMP-inducerande medel 14. Vi fann en ökning av FRET signal i celler som överuttrycker pmAKAR3, men celler som överuttrycker pmAKAR3-TA förblev oförändrad (figur 3). Den basala FRET nivåer var också högre för celler som uttrycker pmAKAR3 jämfört med celler som uttrycker pmAKAR3-TA. Dessa data indikerade att pmAKAR3 är mycket specifik för PKA-aktivitet.
Sammanfattningsvis, de metoder som beskrivs i protokollet sektionen är användbara verktyg för att studera den molekylära mekanismen förknippad med en specifik cellulär händelse.
Figur 1:. Påhittighet Pathway Analysis (IPA) av MRP4 Interactome Använda IPA aktincytoskelettet pathway identifierades som ett av de stora kanoniska vägar som påverkas av MRP4 interactome. Presenterade nätverks aktin signalering indikerar anslutna proteiner (vit) och deras tvär kommunikation med de proteiner som identifierats i MRP4 interactome (rosa) härledas från litteratur och experimentella bevis. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2: sårläkande analysen med hög halt Microscopy Mrp4 + / + och Mrp4 - / - mus embryonala fibroblaster (MEF) odlades på fibronectin belagda 96-brunnar, och sår i mono gjordes exakt med 96-stifts sår-maker. Bilderna vid olika tidpunkter visas med 10x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -baserade Mätning av PKA aktivitet med hjälp av pmAKAR3 Sensorer Representativa pseudo-färgbilder N-FRET med 60X förstoring för HEK293-celler transfekterade med pmAKAR3 sensor och pmAKAR3-TA sensor före och efter forskolin behandling är. visas (övre paneler). Bilder i varje panel fångades från samma synfält. Färgfältet indikerar storleken på den N-FRET. Kurvan (bottenpanel) representerar förändringen i N-FRET nivåer efter treatment med forskolin. Data representerar medelvärdet av åtminstone tre oberoende experiment (Medelvärde ± SEM, n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35 mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in 100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why? Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
