Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה

Published: May 19, 2016 doi: 10.3791/53973
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2
1Division of Pulmonary Medicine, Department of Pediatrics, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 2Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

MRP4 מסדיר אירועי איתות נוקלאוטיד תלוי מחזוריים שונים, כולל תפקיד הובהר לאחרונה נדידת תאים. אנו מתארים גישה ישירה, אך רבה לפענח את המטרות המולקולריות במורד הזרם של MRP4 וכתוצאה מכך ההזדהות של interactome MRP4 ייחודי שמנגן תפקידי מפתח בוויסות מכוונת-הקנס של הגירה פיברובלסטים.

Abstract

Multidrug התנגדות חלבון 4 (MRP4) הוא חבר של המשפחה קלטת ATP-מחייב של מובילי הממברנה הוא טרנספורטר בזרימת אנדוגני של נוקלאוטידים מחזורית. על ידי ויסות ריכוז נוקלאוטיד מחזורי תאי, MRP4 יכול לווסת אירועים הסלולר נוקלאוטיד התלוי מחזוריים מרובים כולל נדידת תאים. בעבר, הראינו כי בהעדר MRP4, תאי פיברובלסטים מכילים רמות גבוהות יותר של נוקלאוטידים מחזורי תאי והוא יכול להעביר מהר יותר. כדי להבין את המנגנונים של ממצא זה, אימצנו גישה ישירה עדיין רב פנים. ראשית, אנחנו מבודדים מתחמי חלבון אינטראקציה הפוטנציאל של MRP4 ממערכת התא MRP4 יתר ביטוי באמצעות immunoprecipitation ואחריו-ספקטרומטריית מסה. לאחר זיהוי חלבונים ייחודיים interactome MRP4, השתמשנו שנינות ניתוח נתיב (IPA) כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות בין חלבונים אלה בהקשר של העברת אותות. אנו הבהרנו את פותפקיד tential של מתחם חלבון MRP4 נדידת תאים ו- F יקטין מזוהה כמתווך עיקרי של השפעת MRP4 על נדידת תאים. מחקר זה גם הדגיש את תפקידה של cAMP ו- cGMP כמו שחקני מפתח תופעות הנדידה. באמצעות מיקרוסקופ גבוהה תוכן, בצענו מבחנים-נדידת תאים ו ציינו כי השפעת MRP4 על הגירת פיברובלסטים הוא בוטל לחלוטין על ידי שיבוש cytoskeleton יקטין או העיכוב של קינאז תלוי cAMP (PKA). כדי להמחיש איתות מודולציות בתא נודד בזמן אמת, השתמשנו חיישן מבוסס סריג למדידת פעילות PKA ומצאנו, בנוכחות פעילות PKA מקוטבת יותר ליד הקצה המוביל של נודדות Mrp4 - / - פיברובלסטים, לעומת Mrp4 + / + פיברובלסטים. זה בתורו עלה היווצרות תקטין קליפת מוח augmented בתהליך של הגירה. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי של החלבונים הפועלים במורד MRP4 ומספקת לנו עם מעללאור מנגנון המעורבים בויסות MRP4 תלוי הגירה פיברובלסטים.

Introduction

נדידת תאים היא תהליך רב שלבים מסובך. מחקרים הראו כי במהלך תאי הגירה מקוטבים לתוך מובילים ונגררים קצוות. על ידי שמירה על תאי מטריקס, את הקצה המוביל מספק את המתיחה הדרוש לגוף התא להתקדם. לבסוף, משחרר הנגרר לקצה המצורף האחורית ומשלים את 1,2 מחזור ההגירה.

קיטוב נייד עבור נדידת תאים יעילה מוסדר על ידי פרדה מרחבית של איתות תאית. שליחים משניים סלולריים, כמו קייטנה, לתווך המידור של אירועי האיתות הנדרשים 3,4 נדידת תאים כיוונית מכוילות. הצטברויות מועדפות של מחנה קינאז התלוי cAMP פעילות PKA בחוד החנית ממלאות תפקידים מרכזיים נדידת תאים כיוונית 5,6. על ידי phosphorylating GTPases הקטן כגון מצע רעלן בוטולינום C3 ראס קשור (RAC) ובקרת חלוקת תא חלבון 42 homolog או Cdc42, PKמפעיל חלבון יקטין הקשורים 2/3 (ארפ 2/3) בחוד החנית ואת הגורם להיווצרות lamellipodia 7-9. PKA גם phosphorylates סוכן אנטי מכסה, vasodilator מגורה phosphoprotein (VASP), ובכך מסדיר את מחזורי תנודתית של רחבת הממברנה הכחשה 10,11.

בתאים, רמות cAMP מוסדרות שלושה תהליכים עיקריים: א) סינתזה ידי cyclase adenylate, ii) שפלה ידי phosphodiesterases, ו- III) תחבורת ידי מובילים בזרימת קרום נכנס 3. חלבון 4 התנגדות multidrug (MRP4), חבר קסטת מחייב ATP (ABC) המשפחה של מובילי קרום, מתפקד טרנספורטר בזרימת אנדוגני של נוקלאוטידים מחזורי. לכן, MRP4 יכול לווסת את רמות cAMP תאיות cAMP תלוי הסלולר איתות 11-13. בעבר הראינו כי Mrp4 - / -, פיברובלסטים מכילים רמות גבוהות יחסית של נוקלאוטידים מחזורית ולהעביר ג מהרompared כדי Mrp4 + / + פיברובלסטים 14. גם דיווחנו השפעה בי-פאזית נוקלאוטידים מחזורי על הגירה פיברובלסטים. בהתבסס על מחקרים קודמים קביעתנו כי Mrp4 - / - פיברובלסטים מכילים cAMP מקוטב יותר במהלך הנדידה, שיערנו כי תקנה MRP4 בתיווך זה של הגירה פיברובלסטים הוא cAMP תלויים. על מנת להבין את המנגנון במורד הזרם, לקחנו גישה ישירה עדיין רב פנים.

כדי לזהות את החלבונים הקשורים ב הגומלין עם MRP4, אנו immunoprecipitated מתחמי macromolecular המכילים MRP4 מתאי HEK293 כי מעל להביע MRP4. באמצעות ספקטרומטר מסה, זיהינו חלבונים MRP4 אינטראקציה מרובים וניתח הקישוריות שלהם באמצעות ניתוח נתיב שנינות (IPA). IPA הוא כלי שימושי כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים (הן מבניות ותפקודיות) ולחקור תרומתם הפיזיולוגית ופתולוגיים בפרטאירועים על סמך הספרות וראיות ניסיוני 15,16. IPA ציין כי F- יקטין היא מטרה במורד זרם עיקרית של MRP4 בהקשר של נדידת תאים שבו cAMP ו- cGMP הוא המפתח מולקולות איתות 17. נתונים אלה אושרו עוד יותר על ידי מיקרוסקופ גבוה תוכן. מיקרוסקופיה גבוהה תוכן יכול ללכוד ולנתח התנהגויות התא כגון נדידת תאים באופן יותר נוח, מדויק תפוקה גבוהה 18. נתוני מיקרוסקופיה גבוהי תוכן הראו כי השפעת MRP4 על הגירת פיברובלסטים הוא בוטל לחלוטין על שיבוש cytoskeleton יקטין או העיכוב של PKA 17.

בנוסף, השתמשנו תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) מבוסס חיישן PKA לפקח על הדינמיקה PKA ב תאים נודדים בזמן אמת. חיישנים קינאז מבוסס סריג בדרך כלל מורכבים של פפטידים מצע זירחון הספציפיים המוקפים CFP ו fluorophores YFP 19-21. pmAKAR3 הוא משופר ואותיmbrane ממוקד חיישן PKA מבוסס סריג המכיל הקשורים-forkhead מושלם 1 (FHA1) ואת רצף מצע PKA 5,22 LRRATLVD. זירחון של pmAKAR3 ידי עליות למקטע קטליטי PKA סריג אות בין CFP ו YFP 19. קלטי תחום שינוי שומנים לתוך החיישן שממקדים אליו קרום הפלזמה לניטור דינמיקת PKA, במיוחד על תא קרום 23.

שימוש pmAKAR3, הראינו כי את הקצה המוביל של נודדות Mrp4 - / - פיברובלסטים הציג פעילות PKA מקוטבת יותר Mrp4 + / + פיברובלסטים, אשר בתורו הגדיל את ההיווצרות יקטין קליפת המוח בחוד החנית של התא 17. יחד, אירועים אלה גרמו קיטוב הסלולר טוב נדידת תאים כיוונית מהר בהעדר MRP4. הגישה הספציפית וישירה שלנו זיהתה מטרות במורד מפתח עבור MRP4 ומספקת חשוב, אבל כמומנגנון עדיין לא נחקר לרגולצית MRP4 תלוי הגירה פיברובלסטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ניתוח נתיב שנינות

  1. מערך נתוני החלבון-interactome העלאה
    1. הכנס את החלבונים / גני העניין בגיליון אלקטרוני עם מזהי הגן הייחודיים שלהם (רצוי סימני הגן ומספרים מזהים גנים כפי שנתקבל עם נתונים ספקטרומטריה).
    2. הקצאת עמודה אחת בגיליון האלקטרוני עבור מספר מזהה ג'ין ועמודה אחת ערך תצפיתי (למשל., מקפלים-שינוי או p-value). בחר באפשרות 'מכילה כותרת עמודה' כדי להציג את כותרות העמודות.
    3. העלה את הנתונים על IPA ידי לחיצה על הלשונית במערך להעלות בחירת הגיליון האלקטרונית שהוזכר לעיל. בחר את כרטיסיית התבנית הגמישה, ובחר את הקטגוריה המתאימה של מזהת גן.
      הערה: תבנית גמישה של בסיס הנתונים מתגברת מפרטי הפורמט להעלאה.
    4. לאחר הנתונים מופיעים, בחר עמודות מזהות והתבוננות. ודא שכל של חלבונים (interactome MRP4 כפי שהוגדרו על ידי-sp המוניתectrometry) ממופה על ידי סימון על כרטיסיית סיכום נתונים. בסיס הנתונים מוכן כעת לניתוח הרצוי.
  2. ניתוח נתונים
    הערה: יתוארו השימושים החלקיים של תכונות IPA כי נוצלו לצורכי מחקר זה.
    1. לאחר העלאת interactome MRP4 עם שמות הגן שלהם בתור מזהים ייחודיים, לחץ על חדש ובחר ניתוח הליבה בתפריט השמאלי העליון של התוכנה IPA.
    2. הגדר את ערך הביטוי הפסקות עבור עוצמת בהתאם לסוג הניסוי (ערך אינטנסיביות של 100 מומלץ לניתוח).
    3. חשבתי את מתקפל השינוי בהבעה בעת הכנת בסיס הנתונים אם תנאים מלאי ניסיוני מעורבים ולכלול בו כחלק קובץ הנתונים אם ניתוח השוואה לבצעו (ערך חתוך של 1.5 שינוי לקפל בדרך כלל מומלץ לניתוח ).
      הערה: לאחר השלמת ניתוח הליבה, חלקים רבים של ניתוחים ניתן להשיג. בלשונית הראשונה מציגה את הסיכום של הדואר ניתוחים הכולל ומציע מסלולי הקנונית עליונים, רגולטורים במעלה זרם, פונקציות מולקולריות תאיות, ורשתות בין יתר; כל מחושב בהתבסס על רמת הביטחון (ערך p) מסודרים בסדר עולה של ערך p.
    4. פתח את המסלולים הקנונית הגדולים (באמצעות אפשרות המסלול הפתוחה) רשתות מולקולריות גדולות כמו זה באופן ציורי להראות לדבר צלב, חופפים, והשפיע מסלולי איתות.
      תסתכל על הרשימה של המסלולים קנוני כי הם מעורבים מבוססים majorly על p-value (p <0.05 נחשב משמעותי).
      הערה: הערכים משמעות עבור מסלולים הקנונית מחושבים על ידי בדיקה מדוקדקת של פישר עם זנב ימני. המשמעות מציינת את הסתברות התאגדות של מולקולות מן הנתונים עם המסלול הקנונית על ידי מקריות בלבד.
    5. אשר את חלבוני הקלט (interactome MRP4 כפי שהוגדר על ידי-ספקטרומטריית מסה) מרשימת החלבונים המעורבים בכל מסלול.
      הערה: שימוש OPTIO זהn, זה היה נראה כי רשת איתות cytoskeleton הסלולר תקטין היא מסלול המושפעים העיקרי ואיך חלבוני הקלט מוצאים שם את מקומה (איור 1). גישה זו מסייעת לזהות אילו רשתות מולקולריות תהיינה קשורות באופן הדוק מושפעות חלבוני הבדיקה.
    6. השתמש בכרטיסיית הרשת בניתוחים לזהות מחלות ופונקציות העליונות שמקושרות פוטנציאלי לרשת חלבון מסוימת בהתבסס על המספר של מולקולות מוקד.
      הערה: ערך ציון ניתן על בסיס החלבונים הידועים כי נקבעים כחלק למשל רשת, הרכבת הסלולר ורשת ארגון, באמצעות ידע בספרות וראיות ניסיון ולהתמקד מולקולות שמזוהות מן הנתונים ולהיות חלק ממערך ניהול נכסים. . מעתה, הרשת מקבלת מסונן מלכתחילה מבוסס על מספר מולקולות מוקד.

מיקרוסקופי גבוה תוכן 2.

  1. הכנת תאים
    הערה: כל עבודת תרבית תאים נעשית מתחת למכסת מנוע תרבית תאים האופקית-זרימה.
    1. השתמש 96 גם microplates עבור assay ריפוי הפצע.
    2. מעיל microplate עם פתרון פיברונקטין 1% (מחדש ב- PBS), ולשמור את הצלחת CO 2 באינקובטור סטנדרטי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    3. Remove Mrp4 - / - ו Mrp4 + / + עכבר פיברובלסטים עובריים (MEFs) גדל ב צלוחיות תרבות 25 סמ"ר התא מן האינקובטור, לשטוף פעם 1 עם PBS, trypsinize התאים למשך 5 דקות באמצעות 1 מ"ל של תמיסת 4x טריפסין-EDTA.
    4. שוטפים את התאים עם בינוני שלם (DMEM המכיל 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) resuspend אותם 5 מ"ל של מדיום מלאה.
    5. לשאוב את הפתרון פיברונקטין מבארות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer וזרעי 30,000 תאים (מספר הסלולרי צריך להיות מותאם המבוסס על סוג תא) לתוך כל טוב.
    6. לגדל את התאים מפגש 100% בסטנדרטCO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  2. פצע יצירה
    1. ודא כי כל הבארות מלאות פתרון. מלאו בארות בשימוש עם PBS כדי למנוע נזק לכלי ביצוע הפצע (למשל., WoundMaker).
    2. לאחר אישור מפגש תא 100%, למקם את צלחת 96-היטב בתוך הכלי והופך פצע על צלחת בסיס המתכת ולחץ על הגוש הפיני 96-גם למטה.
    3. שוטף את התאים שלוש פעמים עם PBS להסיר את כל תאים וחלצו ולהוסיף 100 μl של בינוני מלא.
    4. מוסיפים את תרכובות הבדיקה - H-89 (50 מיקרומטר; 1: 1,000 דילול עם התקשורת להשלים באמצעות 50 המניות מ"מ DMSO) או Latrunculin B (1 מיקרומטר; 1: 1,000 דילול עם התקשורת להשלים באמצעות מניות 1 מ"מ DMSO) בשלב זה .
    5. מניחים את הצלחת assay בתוך הקורא על 37 מעלות צלזיוס ולפקח הגירה לאורך תקופת הניסוי.
  3. נדידת תאי ניטור
    הערה: נדידת תאים היה פיקוח באמצעות יחסי ציבור מיקרוסקופ ותוכנהovided עם מערכת מיקרוסקופיה גבוהה תוכן. השימוש 96 גם microplates מבטיח כי הפצעים מנוטרים באופן אוטומטי על ידי מיקרוסקופ ונרשמו ע"י התוכנה.
    1. הגדר את התוכנה כדי לסרוק את צלחת assay כל שעה עבור מבחני הגירה באמצעות כרטיסיית סריקת לוח זמנים. בחר שעה התחלה לפחות 15 דקות לאחר הצבת צלחת assay בתוך הקורא לאפשר איזון לפני ההדמיה.
    2. בחר את המגש ולבחור סוג אונייה (microplate 96-היטב) וסוג ניסוי (פצע Scratch).
    3. בחר מטרת 10X ולבחור פרמטרי הדמית שלב ניגודיות. בחר את הבארות שצריכות לסריקה באמצעות אפשרות דפוס סריקת עריכה.
    4. ציין את קבוצות טיפולים וכל משכפל ידי בחירת כרטיסיית המאפיינים והקמת מפת צלחת. סריקה ניתן לעצור בכל עת על בסיס תנאי הניסוי.
  4. ניתוח נתונים
    1. לאחר הסריקה נעשית, בחר את כרטיסיית תצוגת כלי עבור צלחת assay. Go אל שירות עבודת ניתוח עבודת ניתוח חדש השקה בחרי.
    2. גדר פצע שריטה כסוג עבודה ובחר את טווח הזמן עבור (נקודת זמן 0 כדי 24 שעות נקודת זמן) ניתוח.
    3. בחרו את הבארות להיבחר לניתוח על ידי לחיצה בודדת על הבאר ולוחצות על 'אישור' כדי ליזום את הניתוח. לאחר הניתוח מתבצע, גרפי לדמיין צפיפות פצע יחסית (RWD) נתונים עבור כל טוב בכל נקודת זמן באמצעות יצוא לאפשרות הגרף.
    4. הצג את סט תמונת שלב ניגודיות של כל טוב מתאים-בנקודות זמן שונות באמצעות לשונית תמונת נוף. בחר באר המבוקש על ידי לחיצה על מפת הצלחת, לבחור נקודת זמן מסוימת מכרטיסיית טווח הזמן ולחץ על כרטיסיית תמונת נוף.

3. העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג)

  1. הכנת תאים
    1. מעיל 35 מ"מ צלחות עם רצפת זכוכית עם 100 μl של 1% פתרון פיברונקטין (כמפורט בסעיף 2.1) ולשמור אותםCO 2 באינקובטור סטנדרטי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    2. לשאוב את הפתרון פיברונקטין מהצלחות ומספרי זרע שווים של HEK293 תאים (10,000 תאים / צלחת) בינוני מלא.
    3. לגדל את התאים מפגש 60-70% ב המנות מצופה פיברונקטין תחתית זכוכית CO 2 באינקובטור סטנדרטי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  2. transfection
    1. בצע את כל transfections חולף באמצעות מגיב transfection מסחרי לפי הוראות היצרן.
    2. Aliquot 250 μl של מדיום מלא לשתי מבחנות צנטריפוגה סטרילי נפרדות 1.5 מיליליטר לכל צלחת 35 מ"מ.
    3. הוסף 2 מיקרוגרם של ה- DNA (pmAKAR3 או pmAKAR3-ת"א) בצינור אחד ו -5 μl (2.5 לקפל את ריכוז ה- DNA) של מגיב transfection בצינור אחר.
    4. דגירה צינורות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להעביר את ה- DNA מדולל לתוך הצינור מגיב המכילים transfection.
    5. מערבבים היטב לדגור על 37° C למשך 30 דקות אחרות.
    6. לשאוב את המדיום off התאים ולשטוף אותם פעם עם PBS. הוסף 1 מ"ל של מדיום אנטיביוטיקה ללא DMEM F-12 המכיל 10% FBS אל התאים.
    7. להוסיף 507 μl של המצומד DNA-שומנים עם תקשורת התאים כל צלחת, ומערבבים בעדינות, ולשמור בחממה 2 CO ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. השתמש 2 מיקרוגרם של ה- DNA (1 מיקרוגרם / מניות μl) ו -5 שומני μl עבור 10,000-50,000 תאים כל צלחת.
  3. Live- תא הדמיה
    1. לאחר 48 שעות של transfection, להסיר בינוני צמיחה לשטוף את התאים 2 פעמים עם תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS, מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס). הוספת נפח סופי של 1.9 מ"ל HBSS לתאי רחץ לעגן אותן על מערכת מיקרוסקופ הפוכה רחב בתחום הדמיה סריג בתוך מחוייט 37 ° C שמרה קאמרית.
      הערה: במערכת זו, האור עירור מסופק על ידי מנורה 300 W קסנון נחלש עם מסנן צפיפות ניטרלי עם 50% אור transmissיוֹן.
    2. השתמש אובייקטיבי 60X. ידני להתמקד התאים ולהגדיר שדה אופטימלי מבט באמצעות מיקרוסקופ. הפעל את השדה שנבחר מבט על מסך המחשב באמצעות פוקוס האפשרות "F" על התוכנה. לביצוע מדידות סריג, בחר את ערכת המסנן הנאה (מסנן CFP / YFP להגדיר עם מסנן עירור 430/25 ננומטר, קרן splitter dichroic כפול, ושני מסנני פליטה (470/30 ננומטר עבור CFP ו 535/30 ננומטר עבור סריג) באופן ידני.
    3. דמיין קרינה על ידי הבדיקה ראשונה על אפשרות ערוץ CFP / YFP / הסריג ואחריו לחיצת כרטיסיית פלואוריד פתוחה. לשפר את עוצמת האות על ידי שימוש באפשרות התעצמות בלשונית המצלמה.
    4. בחר את התאים המבטאים pmAKAR3 או pmAKAR3-ת"א הימנעות הרוויה של עוצמת האות. השתמש בחלון ללכוד ליזום מדידת סריג.
    5. בחר באפשרות הזמן לשגות והתקנת סריקה בזמן למשך 30 דקות עם 30 מרווח שניות. סמן את אפשרות הסריג ולהגדיר את זמן החשיפה ב 100 msec. הזן את תווית תמונההעיתונות ד להתחיל ליזום את המדידה.
    6. לאחר חמש נקודות זמן הקמת הבסיס, להוסיף 25 מיקרומטר של forskolin (5 μl של 10 מיקרומטר המניות באתנול, מדולל עם 100 μl של HBSS) על התאים מבלי להפריע את הצלחת לפקח על תאים עבור סכום כולל של 30 דקות.
  4. ניתוח נתונים
    הערה: מודול חישוב ratiometric השתמש לניתוח נתונים.
    1. הקש על הכלי לבחירה בצד השמאלי של חלון התמונה ולבחור מלבן מוצק מן התפריט הנפתח. גרור את המלבן על שדה התמונה חופשי בשטח תא קליק ימני על זה כדי להגדיר אותו כרקע לצורך רקע החיסור.
    2. עבור אל המסכה ולהשתמש 'ליצור מסכה חדשה' אפשרות. עבור אל הכלי לבחירה ולבחור עט מן התפריט הנפתח לצייר מסכה ידנית סביב התא כדי לבחור אותו עבור מדידה. בחר לפחות 4-6 תאים לכל מצב.
    3. בחר בכרטיסיית המסכת ולבצע סטטיסטיקת מסכה.
    4. בדוק 'מסכה שלמה', פועל להרחבת אפשרות צולבת ואת סריג מנורמל תורם בחר (N-סריג) (סריג / CFP). ערך N-הסריג הוא נציג של פעילות PKA על קרום התא.
    5. תוספת חותם זמן, נראה- up בר שולחן בקנה מידה באמצעות ההסברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לחקור את ההשפעה של MRP4 על הגירה פיברובלסטים, השתמשנו assay ריפוי פצעי ניצול מיקרוסקופיה גבוה תוכן 14. פצעים מדויקים נעשו על משטחים ומחוברים של MEFs המבודד משני Mrp4 - / - או Mrp4 + / + עכברים, ותמונות צולמו 1 במרווחי hr למשך 24 שעות. צפינו שיעור הגירה גבוה עבור Mrp4 - / - MEFs לעומת Mrp4 + / + MEFs (איור 2). הפצעים החלימו לחלוטין בתוך פחות מ -15 שעות עבור Mrp4 - / - MEFs, ואילו Mrp4 + / + MEFs נדרש כמעט 20 שעות כדי לכסות את הפצעים.

הצטברות מקוטבת של פעילות PKA בחוד החנית של תאים נודדים היא אירוע מפתח מוקדם הגירה כיוונית. ניתן לנטר פעילות PKA ב usin בזמן אמתg החיישן מבוסס סריג pmAKAR3 עבור PKA 5,17. כדי לבדוק את הספציפיות של pmAKAR3 לפעילות PKA, התייחסנו HEK293 תאים overexpressing pmAKAR3 או מוטציה נקודת pmAKAR3-ת"א, אשר מכיל מוטציה תראונין ל-אלאנין ב באזור המצע PKA ולכן הוא שֶׁאֵינוֹ מֵגִיב כדי זירחון PKA עם 25 מיקרומטר forskolin , סוכן וישכנע cAMP 14. מצאנו עלייה אות סריג בתאים overexpressing pmAKAR3, אבל תאים overexpressing pmAKAR3-ת"א נותר ללא שינוי (איור 3). הבזליים סריג רמות היו גם גבוהים יותר עבור התאים המבטאים pmAKAR3 לעומת התאים המבטאים pmAKAR3-ת"א. נתונים אלו הצביעו על כך pmAKAR3 מאוד ספציפי לפעילות PKA.

לסיכום, השיטות שתוארו בסעיף הפרוטוקול הם כולים שימושיים כדי לחקור את המנגנון המולקולרי הקשורים לאירוע תאי ספציפי.

"איור איור 1:. ניתוח נתיב שנינות (IPA) של MRP4 Interactome שימוש מסלול cytoskeleton IPA יקטין זוהה כאחד של המסלולים הקנונית הגדולים המושפעים interactome MRP4. רשת מוצגת יקטין איתות מציינת חלבונים מחוברים (לבן) ותקשורת הצלב שלהם עם החלבונים שזוהו interactome MRP4 (ורוד) להסיק עדויות בספרות וניסיוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
. איור 2: ריפוי פצעים Assay באמצעות מיקרוסקופית תכולה גבוהה Mrp4 + / + ו- Mrp4 - / - פיברובלסטים עובריים בעכבר (MEFs) גדלו על fibronectin מצופה מנות 96-היטב, ופצעים ב monolayers נעשו דווקא באמצעות 96 פינים-יצרנית הפצע. נציג תמונות בנקודות זמן שונה מוצגות עם הגדלה 10x. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) מבוסס מדידה של פעילות PKA באמצעות pmAKAR3 חיישנים התמונות פסאודו צבע נציג של N-סריג עם 60X הגדלה עבור HEK293 תאים transfected עם pmAKAR3 חיישן pmAKAR3-ת"א חיישן לפני ואחרי הטיפול forskolin הם. מוצג (פאנלים למעלה). תמונות בכל פאנל נתפסו מאותו שדה הראייה. בר צבע מציין את סדר הגודל של סריג N. הגרף קו (הפאנל התחתון) מייצג את השינוי ברמות N-סריג לאחר treatment עם forskolin. הנתונים מייצגים את הממוצע של לפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים (ממוצע ± SEM, n = 3). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 2000 Invitrogen(Carlsbad, CA)  11668-027
DMEM Invitrogen (Carlsbad, CA)  11965-092
IncuCyte Zoom Essen BioScience
96-well IncuCyte Image-Lock microplates  Essen BioScience 4493
Latrunculin B Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). L5288 Stock in DMSO
H-89 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) BML-EI196 Stock in DMSO
35 mm glass-bottomed dishes  (MatTek Corporation; Ashland, MA) P35G-1.5-20-C 
Fibronectin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). F1141
Opti-MEM Reduced Serum Media Invitrogen (Carlsbad, CA)  31985-088
FRET microscopy system Olympus inverted microscope (IX51)
CCD camera  Hamamatsu, Japan ORCA285
SlideBook software 5.5 Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)
Ingenuity Pathway Analysis software IPA, QIAGEN Redwood City,
Forskolin Tocris (Ellisville, MO).  1099 Stock in 100% EtOH
DMEM F-12   Invitrogen (Carlsbad, CA)  11330-057
HBSS Invitrogen (Carlsbad, CA)  14025-134
Excel Microsoft
PBS Invitrogen(Carlsbad, CA)  10010-023
Trypsin/EDTA Solution (TE) Invitrogen(Carlsbad, CA)  R-001-100
Penicillin-Streptomycin Invitrogen(Carlsbad, CA)  15140-122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  2. Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
  3. Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why? Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
  4. Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
  5. Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
  6. Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
  7. Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
  8. Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
  9. Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
  10. Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
  11. Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
  12. Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
  13. Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
  14. Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
  15. Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
  16. Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer's disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
  17. Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
  18. Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
  19. Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
  20. Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer - an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
  21. Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
  22. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
  23. Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
  24. Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
  25. Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
  26. Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
  27. Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
  28. Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 111 multidrug התנגדות חלבון 4 (MRP4) תקטין פרוטאין קינאז תלוי cAMP (PKA) הגירה ניתוח נתיב שנינות (IPA) מיקרוסקופי גבוהת תוכן פורסטר תהודת אנרגית העברה (סריג).
שיטות לחקר Mrp4 המכילים מכלולים Macromolecular בחוק הסדרת פיברובלסטים הגירה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinha, C., Arora, K., Naren, A. P.… More

Sinha, C., Arora, K., Naren, A. P. Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration. J. Vis. Exp. (111), e53973, doi:10.3791/53973 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter