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Developmental Biology

तरीके तंतुकोशिका प्रवासन के नियमन में Mrp4 युक्त macromolecular परिसर अध्ययन करने के लिए

Published: May 19, 2016 doi: 10.3791/53973
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2
1Division of Pulmonary Medicine, Department of Pediatrics, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

MRP4 सेल प्रवास में एक हाल ही में स्पष्ट भूमिका सहित विभिन्न चक्रीय न्यूक्लियोटाइड निर्भर संकेत घटनाओं को नियंत्रित करता है। हम एक अद्वितीय MRP4 interactome कि fibroblast प्रवास के ठीक-देखते विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है की पहचान में जिसके परिणामस्वरूप MRP4 के बहाव के आणविक लक्ष्यों को जानने के लिए एक सीधा, लेकिन बहुमुखी दृष्टिकोण का वर्णन है।

Abstract

बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन 4 (MRP4) झिल्ली ट्रांसपोर्टरों की एटीपी बाध्यकारी कैसेट परिवार का एक सदस्य है और चक्रीय न्यूक्लियोटाइड की एक अंतर्जात तपका ट्रांसपोर्टर है। intracellular चक्रीय न्यूक्लियोटाइड एकाग्रता नियमन करके, MRP4 सेल प्रवास सहित कई चक्रीय न्यूक्लियोटाइड निर्भर सेलुलर घटनाओं को नियंत्रित कर सकते। इससे पहले, हम दिखा दिया है कि MRP4 के अभाव में, fibroblast कोशिकाओं intracellular चक्रीय न्यूक्लियोटाइड के उच्च स्तर होते हैं और तेजी से पलायन कर सकते हैं। इस खोज के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए, हम एक सीधा अभी तक बहुमुखी दृष्टिकोण अपनाया। सबसे पहले, हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पीछा immunoprecipitation का उपयोग कर एक MRP4 अधिक अभिव्यक्ति सेल प्रणाली से संभावित MRP4 की बातचीत प्रोटीन परिसरों को अलग किया। MRP4 interactome में अद्वितीय प्रोटीन की पहचान करने के बाद, हम सरलता मार्ग विश्लेषण (आईपीए) के लिए उपयोग संकेत पारगमन के संदर्भ में इन प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की भूमिका का पता लगाने के लिए। हम पुलिस elucidatedसेल प्रवास में MRP4 प्रोटीन जटिल और सेल प्रवास पर MRP4 के प्रभाव का एक प्रमुख मध्यस्थ के रूप में पहचान एफ actin की क्षमता का भूमिका। इस अध्ययन में यह भी प्रवासी घटना में प्रमुख खिलाड़ी के रूप शिविर और cGMP की भूमिका पर बल दिया। उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, हम सेल प्रवास assays प्रदर्शन किया है और कहा है कि fibroblast प्रवास पर MRP4 का असर पूरी तरह से actin cytoskeleton या शिविर पर निर्भर काइनेज ए (PKA) के निषेध के विघटन से समाप्त कर दिया है। वास्तविक समय में एक पलायन सेल में modulations संकेत कल्पना करने के लिए, हम PKA गतिविधि को मापने के लिए एक झल्लाहट आधारित सेंसर का उपयोग किया और पाया, की Mrp4 पलायन अग्रणी धार के पास अधिक ध्रुवीकृत PKA गतिविधि की उपस्थिति - / - fibroblast, की तुलना में Mrp4 + / fibroblasts +। यह बदले में cortical actin गठन वृद्धि हुई है और प्रवास की प्रक्रिया संवर्धित। हमारा दृष्टिकोण प्रोटीन MRP4 के बहाव के अभिनय की पहचान के लिए सक्षम बनाता है और एक से अधिक के साथ हमें प्रदान करता हैfibroblast प्रवास के MRP4 निर्भर विनियमन में शामिल तंत्र का दृश्य।

Introduction

सेल प्रवास एक जटिल बहु कदम प्रक्रिया है। अध्ययनों से पता चला है कि प्रवास के दौरान कोशिकाओं के प्रमुख और अनुगामी किनारों में ध्रुवीकरण कर रहे हैं। बाह्य मैट्रिक्स का पालन करके, अग्रणी धार सेल शरीर को आगे ले जाने के लिए आवश्यक कर्षण प्रदान करता है। अंत में, अनुगामी किनारे विज्ञप्ति पीछे संलग्नक और प्रवास चक्र 1,2 पूरा करती है।

कुशल सेल प्रवास के लिए सेल ध्रुवीकरण intracellular संकेतन के स्थानिक अलगाव द्वारा विनियमित है। इस तरह के शिविर के रूप में सेलुलर दूसरा दूत, ठीक-देखते दिशात्मक सेल प्रवास 3,4 के लिए आवश्यक संकेत घटनाओं के compartmentalization मध्यस्थता। अग्रणी धार पर शिविर और शिविर पर निर्भर काइनेज PKA गतिविधि के तरजीही राशि दिशात्मक सेल प्रवास 5,6 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ऐसे रास संबंधी सी 3 बोटुलिनम टॉक्सिन सब्सट्रेट (आरएसी) और कोशिका विभाजन नियंत्रण प्रोटीन 42 Homolog या Cdc42, पी के रूप में छोटे GTPases phosphorylating द्वाराएक अग्रणी धार पर actin से संबंधित प्रोटीन 2/3 (एआरपी 2/3) को सक्रिय करता है और lamellipodia 7-9 के गठन लाती है। PKA भी एक विरोधी कैपिंग एजेंट phosphorylates, vasodilator phosphoprotein (वीएएसपी) को प्रेरित किया, जिससे झिल्ली विस्तार और त्याग 10,11 के oscillatory चक्र को नियंत्रित करता है।

झिल्ली ही सीमित तपका ट्रांसपोर्टरों 3 से adenylate साइक्लेज, द्वितीय) phosphodiesterases द्वारा क्षरण और iii) परिवहन द्वारा i) संश्लेषण: कोशिकाओं में, शिविर के स्तर के तीन प्रमुख प्रक्रियाओं द्वारा विनियमित रहे हैं। बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन 4 (MRP4), चक्रीय न्यूक्लियोटाइड की एक अंतर्जात तपका ट्रांसपोर्टर के रूप में एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) झिल्ली ट्रांसपोर्टरों, कार्यों के परिवार के एक सदस्य है। इसलिए, MRP4 intracellular शिविर के स्तर को विनियमित कर सकते हैं और शिविर पर निर्भर सेलुलर 11-13 संकेत है। हम पहले से पता चला है कि Mrp4 में - / -, fibroblasts चक्रीय न्यूक्लियोटाइड के अपेक्षाकृत उच्च स्तर होते हैं और पलायन तेजी से गMrp4 + + / fibroblasts से 14 ompared। हम यह भी fibroblast प्रवास पर चक्रीय न्यूक्लियोटाइड की एक biphasic प्रभाव की सूचना दी। पिछले अध्ययनों के आधार पर और हमारी खोज है कि Mrp4 - / - fibroblasts प्रवास के दौरान अधिक ध्रुवीकृत शिविर में होते हैं, हम धारणा है कि fibroblast पलायन के इस MRP4 की मध्यस्थता नियमन शिविर निर्भर है। आदेश के बहाव के तंत्र को समझने के लिए, हम एक प्रत्यक्ष अभी तक बहुमुखी दृष्टिकोण ले लिया।

जुड़ा हुआ है और MRP4 के साथ परस्पर क्रिया में प्रोटीन की पहचान करने के लिए, हम HEK293 कोशिकाओं पर MRP4 व्यक्त करते हैं कि MRP4 से युक्त macromolecular परिसर immunoprecipitated। जन स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करना, हम कई MRP4-बातचीत प्रोटीन की पहचान की और सरलता मार्ग विश्लेषण (आईपीए) का उपयोग कर अपने इंटरकनेक्टिविटी का विश्लेषण किया। आईपीए प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (दोनों संरचनात्मक और कार्यात्मक) का विश्लेषण और विशेष रूप से शारीरिक और रोग में उनके योगदान का पता लगाने के लिए एक उपयोगी उपकरण हैसाहित्य और प्रयोगात्मक सबूत के आधार पर 15,16 घटनाओं। आईपीए संकेत दिया एफ actin सेल प्रवास के संदर्भ में MRP4 का एक प्रमुख लक्ष्य नीचे की ओर है कि जहां शिविर और cGMP अणुओं 17 सिगनल महत्वपूर्ण हैं। इन आंकड़ों से आगे उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई। उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी पर कब्जा है और एक और अधिक सुविधाजनक सटीक और उच्च throughput ढंग से 18 में इस तरह के सेल प्रवास के रूप में सेल व्यवहार का विश्लेषण कर सकते हैं। उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी डेटा दिखा दिया है कि fibroblast प्रवास पर MRP4 का असर पूरी तरह से actin cytoskeleton या PKA 17 के निषेध के विघटन पर समाप्त कर दिया है।

इसके अतिरिक्त, हम एक Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) आधारित PKA सेंसर वास्तविक समय में कोशिकाओं पलायन में PKA गतिशीलता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया। झल्लाहट आधारित काइनेज सेंसर आमतौर पर विशिष्ट फोस्फोराइलेशन सब्सट्रेट सीएफपी और YFP fluorophores 19-21 से घिरे पेप्टाइड्स से मिलकर बनता है। pmAKAR3 एक सुधार हुआ है और मैं हूँmbrane लक्षित झल्लाहट आधारित PKA सेंसर कि forkhead जुड़े डोमेन 1 (FHA1) और PKA सब्सट्रेट अनुक्रम LRRATLVD 5,22 शामिल हैं। PKA उत्प्रेरक सबयूनिट बढ़ द्वारा pmAKAR3 के फोस्फोराइलेशन सीएफपी और YFP 19 के बीच संकेत झल्लाहट। सेंसर में एक लिपिड संशोधन डोमेन की प्रविष्टि PKA गतिशीलता की निगरानी, ​​विशेष रूप से झिल्ली डिब्बे 23 के लिए प्लाज्मा झिल्ली को यह लक्ष्य।

PmAKAR3 उपयोग करना, हम दिखा दिया है कि Mrp4 पलायन के अग्रणी धार - / - Mrp4 + + / fibroblasts, जो बारी में सेल के अग्रणी बढ़त 17 में cortical actin गठन वृद्धि की तुलना में अधिक ध्रुवीकृत PKA गतिविधि का प्रदर्शन किया fibroblasts। साथ में, इन घटनाओं के लिए बेहतर सेलुलर ध्रुवीकरण और MRP4 के अभाव में तेजी से दिशात्मक सेल प्रवास में हुई। हमारे विशेष और प्रत्यक्ष दृष्टिकोण MRP4 के लिए कुंजी नीचे की ओर लक्ष्यों की पहचान की है और एक महत्वपूर्ण प्रदान करता है, लेकिन के रूप मेंfibroblast प्रवास के MRP4 निर्भर विनियमन के लिए अभी तक बेरोज़गार तंत्र।

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Protocol

1. सरलता मार्ग विश्लेषण

  1. अपलोड प्रोटीन interactome डेटासेट
    1. अपनी अनूठी जीन पहचानकर्ता (अधिमानतः जीन प्रतीकों और जीन पहचानकर्ता संख्या बड़े पैमाने पर spectrometric डेटा के साथ प्राप्त के रूप में) के साथ एक स्प्रेडशीट में ब्याज की प्रोटीन / जीन डालें।
    2. जीन पहचानकर्ता संख्या के लिए स्प्रेडशीट में एक स्तंभ और पर्यवेक्षणीय मूल्य के लिए एक स्तंभ निरुपित (जैसे।, गुना परिवर्तन या पी मूल्य)। 'कॉलम हेडर शामिल है' स्तंभ शीर्ष देखने के लिए विकल्प का चयन करें।
    3. अपलोड डाटासेट टैब पर क्लिक करके और स्प्रेडशीट ऊपर उल्लेख चयन करके आईपीए पर डाटासेट शब्द। लचीला स्वरूप टैब चुनें, और जीन पहचानकर्ता के उचित श्रेणी का चयन करें।
      नोट: डाटासेट की एक लचीला प्रारूप अपलोड करने के लिए प्रारूप विवरण काबू।
    4. डाटासेट प्रतीत होता है के बाद, आईडी और प्रेक्षण स्तंभों का चयन करें। सुनिश्चित करें के रूप में बड़े पैमाने पर सपा द्वारा की पहचान प्रोटीन (MRP4 interactome के सभी किectrometry) डाटासेट सारांश टैब पर जाँच करके मैप कर रहे हैं। डाटासेट अब वांछित विश्लेषण के लिए तैयार है।
  2. डेटा विश्लेषण
    नोट: वर्णित आईपीए सुविधाओं का आंशिक उपयोग करता है कि इस अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है।
    1. अनन्य पहचानकर्ता के रूप में उनके नाम के साथ जीन MRP4 interactome अपलोड करने के बाद, नए पर क्लिक करें और आईपीए सॉफ्टवेयर के शीर्ष बाएँ मेनू में कोर विश्लेषण चुनें।
    2. प्रयोग के प्रकार के अनुसार तीव्रता के लिए अभिव्यक्ति cutoffs मूल्य सेट (100 की तीव्रता मूल्य के विश्लेषण के लिए सिफारिश की है)।
    3. अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन की गणना करते हुए डाटासेट तैयारी करता है, तो नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों शामिल कर रहे हैं और डाटासेट फ़ाइल के भाग के रूप में शामिल एक तुलना विश्लेषण किया जा करने की जरूरत है, तो (1.5 गुना परिवर्तन की कट-ऑफ मूल्य आमतौर पर विश्लेषण के लिए सिफारिश की है )।
      नोट: कोर विश्लेषण के पूरा होने के बाद, विश्लेषण के कई वर्गों से प्राप्त किया जा सकता है। पहला टैब वीं का सारांश दिखाता हैई कुल विश्लेषण और शीर्ष विहित रास्ते, नदी के ऊपर नियामकों, आणविक और सेलुलर कार्यों, और नेटवर्क दूसरों के बीच में चलता है; सभी आत्मविश्वास के स्तर (पी मूल्य) के आधार पर गणना की और पी मूल्य के आरोही क्रम में व्यवस्था की।
    4. प्रमुख विहित रास्ते (खुला मार्ग विकल्प का उपयोग) के रूप में बड़ी आणविक नेटवर्क है कि pictorially पार कर, ओवरलैपिंग शो खुला, और संकेत रास्ते को प्रभावित किया।
      विहित रास्ते की सूची है कि एक वाणिज्यिक पी मूल्य के आधार पर शामिल कर रहे हैं देखो (पी <0.05 महत्वपूर्ण माना जाता है)।
      नोट: विहित रास्ते के लिए महत्व मूल्यों फिशर सटीक परीक्षण सही पूंछ से गणना कर रहे हैं। महत्व अकेले यादृच्छिक मौका द्वारा विहित मार्ग के साथ डाटासेट से अणुओं के सहयोग की संभावना को इंगित करता है।
    5. प्रत्येक मार्ग में शामिल प्रोटीन की सूची में इनपुट प्रोटीन (MRP4 interactome के रूप में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान) की पुष्टि करें।
      नोट: इस OPTIO का प्रयोगn, यह देखा गया है कि सेलुलर actin cytoskeleton संकेत नेटवर्क प्रमुख प्रभावित मार्ग और कैसे इनपुट प्रोटीन इसे में फिट (चित्रा 1) है। इस दृष्टिकोण की पहचान है जो आणविक नेटवर्क बारीकी से जुड़ा हुआ है और परीक्षण प्रोटीन से प्रभावित हो जाएगा मदद करता है।
    6. शीर्ष रोगों और कार्य करता है कि संभावित फोकस अणुओं की संख्या के आधार पर एक विशेष प्रोटीन नेटवर्क से जुड़े हुए हैं की पहचान करने के लिए विश्लेषण में नेटवर्क टैब का उपयोग करें।
      नोट: एक स्कोर मूल्य है कि एक नेटवर्क जैसे के हिस्से के रूप में जाना जाता है निर्धारित कर रहे हैं प्रोटीन के आधार पर दिया जाता है, सेलुलर विधानसभा और संगठन के नेटवर्क, साहित्य ज्ञान और प्रयोगात्मक सबूत के माध्यम से और अणुओं है कि डाटासेट से पहचान कर रहे हैं ध्यान केंद्रित करने और नेटवर्क का हिस्सा बन जाते हैं। । इसके बाद, नेटवर्क फोकस अणुओं की संख्या के आधार पर पहली जगह में छान हो जाता है।

2. उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी

  1. कक्ष की तैयारी
    नोट: सभी सेल संस्कृति काम क्षैतिज प्रवाह सेल संस्कृति हुड के तहत किया गया था।
    1. घाव चिकित्सा परख के लिए microplates 96 अच्छी तरह से प्रयोग करें।
    2. कोट 1% fibronectin समाधान के साथ microplate (पीबीएस में पुनर्गठन), और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली रखने के लिए।
    3. हटाये Mrp4 - / - और Mrp4 + / + माउस भ्रूण fibroblast (MEFs) इनक्यूबेटर से 25 सेमी ² सेल संस्कृति बोतल में हो, 4x trypsin EDTA के समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 1 बार धोने, और कोशिकाओं trypsinize।
    4. कोशिकाओं को पूरा मध्यम के साथ है और उन्हें पूरा मध्यम के 5 मिलीलीटर में resuspend (DMEM 10% FBS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त) को धो लें।
    5. कुओं से fibronectin समाधान aspirate। एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 30,000 कोशिकाओं (सेल नंबर सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए) अच्छी तरह से बीज प्रत्येक में।
    6. एक मानक में 100% संगम कोशिकाओं को विकसितसीओ 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 इनक्यूबेटर।
  2. बनाना घाव
    1. सुनिश्चित करें कि सभी कुओं समाधान के साथ भर रहे हैं। पीबीएस के साथ अप्रयुक्त कुओं भरें घाव बनाने के उपकरण को नुकसान को रोकने के लिए (जैसे।, WoundMaker)।
    2. 100% सेल संगम की पुष्टि के बाद, धातु बेस प्लेट पर घाव बनाने उपकरण के अंदर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और 96 अच्छी तरह से पिन ब्लॉक नीचे दबाएँ।
    3. कोशिकाओं को किसी भी उखाड़ फेंकना कोशिकाओं को हटाने और पूरा मध्यम के 100 μl जोड़ने के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    4. परीक्षण यौगिकों जोड़ें - एच 89 (50 माइक्रोन के; 1: पूरा मीडिया DMSO में 50 मिमी स्टॉक का उपयोग के साथ 1,000 कमजोर पड़ने) या Latrunculin बी (1 माइक्रोन; 1: पूरा मीडिया DMSO में 1 मिमी स्टॉक का उपयोग कर के साथ 1,000 कमजोर पड़ने) इस स्तर पर ।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर पाठक के अंदर परख थाली प्लेस और प्रयोगात्मक अवधि में प्रवास पर नजर रखने।
  3. निगरानी सेल प्रवास
    नोट: सेल प्रवास माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर जनसंपर्क नजर रखी थीउच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी प्रणाली के साथ ovided। 96 अच्छी तरह से उपयोग microplates सुनिश्चित करता है कि घाव स्वचालित रूप से माइक्रोस्कोप से नजर रखी और सॉफ्टवेयर द्वारा पंजीकृत हैं।
    1. अनुसूची स्कैन टैब का उपयोग करके माइग्रेशन assays के लिए परख प्लेट हर घंटे स्कैन करने के लिए सॉफ्टवेयर सेट करें। पाठक के अंदर परख थाली रखकर संतुलन इमेजिंग के लिए पहले अनुमति देने के लिए बाद कम से कम 15 मिनट के एक शुरुआत के समय का चयन करें।
    2. ट्रे का चयन करें और पोत प्रकार (96 अच्छी तरह से microplate) और प्रयोग के प्रकार (स्क्रैच घाव) चुनें।
    3. 10X उद्देश्य का चयन करें और चरण विपरीत इमेजिंग मापदंडों का चयन। कुओं संपादित स्कैन पैटर्न विकल्प का उपयोग कर स्कैन किया जा करने की जरूरत है कि चयन करें।
    4. गुण टैब का चयन और एक थाली नक्शे की स्थापना करके उपचार समूहों और किसी भी प्रतिकृति निर्दिष्ट करें। स्कैनिंग प्रयोगात्मक हालत के आधार पर किसी भी समय बंद कर दिया जा सकता है।
  4. डेटा विश्लेषण
    1. बाद स्कैनिंग किया जाता है, परख प्लेट के लिए पोत दृश्य टैब का चयन करें। जीओ विश्लेषण नौकरी उपयोगिताओं और चयन लांच नए विश्लेषण काम करने के लिए।
    2. नौकरी प्रकार के रूप में खरोंच घाव सेट और विश्लेषण (24 घंटा समय बिंदु 0 समय बिंदु) के लिए समय सीमा का चयन करें।
    3. कुओं का चयन अच्छी तरह पर एक सिंगल क्लिक के विश्लेषण के लिए चुना और विश्लेषण आरंभ करने के लिए क्लिक करें 'ठीक' किया जाना है। एक बार जब विश्लेषण किया जाता है, रेखांकन रिश्तेदार घाव घनत्व (RWD) के आंकड़ों से प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से हर समय बिंदु पर कल्पना ग्राफ विकल्प के लिए निर्यात का उपयोग।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से दृश्य छवि टैब का उपयोग कर विभिन्न समय अंक के लिए इसी के चरण विपरीत छवि सेट देखें। प्लेट के नक्शे पर क्लिक करके एक विशिष्ट अच्छी तरह का चयन करें, समय सीमा टैब से एक विशिष्ट समय बिंदु चुनें और छवि टैब पर क्लिक करें।

3. Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट)

  1. कक्ष की तैयारी
    1. 1% फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान के 100 μl (धारा 2.1 में वर्णित के रूप में) और उन में रखने के साथ कोट 35 मिमी गिलास तली व्यंजन2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक सीओ 2 इनक्यूबेटर।
    2. पूरा मध्यम में प्लेटें और HEK293 कोशिकाओं के बीज बराबर संख्या से fibronectin समाधान (10,000 कोशिकाओं / प्लेट) aspirate।
    3. कोशिकाओं 60-70% संगम के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक सीओ 2 इनक्यूबेटर में fibronectin लेपित गिलास तली व्यंजन में आगे बढ़ें।
  2. अभिकर्मक
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर सभी क्षणिक transfections प्रदर्शन करना।
    2. अशेष प्रत्येक 35 मिमी पकवान के लिए दो अलग 1.5 मिलीलीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में पूरा मध्यम के 250 μl।
    3. एक ट्यूब और 5 μl में डीएनए (pmAKAR3 या pmAKAR3-टीए) के 2 माइक्रोग्राम एक और ट्यूब में अभिकर्मक अभिकर्मक के (2.5 डीएनए एकाग्रता गुना) जोड़ें।
    4. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ट्यूबों सेते हैं और फिर अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त ट्यूब में पतला डीएनए हस्तांतरण।
    5. अच्छी तरह मिक्स और 37 पर सेतेएक और 30 मिनट के लिए सें।
    6. कोशिकाओं से मध्यम Aspirate और पीबीएस के साथ एक बार उन्हें धोने। एंटीबायोटिक मुक्त DMEM एफ 12 कोशिकाओं के लिए 10% FBS युक्त मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. , एक थाली में कोशिकाओं को मीडिया के साथ डीएनए लिपिड साधना के 507 μl जोड़े धीरे मिश्रण, और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखने के लिए। प्रत्येक थाली में 10,000-50,000 कोशिकाओं के लिए डीएनए (1 माइक्रोग्राम / μl शेयर) और 5 μl लिपिड के 2 माइक्रोग्राम का प्रयोग करें।
  3. लाइव सेल इमेजिंग
    1. (HbSS, 37 पर पूर्व गर्म अभिकर्मक के 48 घंटे के बाद, हांक बैलेंस्ड नमक समाधान के साथ विकास मध्यम हटाने और 2 बार कोशिकाओं को धो सी)। 1.9 मिलीलीटर HBSS के अंतिम मात्रा एक कस्टम बनाया 37 डिग्री सेल्सियस के अंदर झल्लाहट इमेजिंग के लिए एक औंधा व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप प्रणाली पर धोया कोशिकाओं को जोड़ने और उन्हें माउंट चैम्बर बनाए रखा।
      नोट: इस प्रणाली में, उत्तेजना प्रकाश एक 300 W क्सीनन दीपक 50% प्रकाश transmiss के साथ एक तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ तनु द्वारा प्रदान की गई हैआयन।
    2. 60x उद्देश्य का प्रयोग करें। मैन्युअल कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने और माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखने का एक इष्टतम क्षेत्र निर्धारित किया है। सॉफ्टवेयर पर फोकस "एफ" विकल्प का उपयोग कर कंप्यूटर स्क्रीन पर देखने के चयनित क्षेत्र को सक्रिय करें। झल्लाहट माप प्रदर्शन के लिए, उचित फिल्टर सेट (CFP / YFP फिल्टर एक 430/25 एनएम उत्तेजना फिल्टर, एक डबल dichroic बीम फाड़नेवाला के साथ सेट, और दो उत्सर्जन फिल्टर (470/30 एनएम के लिए सीएफपी और 535/30 झल्लाहट के लिए एनएम) का चयन मैन्युअल।
    3. पहले चैनल विकल्प सीएफपी / YFP / खुला स्त्राव टैब पर क्लिक करके पीछा किया झल्लाहट पर जाँच करके प्रतिदीप्ति कल्पना। कैमरा टैब में गहनता उपकरण का उपयोग करके संकेत तीव्रता में सुधार लाना।
    4. pmAKAR3 या pmAKAR3-टीए व्यक्त संकेत तीव्रता के संतृप्ति से बचने के कक्षों का चयन करें। झल्लाहट माप आरंभ करने के लिए कब्जा खिड़की का प्रयोग करें।
    5. समय चूक विकल्प और सेटअप 30 सेकंड के अंतराल के साथ 30 मिनट के लिए एक समय-स्कैन का चयन करें। झल्लाहट विकल्प चेक करें और 100 मिसे पर जोखिम समय निर्धारित किया है। छवि के लेबल एक दर्जघ प्रेस माप आरंभ करने के लिए शुरू करते हैं।
    6. पांच बार के अंक और एक आधारभूत की स्थापना के बाद, कोशिकाओं को 25 माइक्रोन के forskolin की (इथेनॉल में 10 माइक्रोन के शेयर, HBSS के 100 μl से पतला के 5 μl) प्लेट के बिना परेशान 30 मिनट की कुल के लिए कोशिकाओं को जोड़ने और निगरानी।
  4. डेटा विश्लेषण
    नोट: डेटा विश्लेषण के लिए ratiometric गणना मॉड्यूल का उपयोग।
    1. छवि खिड़की के बाएं हाथ की ओर का चयन करें उपकरण पर क्लिक करें और ड्रॉप डाउन मेनू से एक ठोस आयत चुनें। एक सेल मुक्त क्षेत्र में छवि मैदान पर आयत खींचें और सही पृष्ठभूमि घटाव के प्रयोजन के लिए पृष्ठभूमि के रूप में स्थापित करने के लिए उस पर क्लिक करें।
    2. मुखौटा करने के लिए जाने के लिए और विकल्प 'एक नया मुखौटा बनाने' का उपयोग करें। का चयन करें उपकरण पर जाएं और स्वयं एक माप के लिए इसे चुनने के लिए सेल के चारों ओर एक मुखौटा आकर्षित करने के लिए ड्रॉप डाउन मेनू से एक पेन चुनें। शर्त के अनुसार कम से कम 4-6 कक्षों का चयन करें।
    3. मास्क टैब का चयन करें और मुखौटा आँकड़े प्रदर्शन करते हैं।
    4. 'पूरे मुखौटा' चेक पार चैनल विकल्प का चयन करें दाता सामान्यीकृत झल्लाहट (एन झल्लाहट) (झल्लाहट / CFP) का विस्तार। एन झल्लाहट मूल्य प्लाज्मा झिल्ली में PKA गतिविधि का प्रतिनिधि है।
    5. समय-टिकटों जोड़ें, देखो तालिका और बड़े पैमाने बार एनोटेशन का उपयोग कर।

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Representative Results

Fibroblast प्रवास पर MRP4 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम एक घाव चिकित्सा परख उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी 14 का उपयोग किया करते थे। सटीक घाव MEFs का मिला हुआ monolayers से पृथक पर किए गए थे या तो Mrp4 - / - या Mrp4 + + / चूहों, और छवियों को 24 घंटे के लिए 1 घंटा के अंतराल पर ले जाया गया। हम Mrp4 के लिए एक उच्च पलायन दर मनाया - / - MEFs Mrp4 + + / MEFs (चित्रा 2) की तुलना में। , MEFs जबकि Mrp4 + + / MEFs लगभग 20 घंटा के लिए आवश्यक घाव को कवर करने के लिए - / - घाव पूरी तरह से Mrp4 के लिए कम से कम 15 घंटे में ठीक हो रहे थे।

कोशिकाओं पलायन के अग्रणी धार पर PKA गतिविधि की फूट डालना संचय दिशात्मक पलायन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक घटना है। PKA गतिविधि वास्तविक समय usin में नजर रखी जा सकतीजी PKA 5,17 के लिए pmAKAR3 झल्लाहट आधारित सेंसर। PKA गतिविधि के लिए pmAKAR3 की विशिष्टता की जांच करने के लिए, हम HEK293 pmAKAR3 या बिंदु उत्परिवर्ती pmAKAR3-टीए, जो PKA के लिए सब्सट्रेट क्षेत्र में एक threonine करने वाली alanine उत्परिवर्तन होता है और इसलिए 25 माइक्रोन के forskolin साथ PKA फोस्फोराइलेशन करने के लिए लापरवाह है overexpressing कोशिकाओं का इलाज किया , एक शिविर उत्प्रेरण एजेंट 14। हम pmAKAR3 overexpressing कोशिकाओं में संकेत झल्लाहट में वृद्धि पाया है, लेकिन overexpressing pmAKAR3-टीए कोशिकाओं अपरिवर्तित रहे (चित्रा 3)। बेसल झल्लाहट का स्तर भी कोशिकाओं pmAKAR3-टीए व्यक्त की तुलना में pmAKAR3 व्यक्त कोशिकाओं के लिए अधिक थे। इन आंकड़ों से संकेत दिया है कि pmAKAR3 PKA गतिविधि के लिए बहुत विशिष्ट है।

सारांश में, तरीकों प्रोटोकॉल खंड में वर्णित आणविक एक विशिष्ट सेलुलर घटना के साथ जुड़े तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी उपकरण हैं।

"चित्रा चित्रा 1:। MRP4 Interactome की सरलता मार्ग विश्लेषण (आईपीए) का उपयोग आईपीए actin cytoskeleton मार्ग MRP4 interactome से प्रभावित प्रमुख विहित रास्ते में से एक के रूप में पहचान की थी। प्रस्तुत actin संकेतन नेटवर्क से जुड़े प्रोटीन (सफेद) और प्रोटीन MRP4 interactome (गुलाबी) साहित्य और प्रयोगात्मक सबूत से inferred में पहचान के साथ उनके पार संचार इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
। चित्रा 2: घाव चिकित्सा उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी का उपयोग परख Mrp4 + / + और ​​Mrp4 - / - माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts fibrone पर बड़े हो रहे थेctin लेपित 96 अच्छी तरह से व्यंजन, और monolayers में घाव 96-पिन घाव-निर्माता का उपयोग कर ठीक किए गए थे। अलग अलग समय बिंदुओं पर छवियों प्रतिनिधि 10X बढ़ाई साथ दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) pmAKAR3 सेंसर का उपयोग 60X बढ़ाई साथ HEK293 कोशिकाओं से पहले और forskolin उपचार के बाद कर रहे pmAKAR3 सेंसर और pmAKAR3-टीए संवेदक के साथ ट्रांसफ़ेक्ट के लिए PKA गतिविधि की माप के आधार पर एन-झल्लाहट के प्रतिनिधि छद्म रंग छवियों। दिखाए (शीर्ष पैनल)। प्रत्येक पैनल में छवियों को देखने का एक ही क्षेत्र से कब्जा कर लिया गया। रंग पट्टी एन झल्लाहट की भयावहता को इंगित करता है। लाइन ग्राफ नीचे (पैनल) treatmen के बाद एन-झल्लाहट के स्तर में परिवर्तन का प्रतिनिधित्वforskolin के साथ टी। डेटा कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों की औसत प्रतिनिधित्व करते हैं (मतलब ± SEM, एन = 3)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 2000 Invitrogen(Carlsbad, CA)  11668-027
DMEM Invitrogen (Carlsbad, CA)  11965-092
IncuCyte Zoom Essen BioScience
96-well IncuCyte Image-Lock microplates  Essen BioScience 4493
Latrunculin B Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). L5288 Stock in DMSO
H-89 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) BML-EI196 Stock in DMSO
35 mm glass-bottomed dishes  (MatTek Corporation; Ashland, MA) P35G-1.5-20-C 
Fibronectin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). F1141
Opti-MEM Reduced Serum Media Invitrogen (Carlsbad, CA)  31985-088
FRET microscopy system Olympus inverted microscope (IX51)
CCD camera  Hamamatsu, Japan ORCA285
SlideBook software 5.5 Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)
Ingenuity Pathway Analysis software IPA, QIAGEN Redwood City,
Forskolin Tocris (Ellisville, MO).  1099 Stock in 100% EtOH
DMEM F-12   Invitrogen (Carlsbad, CA)  11330-057
HBSS Invitrogen (Carlsbad, CA)  14025-134
Excel Microsoft
PBS Invitrogen(Carlsbad, CA)  10010-023
Trypsin/EDTA Solution (TE) Invitrogen(Carlsbad, CA)  R-001-100
Penicillin-Streptomycin Invitrogen(Carlsbad, CA)  15140-122

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 111 बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन 4 (MRP4) actin शिविर पर निर्भर प्रोटीन काइनेज (PKA) माइग्रेशन सरलता मार्ग विश्लेषण (आईपीए) उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट)।
तरीके तंतुकोशिका प्रवासन के नियमन में Mrp4 युक्त macromolecular परिसर अध्ययन करने के लिए
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Sinha, C., Arora, K., Naren, A. P.… More

Sinha, C., Arora, K., Naren, A. P. Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration. J. Vis. Exp. (111), e53973, doi:10.3791/53973 (2016).

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