Summary
MRP4 hücre göçü bir süre önce aydınlatılmamıştır rolü dahil olmak üzere çeşitli siklik nükleotid-bağımlı sinyal olaylarını düzenler. Biz fibroblast göçü ince ayar düzenlenmesinde önemli roller oynamaktadır benzersiz MRP4 interaktom belirlenmesi ile sonuçlanan MRP4 aşağısında moleküler hedeflerin çözülmeye doğrudan, ama çok yönlü bir yaklaşım açıklar.
Abstract
Çoklu ilaç direnci proteini 4 (MRP4) membran taşıyıcılarının ATP-bağlayıcı kaset ailesinin bir üyesi olan ve siklik nükleotidin bir endojen akış taşıyıcıdır. intraselüler siklik nükleotid konsantrasyonunun modüle edilmesiyle, MRP4 hücre göçü de dahil olmak üzere birden fazla, siklik nükleotid-bağımlı hücresel olayları ayarlayabilir. Daha önce, MRP4 yokluğunda fibroblast hücreleri, hücre içi siklik nükleotidlerin yüksek seviyelerini ihtiva edebilmekte ve daha hızlı göç göstermiştir. Bu bulgunun altında yatan mekanizmaları anlamak için, biz doğrudan ama çok yönlü bir yaklaşım benimsemiştir. İlk olarak, kütle spektrometresi, ardından imüno kullanılarak MRP4 aşırı ifadesi hücre sistemi için MRP4 potansiyel etkileşimli protein kompleksleri izole edilmiştir. MRP4 interaktom benzersiz proteinleri tanımlamak sonra sinyal iletimi kapsamında bu protein-protein etkileşimlerinin rolünü araştırmak için Ingenuity Pathway Analizi (IPA) kullanılmıştır. Biz po aydınlatılamamıştırHücre göçü üzerinde MRP4 etkisinin önemli bir aracısı olarak hücre göçü MRP4 protein kompleksinin ve tespit edilen F-aktin aşamasında potansiyel rolü. Bu çalışma aynı zamanda göçmen olayların kilit oyuncular olarak cAMP ve cGMP rolünü vurguladı. yüksek içeriği mikroskobu kullanarak, hücre göçü deneyleri gerçekleştirilmiştir ve fibroblast göçü üzerinde MRP4 etkisi tamamen cAMP bağımlı kinaz A (PKA), aktin hücre iskeletinin veya inhibisyon bozulması sonucu yok olduğunu gözlemledik. Gerçek zamanlı bir göç hücrede modülasyon sinyal görselleştirmek için, biz PKA aktivitesini ölçmek için bir FRET tabanlı sensör kullanmış ve buldum, Mrp4 göç ön kenarına yakın daha kutuplaşmış PKA aktivitesinin varlığı - / - karşılaştırıldığında fibroblast, Mrp4 + / fibroblastlar +. Bu da kortikal aktin oluşumunu artmış ve göç sürecini artar. Yaklaşımımız MRP4 için aşağı hareket proteinlerin tanımlanmasını sağlar ve bir over bize sunuyorfibroblast göçü MRP4 bağımlı düzenlenmesinde rol oynayan mekanizmanın görünümü.
Introduction
Hücre göçü karmaşık bir çoklu-aşamalı bir işlemdir. Çalışmalar göç hücreleri sırasında baştaki ve sondaki kenarları içine polarize olduğunu göstermiştir. hücre gövdesi ileriye taşımak için ekstraselüler matriks kalarak, öncü gerekli çekiş gücü sağlar. Son olarak, kenar serbest bırakır arka arka ekleri ve göç döngüsü 1,2 tamamlar.
verimli hücre göçü için hücre polarizasyon hücre içi sinyal mekansal ayrışma ile düzenlenir. Böyle cAMP gibi hücresel ikinci haberciler, ince ayarlı yönlü hücre göçü 3,4 için gerekli sinyal olaylarının compartmentalization aracılık eder. Lider kenarında cAMP ve cAMP bağımlı kinaz PKA aktivitesinin Tercihli birikimleri yönlü hücre migrasyonu 5,6 anahtar rol oynarlar. ras ile ilgili C3 botulinum toksini alt-tabaka (rac) ve hücre bölünmesi kontrol proteini 42 homolog ya da Cdc42, PK küçük GTPazlar fosforilleyerekÖnde gelen kenarında aktin-ilişkili protein 2/3 (Arp 2/3) aktive eder ve lamellipodia 7-9 oluşumunu uyarır. PKA, aynı zamanda, bir anti-başlık ajanı, fosforile, damar genişletici ve böylece membran uzatma ve geri çekme 10,11 salınım döngüsü düzenler, fosfoprotein (VASP) uyarılır.
Zara-bağlı akış taşıyıcı 3 I) Sentez adenilat siklaz, fosfodiesterazlar II) bozulması ve iii) taşıma ile: hücrelerde, cAMP seviyelerinin üç ana işlemler ile düzenlenmektedir. Çoklu ilaç direnci proteini 4 (MRP4), siklik nükleotidlerin endojen akış taşıyıcısı olarak membran ileticileri, fonksiyonların ATP-bağlayıcı kaset (ABC) ailesinin bir üyesidir. Bu nedenle, MRP4 hücre içi cAMP seviyelerini düzenleyen ve cAMP bağımlı hücre 11-13 sinyal. - / -, Fibroblastlar, siklik nükleotidlerin göreceli olarak daha yüksek seviyede içeren ve hızlı c geçiş Daha önce Mrp4 göstermiştir kiMrp4 + / + fibroblastlar 14 ompared. Biz de fibroblast göçü üzerinde döngüsel nükleotidlerin bifazik etki bildirdi. Önceki çalışmalara dayanarak ve Mrp4 bizim bulgu - / - fibroblastlar göç sırasında daha kutuplaşmış cAMP içeren fibroblast göçü bu MRP4 aracılı düzenleme cAMP bağımlı olduğunu varsaydık. aşağı mekanizmasını anlamak için, biz doğrudan ama çok yönlü bir yaklaşım aldı.
ilişkili ve MRP4 ile etkileşim içinde proteinleri tespit etmek, biz üzerinden MRP4 ifade HEK293 hücrelerinden MRP4 içeren makromoleküler kompleksleri immünopresipitasyon. kitle spektrometresi kullanarak, birden fazla MRP4-etkileşim proteinleri tespit ve Yaratıcılık Yolu Analizi (IPA) kullanarak birleştiricisi analiz edildi. IPA (yapısal ve fonksiyonel hem de), protein-protein etkileşimleri analiz ve özellikle fizyolojik ve patolojik olarak katkılarını araştırmak için bir araçtıredebiyat ve deneysel kanıtlara 15,16 dayalı olaylar. IPA cAMP ve cGMP molekülleri 17 anahtar sinyal olduğu F-aktin hücre göçü bağlamında MRP4 önemli bir alt hedef olduğunu göstermiştir. Bu veriler ayrıca, yüksek içeriği mikroskopisi ile teyit edilmiştir. Yüksek içerik mikroskopi yakalamak ve daha uygun, doğru ve yüksek verimli bir şekilde 18 gibi hücre göçü gibi hücre davranışlarını analiz edebilirsiniz. Yüksek içerik mikroskopi veri fibroblast göçü üzerinde MRP4 etkisi tamamen PKA 17 aktin hücre iskeletinin veya inhibisyon bozulması üzerine kaldırılmıştır olduğunu göstermiştir.
Ayrıca, bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) gerçek zamanlı olarak hücrelerin göç PKA dinamiklerini izlemek için PKA sensör tabanlı kullanılır. FRET tabanlı kinaz sensörleri genellikle CFP ve YFP fluorophores 19-21 çevrili özel fosforilasyon substrat peptidler oluşur. pmAKAR3 geliştirilmiş ve bana olanmbrane forkhead ilişkili alan 1 (FHA1) ve PKA substrat sekansını LRRATLVD 5,22 ihtiva FRET göre PKA sensörü hedef almıştır. PKA, katalitik alt birim artışlar pmAKAR3 fosforilasyonu CFP ve YFP 19 arasındaki sinyali FRET. Sensöre bir lipit modifikasyonu etki yerleştirilmesi özellikle zar bölmesi 23, PKA dinamiklerini izlemek için plazma membran bunu hedefliyor.
PmAKAR3 kullanarak, göstermiştir ki Mrp4 göç öncü - / - sırayla hücrenin hücum kenarı 17 kortikal aktin oluşumunu artmış Mrp4 + / + fibroblastlar, daha kutuplaşmış PKA aktivite sergiledi fibroblastlar. Birlikte, bu olaylar MRP4 yokluğunda daha iyi hücresel kutuplaşma ve daha hızlı yön hücre göçü sonuçlandı. Bizim özel ve doğrudan bir yaklaşım MRP4 için anahtar aşağı hedefler belirledik ve önemli bir sağlar, ancakfibroblast göçü MRP4 bağımlı düzenleme için henüz keşfedilmemiş bir mekanizma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yaratıcılık Yolu Analizi
- Yükleme Protein interaktom Veri kümesi
- kendilerine özgü gen tanımlayıcıları (kütle spektrometresi verileri ile elde edilen, tercihen gen sembolleri ve gen tanımlayıcı numaraları) ile bir e-tabloda ilgi proteinler / genleri yerleştirin.
- Gen tanımlayıcı numarası için e-tabloda bir sütun ve gözlemsel değeri için bir sütun atayın (örn., Fold-değişim veya p-değeri). sütun başlıklarını görüntülemek için 'sütun başlığını içeren' seçeneğini seçin.
- Yükleme veri kümesi sekmesini tıklayıp yukarıda belirtilen e-tabloyu seçerek IPA veri kümesi yükleyin. Esnek biçim sekmesini seçin ve gen tanımlayıcı uygun kategoriyi seçin.
Not: Veri kümesinin esnek biçim yüklemek için biçimlendirme spesifikasyonları üstesinden gelir. - veri seti göründükten sonra, kimliği ve gözlem sütunları seçin. Emin olun kütle-sp tanımlanan proteinlerin (MRP4 interaktom tüm buectrometry) veri kümesi özeti sekmesinde kontrol ederek eşleştirilir. veri kümesi şimdi istenen analiz için hazırdır.
- Veri analizi
Not: Bu çalışma için kullanılmıştır IPA özelliklerinin kısmi kullanımları Açıklanan vardır.- tek belirleyici olarak kendi gen isimleri ile MRP4 interaktom yükledikten sonra, yeni tıklayın ve IPA yazılımının sol üst menüde çekirdek analizini seçin.
- Deney türüne göre yoğunluğu için ifade cutoffs değerini ayarlayın (100 Yoğunluk değeri analizi için tavsiye edilir).
- kontrolü ve deneysel koşullar katılmaktadırlar ve bir karşılaştırma analizi yapılmalıdır gerekiyorsa kümesi dosyasının bir parçası olarak dahil ederseniz dataset hazırlanırken ifadesinde kat-değişim hesaplayın (1.5 kat değişim bir cut-off değeri genellikle analiz için tavsiye edilir ).
Not: Çekirdek analiz tamamlandıktan sonra analiz birden çok bölüm elde edilebilir. İlk sekme th özetini gösterirE toplam analizler ve diğerleri arasında üst kanonik yollar, yukarı düzenleyicileri, moleküler ve hücresel fonksiyonları ve ağları önerir; Tüm güven düzeyi (p değeri) göre hesaplanır ve p değeri artan sırasına göre düzenlenmiş. - resimsel örtüşen çapraz konuşma göstermek (açık yolu seçeneğini kullanarak) büyük kanonik yollar gibi büyük moleküler ağlar açın ve sinyal yolları etkilemiştir.
Majorly p-değerine dayalı işin içinde olan kanonik yollar listesine bakmak (p <0.05 anlamlı olarak kabul edilir).
Not: kanonik yollar için anlam değerleri sağ kuyruklu Fisher testi ile hesaplanmıştır. önemi yalnız rastgele tesadüfen kanonik yoluna ile dataset moleküllerin dernek olasılığını ifade etmektedir. - Her yoluna katılan proteinlerin liste arasında giriş proteinleri (kütle spektrometresi ile tanımlanan MRP4 interaktom) kontrol edin.
Not: Bu Optio kullanman, hücresel aktin hücre iskeleti sinyalizasyon ağ giriş proteinleri içine sığacak büyük etkilenen yolu ve nasıl (Şekil 1) olduğu gözlendi. Bu yaklaşım, moleküler ağlar yakından ilişkili ve test proteinleri etkilenecek hangi belirlemenize yardımcı olur. - potansiyel odak moleküllerinin sayısına dayalı belirli bir protein ağı bağlı üst hastalıkları ve işlevleri tanımlamak için analizlerde ağ sekmesini kullanın.
A skor değeri, bir ağ, örneğin bir parçası olarak belirlenir bilinen proteinlere göre verilen literatür bilgileri ve deneysel kanıtlara aracılığıyla hücresel montaj ve organizasyon ağı ve veri kümesinden tanımlanan molekülleri odaklanmak ve ağın parçası haline. Not . Bundan sonra, ağ, ağırlıklı moleküllerin sayısına göre, en başta, süzüldü alır.
2. Yüksek içerik Mikroskopi
- Hücrelerin Hazırlanması
Not: Tüm hücre kültürü çalışmaları yatay akışlı hücre kültürü kaputu altında yapıldı.- yara iyileştirici tahlili için 96 çukurlu mikrolevhaların kullanın.
- Ceket (PBS içinde yeniden)% 1 fibronektin çözeltisi ile mikroplaka, ve 2 saat boyunca 37 ° C'de standart bir CO2 inkübatör plaka tutun.
- - / - Ve Mrp4 + / + fare embriyosu akciğer fibroblast (MEF'ler) inkübatör 25 cm² hücre kültürü şişelerinde yetiştirilen 4x tripsin-EDTA çözeltisi, 1 ml ile 5 dakika boyunca hücreler, PBS ile 1 kez yıkayın ve trypsinize Mrp4 çıkarın.
- tam orta ve tam ortam 5 ml bunları tekrar süspansiyon (DMEM,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin içeren) hücreler yıkanır.
- Kuyulardan fibronektin çözüm aspire. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve her kuyuya (hücre sayısı, hücre tipine göre optimize edilmesi gerekiyor) 30.000 hücreleri tohum.
- Bir standart% 100 izdiham hücreleri büyümekCO, 24 saat boyunca 37 ° C 'de 2 inkübatör.
- oluşturma Yara
- Tüm oyuklar çözeltisi ile doldurulur emin olun. Yara yapma aracı zarar görmesini önlemek için PBS ile kullanılmayan kuyu doldurun (örneğin., WoundMaker).
- % 100 hücre izdiham onayladıktan sonra, metal taban levhası üzerinde yara yapma aracı içinde 96-plaka yerleştirin ve aşağı 96-iyi pin bloğu basın.
- herhangi bir yerinden hücreleri çıkarmak ve tam orta 100 ul eklemek için PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
- Test bileşikleri ekleyin - lH-89 (50 uM; 1: Tüm ortam DMSO içinde 50 mM stok kullanılarak 1000 seyreltme) ya da Latrunculin B (1 uM, 1: DMSO içinde 1 mM stok kullanılarak komple ortam ile 1000 seyreltme), bu aşamada .
- 37 ° C'de okuyucu içinde deney plakasını ve deneysel dönem boyunca göç izlemek.
- İzleme Hücre Göç
Not: Hücre göç mikroskop ve yazılım pr kullanılarak izlenmiştiryüksek içerik mikroskobu sistemi ile ovided. yaralar otomatik olarak mikroskop tarafından izlenir ve yazılım tarafından tescil edilmesini sağlar 96 çukurlu mikrolevhaların kullanımı.- program tarama sekmesini kullanarak göç deneyleri için deney plakası saatte tarama yazılımı olarak ayarlayın. En az 15 dakika görüntüleme önce dengeye izin okuyucu içinde tahlil plaka yerleştirdikten sonra bir başlangıç zamanını seçin.
- kaseti seçin ve damar tipi (96 kuyu mikroplaka) ve deney türünü (Scratch Yara) seçin.
- 10X objektif seçmek ve faz-kontrast görüntüleme parametrelerini seçin. düzenlemek tarama deseni seçeneği kullanılarak taranması gereken kuyu seçin.
- özellikleri sekmesini seçip bir tabak haritası kurarak tedavileri grupları ve herhangi çoğaltır belirtin. Tarama deneysel durumuna göre herhangi bir anda durdurulabilir.
- Veri analizi
- Tarama bittikten sonra, tahlil plaka için damar görüntüsü sekmesini seçin. Ganaliz iş programları ve seçin başlatmak yeni bir analiz işine o.
- iş türü olarak çizik yara ayarlayın ve analizi (24 saat zaman noktası 0 zaman noktası) için zaman aralığını seçin.
- Seçin kuyu kuyu üzerinde tek bir tıklama ile analiz için seçilmiş ve analizi başlatmak için 'Tamam' düğmesine tıklayın. Analiz yapıldıktan sonra, grafik grafik seçeneği ihracat kullanarak her zaman bir noktada her iyi için göreceli yara yoğunluğu (DWT) veri görselleştirmek.
- Her iyi görünüm görüntü sekmesini kullanarak farklı zaman noktalarında tekabül faz-kontrast görüntü setini görüntüleyin. Plaka harita üzerinde tıklayarak belirli bir kuyu seçin zaman aralığı sekmesinden belirli bir zaman noktası seçmek ve görüntülemek görüntü sekmesine tıklayın.
3. Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET)
- Hücrelerin Hazırlanması
- (Bölüm 2.1'de anlatıldığı gibi) ve saklayın% 1 fibronektin çözeltisi 100 ul ile kaplayın 35 mm cam tabanlı yemekler2 saat boyunca 37 ° C'de standart bir CO2 inkübatör.
- tam bir ortamda HEK293 hücreleri plakaları ve tohum eşit sayıda gelen fibronektin solüsyonu (10,000 hücre / plaka) aspire.
- 24 saat boyunca 37 ° C'de standart bir CO2 inkübatör fibronektin kaplı cam tabanlı tabaklar 60-70% konfluansa hücreleri büyütün.
- transfeksiyon
- üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak, tüm geçici transfeksiyonları gerçekleştirin.
- Alikosu her 35 mm çanak için iki ayrı 1.5 ml steril santrifüj tüplerine tam ortam 250 ul.
- Bir tüp, 5 ul DNA (pmAKAR3 ya pmAKAR3-TA) 2 ug bir tüp içinde transfeksiyon reaktifi (2.5 DNA konsantrasyonu katı) ekleyin.
- Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra transfeksiyon reaktifi ihtiva eden bir tüp içine seyreltilmiş DNA transferi.
- İyice karıştırın ve 37 ° C'de inkübe30 dakika daha ° C.
- hücreler kapalı orta aspire ve PBS ile bir kez yıkayın. hücreler,% 10 FBS ihtiva eden antibiyotik içermeyen DMEM F-12 ortamı içinde 1 ml.
- Her plaka hücrelere ortam DNA-lipit eşleniği 507 ul ekle yavaşça karıştırın ve 48 saat boyunca 37 ° C'de CO2 inkübatöründe tutun. Her bir plaka 10.000-50.000 hücrelerin DNA (1 ug / ml stok) ve 5 ul lipid 2 ug kullanın.
- Canlı hücre Görüntüleme
- Transfeksiyondan 48 saat sonra, Hank Dengeli Tuz Çözeltisi ile 2 kez büyüme ortamı çıkarın ve hücreleri yıkamak (HBSS, 37 ° C'de önceden ısıtılmış ° C). ısmarlama bir 37 ° C içinde, FRET görüntüleme için bir ters geniş alan mikroskop sistemi ile yıkandı, hücreler 1.9 ml HBSS bir son hacim ekleyin ve montajını bölmeyi muhafaza.
Bu sistemde, uyarma ışık% 50 ışık Telekomünikasyon, bir Nötr Yoğunluk filtresi ile zayıflatılmış bir 300 W Xenon lambası ile sağlanır: Notiyon. - 60X objektif kullanın. El ile hücrelere odaklanmak ve mikroskop kullanılarak görüş optimal alanını ayarlayın. Yazılımın odaklanın "F" seçeneğini kullanarak bilgisayar ekranında görüş seçilen alanı etkinleştirin. FRET ölçümler yapmak için, uygun filtre seti (bir 430/25 nm uyarma filtresi, bir çift dikroik ışın ayırıcı ile set OBP / YFP filtresi ve iki emisyon filtreleri FRET için (470/30 nm için OBP ve 535/30 nm) seçin manuel.
- ilk açık flor sekmesini tıklatarak ve ardından kanal seçeneği OBP / YFP / FRET üzerinde kontrol ederek floresan gözünüzde canlandırın. Kamera sekmesinde yoğunlaşması aracını kullanarak sinyal yoğunluğu geliştirin.
- sinyal yoğunluğu doygunluğunu kaçınarak pmAKAR3 veya pmAKAR3-TA ifade hücreleri seçin. FRET ölçümünü başlatmak için yakalama penceresini kullanın.
- time-lapse seçeneği ve kurulumu 30 sn aralıklarla 30 dakika süreyle bir zaman tarama seçin. FRET seçeneğini işaretleyin ve 100 milisaniye olarak poz süresini ayarlayın. görüntü etiketin girind basın ölçümünü başlatmak başlar.
- Beş zaman noktalarında ve taban kurulduktan sonra, 30 dakikalık bir toplam, hücreler plaka bozmadan hücrelere forskolin 25 uM (HBSS, 100 ul seyreltilmiş etanol içinde 10 uM stoklar, 5 ul) ekleyin ve monitör.
- Transfeksiyondan 48 saat sonra, Hank Dengeli Tuz Çözeltisi ile 2 kez büyüme ortamı çıkarın ve hücreleri yıkamak (HBSS, 37 ° C'de önceden ısıtılmış ° C). ısmarlama bir 37 ° C içinde, FRET görüntüleme için bir ters geniş alan mikroskop sistemi ile yıkandı, hücreler 1.9 ml HBSS bir son hacim ekleyin ve montajını bölmeyi muhafaza.
- Veri analizi
Not: Veri analizi için kullanın oranlı metrik hesaplama modülü.- Görüntü penceresinin sol taraftaki seçim aracı tıklayın ve açılan menüden katı bir dikdörtgen seçin. Bir hücre serbest alanda görüntü alanında dikdörtgen sürükleyin ve sağ arka plan çıkarma amacıyla arka plan olarak ayarlamak için üzerine tıklayın.
- maske gidin ve seçeneği 'yeni bir maske oluşturmak kullanabilirsiniz. seçim aracı gidin ve elle ölçüm için seçmek için hücrenin etrafına bir maske çizmek için açılır menüden bir kalem seçin. durum başına en az 4-6 hücreleri seçin.
- Maske sekmesini seçin ve maske istatistiklerini gerçekleştirin.
- 'Bütün maske' kontrol çapraz kanal seçeneği seçin donör normalize FRET (N-FRET) (FRET / OBP) genişletin. N-FRET değeri plazma membranında PKA aktivitesi temsilcisidir.
- look-up tablosu ve ölçek çubuğu ek açıklamaları kullanarak, zaman damgalarını ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fibroblast göçü üzerinde MRP4 etkisini araştırmak için, biz yüksek içerik mikroskopisi 14 kullanan bir yara iyileştirici deneyi kullanıldı. Kesin yaralar izole MEF'lerin birleşik tekli katmanları üzerinde yapılmıştır ya Mrp4 - / - ya Mrp4 + / + fareleri, ve görüntüleri 24 saat sonra 1 saatlik aralıklarla alındı. Mrp4 + / + MEF'ler (Şekil 2) göre MEF'ler - / - Bu Mrp4 için daha yüksek bir geçiş ücreti görülmektedir. Mrp4 + / + MEFS yaraları kapatmak için neredeyse 20 saat gerekli ise, MEFS - / - yaralar tamamen Mrp4 için en az 15 saat içinde iyileşti.
hücrelerin göç öncü PKA aktivitesinin Polarize birikimi yönlü göç için önemli bir erken olaydır. PKA aktivitesi Anlık usin olarak izlenebilirg PKA 5,17 için pmAKAR3 FRET tabanlı sensör. PKA aktivitesi için pmAKAR3 özgüllüğünü kontrol etmek için, pKa'sı için alt-tabaka bölgesinde bir treonin-alanine-mutasyon içerir ve bu nedenle 25 uM forskolin ile PKA fosforilasyonuna yanıtsız olan pmAKAR3 veya nokta mutantı pmAKAR3-ta, aşın ifade eden HEK293 hücreleri tedavi , bir cAMP-indükleme ajanı 14. Bu pmAKAR3 aşırı eksprese eden hücrelere FRET sinyali bir artış olduğunu, ancak pmAKAR3-TA aşırı eksprese eden hücrelere (Şekil 3) aynı kaldı. bazal seviyesi, aynı zamanda pmAKAR3-ta ifade eden hücrelere kıyasla pmAKAR3 eksprese eden hücreler daha yüksek olduğu FRET. Bu veriler pmAKAR3 PKA aktivitesi için çok spesifik olduğunu göstermektedir.
Özet olarak, iletişim kuralı bölümünde tarif edilen yöntemler, belirli bir hücre olayla ilişkili moleküler mekanizmanın çalışma için yararlı araçlardır.
Şekil 1:. MRP4 interaktom marifet Yolu Analizi (IPA) kullanarak IPA aktin hücre iskeleti yolu MRP4 interaktom etkilenen önemli kanonik yollarının biri olarak tespit edilmiştir. Sunulan aktin sinyal ağı bağlı proteinler (beyaz) ve edebiyat ve deneysel kanıtlara olayla MRP4 interaktom (pembe) tanımlanan proteinler ile çapraz iletişimi gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil 2: Yara iyileşmesi yüksek içerik Mikroskopisi kullanılarak Deneyi Mrp4 + / + ve Mrp4 - / - fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) fibrone üzerinde büyütülmüştür96 oyuklu tabaklara CTIN kaplı ve mono tabakaları yaralar 96 iğneli yara makinesi kullanılarak tam olarak yapılmıştır. Farklı zaman noktalarında Temsilcisi görüntüler 10X büyütme ile gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) pmAKAR3 Sensörler kullanarak PKA Faaliyet Ölçümü tabanlı N-FRET Temsilcisi sözde renkli görüntüler 60X büyütme ile önce ve forskolin tedavi sonrası pmAKAR3 sensörü ve pmAKAR3-TA sensörü ile transfekte HEK293 hücreler için. gösterilir (üst paneller). Her paneldeki Görüntüler aynı görüş alanından ele geçirildi. Renk çubuğu N-FRET büyüklüğünü gösterir. çizgi grafiği (alt panel) Terbiyede sonra N-FRET seviyelerinde değişimi temsilforskolin ile t. Veriler, en az üç bağımsız deneyin ortalamasını temsil (± SEM ortalama n = 3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35 mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in 100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why? Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
