Abstract
Cigaretrøg (CS) er en stor risikofaktor for hjerte-kar-og lungesygdomme. Fordi CS er en kompleks aerosol indeholder mere end 7.000 kemiske stoffer en det er udfordrende at vurdere bidragene fra de enkelte bestanddele af sin samlede toksicitet. Toksikologiske profiler af de enkelte bestanddele samt blandinger kan dog etableres in vitro ved at anvende højt gennemgående sat screening-værktøjer, der gør det muligt profilering af skadelige og potentielt skadelige Bestanddele (HPHCs) af tobaksrøg, som defineret af det amerikanske Food and Drug Administration (FDA). 2
For en indledende vurdering, blev en impedans-baserede instrument, der anvendes til en real-time, label-free vurdering af forbindelsens toksicitet. Instrumentet udlæsning afhængig celleadhæsion, levedygtighed og morfologi, der alle sammen giver et overblik over cellens status. En dimensionsløs parameter, opkaldt celle indeks, bruges til kvantificering. Et sæt af difskellige farvningsprotokoller blev udviklet til en fluorescens billeddannelse-baserede undersøgelse og en HCS platform blev brugt til at få mere dybdegående information om den slags cytotoksicitet fremkaldt af hver HPHC.
Af de 15 testede bestanddele, blev kun fem udvalgt til HCS-baseret analyse, da de registrerede en beregnelige LD 50 (<20 mm). Disse omfattede 1-aminonaphtalene, Arsen (V), chrom (VI), Crotonaldehyd og phenol. Baseret på deres virkning i HCS, kan 1-aminonaphtalene og Phenol identificeres at inducere mitokondriel dysfunktion, og sammen med chrom (VI) som genotoksisk baseret på den øgede histon H2AX phosphorylering. Crotonaldehyd blev identificeret som en oxidativ stress inducer og Arsen som en stress kinase pathway aktivator.
Denne undersøgelse viser, at en kombination af impedans-baserede og HCS teknologier giver en robust værktøj til in vitro-vurdering af CS bestanddele.
Introduction
Toksikologisk risikovurdering har historisk påberåbt sig brugen af dyremodeller, som, selv om grundlæggende inden for biovidenskab, er også forbundet med mangler, som inkonsekvent oversættelighed til mennesker og høje omkostninger. Desuden har der været en stigende indsats for at finde alternativer til dyreforsøg i overensstemmelse med ånden i "The 3 R'er" 2 (erstatning, begrænsning og forfining). Denne indsats er blevet accelereret i de seneste par år, ikke kun på grund af de seneste fremskridt såsom high-throughput teknikker og systemer biologi tilgange, men også på grund af lovgivning, der begrænser brugen af dyreforsøg, især i Den Europæiske Union.
Kompleksiteten af cellulære signalveje, der regulerer reaktionen på toksiske fornærmelser gør det klart, at anvendelse af enkelt toksikologiske endpoints ikke vil være tilstrækkelig til at beskrive den toksikologiske grundlag af visse forbindelser. Til dette, samspillet mellem hundredvis af interagerende proteins der bidrager til en biologisk netværk skal også tages i betragtning. For at undersøge effekten af giftstoffer på disse net, et system toksikologi tilgang kombineret med fænotypiske mellem- og high-throughput screening-assays er nyttigt at udlede kræfter og samtidig give flere oplysninger om virkningsmekanismen af individuelle giftstoffer.
I denne undersøgelse anvendte vi HCS som et kraftfuldt screeningsværktøj, som er sammensat af et automatiseret mikroskop og et biologisk softwareprogram, der kan erhverve, bearbejde og analysere billeddata afledt fra specifikke fluorescensbaserede cellulære assays. Dette giver mulighed for visuelle ændringer inden for en celle, der skal kvantificeres, ved en enkelt celle eller subcelleniveau, og mange parametre, der skal analyseres samtidigt. 3 For eksempel blev DNA dobbelt-strengbrud evalueret under anvendelse af et antistof-baserede identifikation af histon H2AX phosphorylering og reaktive oxygenarter (ROS) blev kvantificeret ved anvendelse af en celle-permeable superoxid farvestof.
Fordi lunge epitelceller repræsenterer den første biologiske barriere mod inhalerede giftstoffer, herunder cigaretrøg, vi udnyttet primære bronchieepithelceller celler som en in vitro model for at profilere effekten af HPHCs offentliggjort af USA Food and Drug Administration. 4 Dette håndskrift er en opfølgning -up på en tidligere undersøgelse 5, hvor vi evaluerede den biologiske virkning af en anden delmængde af HPHCs.
Som en del af vores arbejdsgange for at vurdere cytotoksicitet in vitro, vi oprindeligt vurderet de styrker af et udvalg af 15 HPHC s, ved hjælp af en impedans-baseret real-time cellulære analyse (RTCA) system, som tillod os at etablere dosis-intervaller, der er egnede til efterfølgende HCS analyse (figur 1). En toksikologisk HCS vurdering blev derefter udført ved hjælp af ni multi-parametriske endepunkter for cellulær toksicitet, hver overvåget på to tidspunkter (4 og 24 timers). Markørerne anvendt tydede på mitokondrietoksicitet, DNA-skader, stress kinase, reaktive oxygenarter (ROS), indhold glutathion (GSH), caspase-3-- 7 Aktivitetsmenutast, cytochrom C frigivelse og permeabilitet cellemembranen, som beskrevet i tabel 1.
Vores tilgang aktiveret identifikation og karakterisering af virkningen af cigaretrøg bestanddele gennem dosis- og tidsafhængig prøveudtagning. I sidste ende, det producerede en in vitro toksikologiske profil for hver HPHC. Multi-omik tilgange kan også anvendes til yderligere at supplere HCS-analyse. Dette ville endelig også give en dybere forståelse af virkningerne på cellesignalering og / eller transkriptionel niveau.
Protocol
1. Høst Normal humane bronchieepithelceller (NHBEs)
- Pre-varme celledyrkningsmediet (bronkial epitelcellevækst medium-suppleret medium), HEPES, trypsin, og trypsin neutraliserende opløsning (TNS) i vandbad ved 37 ° C.
- Cellerne høstes, når 80% af konfluens er nået.
BEMÆRK: Følgende NHBE cellekultur podning betingelser kan benyttes til at opnå optimal konfluens i ikke-overtrukne T75-kolber med 20 ml medium:- Såsæd 1 x 10 6 celler til 3-dages kultur, 0,5 x 10 6 celler for 4-dages kultur og 0,25 x 10 6 celler til 5 dages kultur. Skift medium hver 2 dage, hvor cellerne er i kultur at opdatere næringsstoffer. Dyrke celler ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fjern supernatanten fra kolben (er) og tilsæt HEPES at vaske cellerne (f.eks., 3 ml til en 75 cm2 kolbe). Rotere hver kolbe til dækning af cellemonolaget med HEPES solution.
- Fjern HEPES opløsning og tilsæt trypsin-opløsning (f.eks., 3 ml til en 75 cm2 kolbe). Rotere kolben til dækning cellemonolaget med trypsin opløsning.
- Inkubér kolben i 5 minutter ved 37 ± 2 ° C. Overvåg celle løsrivelse under lup og om nødvendigt inkuberes længere og forsigtigt trykke kolben for at frigøre de resterende vedhæftede celler.
- Tilføj TNS at standse reaktionen (f.eks., 3 ml til en 75 cm2 kolbe) og overføre cellesuspensionen til et 15 ml rør.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 300 x g i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og resuspender cellepelleten i 10 ml frisk medium, blanding forsigtigt for at give en homogen cellesuspension.
- Filtrer cellesuspensionen gennem en 100 uM cellefilter at fjerne aggregater og tælle cellerne. Bemærk: I vores laboratorium blev et elektrisk felt flerkanals celletælling system, der anvendes til præcist og konsekvent evaluere viable celler nummer.
2. Real Time Cell Analyzer (RTCA) -baseret Dose Range Finding (DRF)
BEMÆRK: En impedans-baserede målesystem blev brugt til: 1) at evaluere sammensatte toksicitet, 2) udvalgte forbindelser skal undersøges nærmere af HCS og 3) vælge passende doser for HCS. De NHBE celler i RCTA pladerne doseres ved tilsætning af 25 pi af testforbindelse fortyndinger til 100 pi medium til stede i hver brønd. Derfor er alle testopløsningerne fremstillet med 5 gange (5x) den ønskede slutkoncentration.
- Seeding NHBE Celler
- Programmere instrumentet for at definere antallet og varigheden af impedansmålinger. I denne undersøgelse blev data indspillet hver 15 min i 48 timer (fra 24 timer ± 2 timer før og 24 timer efter dosering af cellerne med testmidler).
- Mål plade baggrund ved pipettering 50 pi foropvarmet medium i hver brønd i en 96-brønds RTCA plade. Bemærk: Dette trin repræsenterer et teknisk kravfor instrumentet at beregne det medium elektriske modstand som derefter anvendes som en basislinie reference for cellebaseret beregning.
- Der fremstilles en cellesuspension ved en koncentration på 144.000 celler / ml (± 5%), og der tilsættes 50 ul cellesuspension (7.200 celler / brønd) til hver brønd i RTCA plade i hvilken 50 pl / brønd af medium blev allerede tilføjet til instrument baggrund måling.
- Lad cellerne adhærere i 30 minutter ved stuetemperatur, før de bringes ind i RTCA holderen (for at forbedre den homogene fordeling af cellerne). Inkubér RTCA plader i RTCA vugge i inkubatoren (37 ° C og 5% CO2), og begynd registreringen af data for det næste 24 ± 2 timer før dosering.
- Fortyndinger af HPHCs og positive kontroller
- Positiv kontrol Fortynding
- Fortynd Staurosporin stamopløsning (10 mM) 1:10 i DMSO (se tabel 3), og der tilsættes 5 pi af dilution til 195 ul medium for at opnå en 5x brugsopløsning.
- HPHC Fortynding
- Opløs / fortyndes HPHC i køretøjet (tabel 2) til at generere en 1 M stamopløsning. Fortynd hver HPHC stamopløsning 1:10 i medium til at generere en 100 mM løsning.
- Generere "forbindelse masterplade" ved at udføre en femtrins 01:10 seriefortynding hjælp medium + 10% køretøj til at opnå de 5x arbejdsopløsninger (figur 2). Bemærk: I sidste ende vil de endelige doser være: 0,2 uM, 2 uM, 20 uM, 0,2 mM, 2 mM, 20 mM. også forbereder dosis 0, svarende til det eneste køretøj, i dette trin.
- Dosering
- Pause RTCA instrument og åbne holderen for at fjerne pladen.
- Fjern pladen og læg den i pladen temperatur værktøj RTCA (designet til at stabilisere temperaturen i RTCA pladen under eksperimentelle procedurer uden for RTCAstation) for at undgå afkøling af celler, som kunne have indvirkning impedansmålingen.
- 25 pi 5x opløsning fra "forbindelse masterplade" til celler i tre eksemplarer fastholde den samme dosering rækkefølge som i forbindelsen masterplade (højeste dosis i den øverste række og vehikelkontrol i rækken nummer 7) (figur 2). Fjern ikke eksisterende (100 pi) cellekulturmedium.
- 25 pi 5x positiv kontrolopløsning til cellerne i den nederste række (halv-højre) uden at fjerne eksisterende dyrkningsmedium. Tilsæt 25 pi medium til cellerne i den nederste række (halv-venstre) uden at fjerne eksisterende cellekulturmedium.
- Forsegl pladen med pladeforsegler. Pladen tilbage i RTCA holderen og lås den. Genstart dataregistrering for den ønskede eksponeringstid (f.eks., 24 timer). Bemærk: Brugen af denne fugemasse film anbefales at undgå potentiel forurening, herunder velhavende godt krydskontaminering.
- <strong> Dataanalyse RTCA og LD 50 Beregning
- Eksport rå data som tekst (.txt) eller excel (.xls) fil. Bemærk: Filen vil indeholde alle de oplysninger om pladen layout (forbindelser, doser og godt position). Rå celle indeksværdier er organiseret i en 96 brønds format (spejling plade godt distribution) og leveres til hver tidspunkter, hvor optagelsen fandt sted. Værdien ved position I i 96 brønd pladen på tidspunktet t er betegnet med CI t (i).
- Identificere som en Normaliseringsreferencen det seneste tidspunkt før dosering for hver position i i 96 brønd pladen (f.eks Cell Index ved 23 timer 50 min 00 sekunder ved position I, CI t (i) = 23: 50: 00 = CI Ref (i)). Bemærk: Disse oplysninger skal påtegnes, når doseringen udføres.
- Divide, på et godt grundlag, hver gang point værdier ved normaliseringsreferencen at normalisere alle værdier på doseringen tid. Den normaliserede værdi ved positioni i pladen med 96 brønde på tidspunktet t betegnes med NCI t (i) og er således defineret af NCI t (i) = CI t (i) / CI Ref (i) for alle t.
- Beregne arealet under kurven (AUC) ved 24 timer efter dosering for hver prøve i (position I i 96-brønds plade), herunder positioner for positiv kontrol og køretøjet.
- Opnå AUC i position I opnås som summen af områderne af hver firkant, hver firkant er mellem to tidspunkter angivet ved t k og t l (t k <t l); beregne hvert rektangel område ved hjælp x * y med x = t l - t k er afstanden mellem to tidspunkter og Y er middelværdien af aktiviteten af de to tidspunkter (Y = (NCI tk (i) + NCI tl (i)) / 2).
Bemærk: AUC ved 24 timer efter dosering i position I er angivet ved AUC (i). Som alle betingelserne udplades i tredobbelte brønde anvendes medianen af de tre værdier.
<li> normalisere værdierne ved hjælp af følgende ligning: - Opnå AUC i position I opnås som summen af områderne af hver firkant, hver firkant er mellem to tidspunkter angivet ved t k og t l (t k <t l); beregne hvert rektangel område ved hjælp x * y med x = t l - t k er afstanden mellem to tidspunkter og Y er middelværdien af aktiviteten af de to tidspunkter (Y = (NCI tk (i) + NCI tl (i)) / 2).
hvor i er positionen i 96-brønds plade, for hvilke AUC blev beregnet til 24 timer efter dosering,
Køretøjet er medianen af AUC-værdier for køretøjet brønde på en plade ved 24 timer efter dosering,
Positiv kontrol er medianen af AUC-værdierne for de positive kontrolbrønde på en plade ved 24 timer efter dosering,
CR er den ønskede median normaliserede værdi for køretøjet (0%), og
SC er den ønskede medianen normaliserede værdi for de positive kontroller (-100%)
BEMÆRK: Ved afslutningen af dette trin opnås et datasæt, der indeholder, for hver position i i 96 brønd pladen, en koncentration ci (i logaritmiske enheder), der anvendes på prøven indeholdt i position / brønd i og dens tilsvarende normaliseret AUC ved 24 timer efter dosering AUC_normalized (i). - Plot og monter (ci, AUC_normalized (i)) -værdier under anvendelse af en 4-parametre Hill-ligningen. Når det er muligt, også beregne LD 50.
hvor Y = AUC_normalized,
Nul Aktivitet S 0 = Aktivitetsniveau ved nul koncentration af test forbindelsen,
Infinite Aktivitet S inf = Aktivitetsniveau på uendelig koncentration,
AC50 = koncentration, ved hvilken aktivitet når 50% af maksimale niveau,
Hill-koefficient n = Mål af skråningen ved AC50, og
c = koncentration i logaritmiske enheder svarende til værdierne på x-aksen i kurven plot dosis-respons.
BEMÆRK: AC50 svarer til LD 50 (cytotoksicitetsassays). Det er et mål for styrke, hvor lave værdier indikerer høj styrke.
- Positiv kontrol Fortynding
3. Måling toksikologiske virkninger af HCS
BEMÆRK: I alt ni multi-parametriske markører for toksicitet, grupperet i seks forskellige assays, der er målt ved anvendelse af HCS platform (tabel 1). Baseret på RTCA cellelevedygtigheden analyse (Afsnit 2) dosisområdet af hver bestanddel er defineret, og en 3R4F referencedosis er også inkluderet. Henvisningen dosis svarer til den mængde HPHC stede i røgen fra en pind fra henvisningen cigaret 3R4F.
- Seeding NHBE Celler
- Der fremstilles en cellesuspension på 120.000 celler / ml (± 5%), og der tilsættes 100 pi cellesuspension til hver brønd i en 96-brønds HCS plade (12.000 celler / brønd). Forbered nok plader til vurdering af alle analyser (cytotoksicitet DNA skader, Stress-kinase, ROS, GSH indhold og apoptose) og tidspunkter (4 og 24 timers).
- Lad HCS plader ved stuetemperatur i 30 minutter for at tillade celler at vedhæfte til brønde og derefter inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 ± 2 timer før dosering.
- Fortynding af HCHPs og positive kontroller
BEMÆRK: NHBE celler i HCS pladerne vil blive doseret ved tilsætning af 25 pi af test- prøveopløsninger til 100 pi medium, der allerede er til stede i hver brønd. Derfor er alle doser fremstilles ved 5x den ønskede slutkoncentration.- Positive Controls Fortynding (positiv kontrol Plate)
- Dispensere 40 pi stamopløsning af hver positiv kontrol (se tabel 3) i kolonne # 2 (figur 4a, brønde skraverede med rødt). Dispenser 20 ul køretøj i kolonner # 3 og # 5 (figur 4a, brønde skraverede i lyseblå) og 40 pi køretøj i kolonne # 4 (figur 4a, brønde skraverede i lyseblå).
- Træk 12 pi fra brøndene i kolonne # 2, dispensere det til brøndene i kolonne # 3 og bland (figur 4b), Fortsætte indtil en endelig seriel fortynding med 3 doser (d1, d2, og D3) og vehikel (v) for hver positiv kontrol forbindelse opnås (figur 4c). For at generere den positive kontrol plade, forberede en 1:40 fortynding af forbindelser i medier (figur 4d).
- HPHC Fortynding (Forbindelse Master Plate)
BEMÆRK: den valgte dosis intervaller af HPHCs for HCS er anført i tabel 2.- Fortynd hver HPHC stamopløsning (1 M) 1:10 i medium for en koncentration på 100 mM. Udføre fortyndinger under anvendelse medium med 10% køretøj for at opnå de udvalgte 5x doser for hver HPHC.
- Positive Controls Fortynding (positiv kontrol Plate)
- Dosering
- Tilsæt 25 pi 5x løsninger fra forbindelsen masterpladen til cellerne i tre eksemplarer opretholde den samme dosering rækkefølge som i forbindelsen masterplade (højeste dosis i den øverste række og vehikelkontrol i rækken nummer 7) (figur 5). Fjern ikke eKSISTERENDE (100 pi) celledyrkningsmedium.
- Tilsæt 25 pi 5x opløsning fra den positive kontrol plade til cellerne i den nederste række fastholde den samme dosering rækkefølge som i den positive kontrol plade (figur 5). Fjern ikke eksisterende (100 pi) cellekulturmedium. Bemærk: Hver analyse har en specifik positiv kontrol; se tabel 3. Inkubér pladen ved 37 ° C og 5% CO2 i den ønskede behandlingstid (4 eller 24 timer).
- Farvning
- Forberedelse til alle Assays
- Pre-varme Wash buffer (PBS) opløsninger ved 37 ° C.
- Forbered Fiksering opløsning (4% formaldehydopløsning) tilsætning 10,81 ml 37% formaldehyd til 89,19 ml vaskebuffer og forvarmningen ved 37 ° C.
- Forbered Permeabilisering puffer ved tilsætning af 10 ml 10x permeabilisering puffer til 90 ml vaskebuffer og forvarmningen ved 37 ° C.
- Forbered Blocking puffer ved tilsætning af 10 ml 10x blokerende buffer til 90 ml vaskebuffer og forvarmningen ved 37 ° C.
- Pre-varme celledyrkningsmediet ved 37 ° C.
- Fjern HCS pladerne fra inkubatoren, når de 4 og 24 timers eksponeringstid er nået, og udføre følgende specifikke protokoller for hver analyse.
- cytotoksicitetsanalyse
- Forbered et tilstrækkeligt volumen (V) af levende celler farvningsopløsning efter følgende formel: Volumen af medium (pi) V = 50 x B x 1,2 (W antal brønde)
- Fortynd Mitokondrier farvestoffet i levende celler farveopløsning ifølge leverandørens instruktion. Fortynd membranpermeabilitet farvestoffet i levende celler farveopløsning ifølge leverandørens instruktion.
- Der tilsættes 50 pi Levende cellefarvning opløsning til hver brønd i pladen (er) betegnet "Cytotoksicitetsassay". Fjern IKKE celledyrkningsmedium og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO
- Forsigtigt aspirere mediet og farvning og der tilsættes 100 gl / brønd af fiksering opløsning til hver brønd, derefter inkuberes pladen (er) i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Forsigtigt aspirere fiksering opløsning og vask en gang med 100 pi / brønd vaskebuffer.
- Fjern vaskebuffer og tilsæt 100 pl / brønd 1x permeabilisering buffer til hver brønd og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Aspirer permeabilisering puffer og vask pladen to gange med 100 pl / brønd af vaskepuffer.
- Aspirer vaskebuffer, og 100 pi 1x blokerende buffer til hver brønd og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Forbered et tilstrækkeligt volumen (V), i Primær antistofopløsning efter følgende formel: Volumen af blokeringsbuffer (pi) V = 50 x B x 1,2 (W antal brønde). Fortynd anti-cytochrom C-antistof (mus) 1: 250 i Primary Antibody Solution.
- Aspirer blokerende buffer etd tilsættes 50 pl / brønd Primært antistof opløsning til hver brønd og inkuberes i 60 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Forbered en tilstrækkelig volumen (V) af sekundært antistof og nuklear Solution efter følgende formel: Volumen blokerende buffer (pl) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brønde). Fortynd anti-muse-antistof 1: 500 i sekundært antistof og nuklear Solution. Fortynd Nuclear farvestof 1: 1.000 i sekundært antistof og nuklear Solution.
- Aspirer Primær antistofopløsning og vask pladen tre gange med 100 pl / brønd af vaskepuffer ved hjælp af pladevasker.
- Aspirer vaskebuffer og tilsættes 50 pl / brønd af sekundært antistof og nuklear opløsning til hver brønd i pladen (er) og inkuberes i 60 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Aspirer sekundært antistof og nuklear Solution og vask pladen tre gange med 100 pl / brønd af vaskepuffer ved hjælp af pladevasker. Der tilsættes 100 gl / brønd af vaskepuffer. Plate (s) er (er) nuklar til at blive evalueret på HCS læseren.
- DNA Damage Assay
- aspireres forsigtigt mediet fra pladerne udpegede "DNA skade".
- Udfør de samme trin som beskrevet i rækkefølge: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Bemærk, at i dette tilfælde er kun medium fjernes under trin 3.4.2.4.
- Forbered et tilstrækkeligt volumen (V), i Primær antistofopløsning efter følgende formel: Volumen af blokeringsbuffer (pi) V = 50 x B x 1,2 (W antal brønde)
- Fortynd anti-phospho H2AX antistof (mus) 1: 2.000 i Primary Antibody Solution.
- Udfør den samme trin som beskrevet i 3.4.2.10.
- Forbered en tilstrækkelig volumen (V) af sekundært antistof og nuklear Solution efter følgende formel: Volumen blokerende buffer (pl) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brønde)
- Fortynd anti-muse-antistof 1: 500 i sekundært antistof og nuklear Solution.
- Fortynd NucleaR farvestof 1: 1.000 i sekundært antistof og nuklear Solution.
- Udfør de samme trin som beskrevet i rækkefølge: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- Stress kinaseassay
- aspireres forsigtigt mediet fra hver af pladerne betegnelsen "Stress kinase".
- Udfør de samme trin som beskrevet i rækkefølge: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Bemærk, at i dette tilfælde er kun medium fjernes under trin 3.4.2.4.
- Forbered et tilstrækkeligt volumen (V), i Primær antistofopløsning efter følgende formel: Volumen af blokeringsbuffer (pi) V = 50 x B x 1,2 (W antal brønde)
- Fortynd anti-phospho cJun antistof (kanin) 1: 200 i Primary Antibody Solution.
- Udfør den samme trin som beskrevet i 3.4.2.10.
- Forbered en tilstrækkelig volumen (V) af sekundært antistof og nuklear Solution efter følgende formel: Volumen blokerende buffer (pl) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brønde)
- Fortynd anti-kanin-antistof 1: 500 i sekundært antistof og nuklear Solution.
- Fortynd Nuclear farvestof 1: 1.000 i sekundært antistof og nuklear Solution.
- Udfør de samme trin som beskrevet i rækkefølge: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- ROS Assay
- Forbered et tilstrækkeligt volumen (V) af levende celler farvningsopløsning efter følgende formel: Volumen af medium (pi) V = 50 x B x 1,2 (W antal brønde).
- Fortynd ROS farvestof Live cellefarvning Opløsning ifølge sælgeren instruktion
- Fortynd Nuclear farvestof 1: 1000 Live cellefarvning Solution.3.4.5.4) Tilsæt 50 pi Levende Cell Farvning til hver brønd plader udpeget "ROS"; Fjern IKKE celledyrkningsmedier og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Forsigtigt aspirere mediet og farveopløsning og vask pladen tre gange med 100 pl / brønd medium.
- Aspirer mediet, tilsættes 100 _6 l / brønd fiksering opløsning til hver brønd og inkuberes pladen i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Forsigtigt aspirere fiksering opløsning og vask pladen tre gange med 100 pl / brønd vaskebuffer.
- Der tilsættes 100 pl / brønd vaskebuffer. Plate (s) er (er) nu klar.
- Evaluere pladen på HCS læseren inden for 1 time.
- GSH Content Assay
- Forbered et tilstrækkeligt volumen (V) for Live Cell Nuclear farveopløsning efter følgende formel: Volumen af medium (pi) V = 50 x B x 1,2 (W antal brønde).
- Fortynd Nuclear farvestof (Far rød) 1: 1000 Live Cell Nuclear Farvning Solution.3.4.6.3). Der tilsættes 50 pi levende celler nukleær farvning opløsning til hver brønd i pladerne under betegnelsen "GSH-indhold". Fjern IKKE celledyrkningsmedier og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Forbered en tilstrækkelig volumen (V) Live Cell GSH farveopløsning i henhold til denfølgende formel: Volumen af HBSS (pl) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brønde)
- Fortynd GSH farvestof Live Cell GSH farveopløsning efter leverandørens anvisninger.
- aspireres forsigtigt mediet og nukleare farvningsopløsning og vask pladen tre gange med 100 pl / brønd medium.
- Aspirer medium og tilsæt 100 pl / brønd af levende celler GSH Farvning opløsning til hver brønd i pladen (s).
- Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Plate (s) er (er) nu klar.
- Evaluere plade (r) på HCS Reader i 1 time.
- Apoptose Assay
- Forbered et tilstrækkeligt volumen (V) af levende celler farvningsopløsning efter følgende formel: Volumen af medium (pi) V = 50 x B x 1,2 (W antal brønde).
- Fortynd Caspase farvestof 1: 300 i levende celler farvningsopløsning.
- Fjern celledyrkningsmedier tilsættes 50 pi levende celler farvningsopløsning til hver brønd af than plade (r) betegnes "Apoptose" og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Forbered et tilstrækkeligt volumen (V) for Live Cell Nuclear farveopløsning efter følgende formel: Volumen af Fix opløsning (pi) V = 50 x B x 1,2 (W antal brønde).
- Fortynd Nuclear farvestof 1: 1000 Live Cell Nuclear Farvning Solution.
- Fjern den levende celle farveopløsning, tilsættes 100 pl / brønd af levende celler nukleær farvning opløsning til hver brønd i pladen (er) og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Aspirer fiksativ / nuklear farveopløsning og vask plade (r) tre gange med 100 pl / brønd vaskebuffer.
- Der tilsættes 100 pl / brønd vaskebuffer. Plate (s) er (er) nu klar.
- Evaluere plade (r) på HCS læseren.
- Forberedelse til alle Assays
- Dataanalyse HCS
- Eksport rådata som excel (.xls) fil. Bemærk: Rå celle indeksværdier er organiseret i en 96 brønd formularpå (spejling plade godt distribution) og leveres til hver slutpunkter på et givet tidspunkt efter dosering.
- Normalisere værdier ved hjælp af følgende ligning:
hvor i er den målte rå signalværdi af en brønd,
Køretøjet er medianen af de målte signalværdier for køretøjet brønde på en plade,
CR er den ønskede median normaliserede værdi for køretøjet (0%), og
SC er den ønskede medianen normaliserede værdi for de positive kontroller (100),
BEMÆRK: Ved afslutningen af dette trin opnås et datasæt, der indeholder, for hver position i i 96 brønd pladen, en koncentration c I (i logaritmiske enheder), der blev påført prøven indeholdt i position / brønd i og dens tilsvarende normaliserede signal N (i). - Plot og monter (ci, N (i)) - værdier ved hjælp af en 4-parametre Hill-ligningen.
hvor Zero Aktivitet S 0 = Aktivitetsniveau ved nul koncentration af test forbindelsen,
Infinite Aktivitet S inf = Aktivitetsniveau på uendelig koncentration,
AC50 = koncentration, ved hvilken aktivitet når 50% af maksimale niveau,
Hill-koefficient n = Mål af skråningen ved AC50, og
c = koncentration i logaritmiske enheder svarende til værdierne på x-aksen i kurven plot dosis-respons.
BEMÆRK: AC50 er et mål for styrken, hvor lave værdier indikerer høj potens.
Representative Results
RTCA
Fordi HCS endepunkter ikke vil være oplysende når der ikke registreres toksisk virkning, de forbindelser, der ikke udviser nedsat cellelevedygtighed op til den højeste koncentration i RCTA ikke testet af HCS (figur 3b, c, d, g, k, l, m , s). Forbindelser viser nedsat levedygtighed celle på kun den højeste koncentration (figur 3e, o) er også fravalgt for HCS. Endelig er det kun de bestanddele med en beregnelig LD 50 (<20 mm) udvalgt til yderligere HCS-analyse (figur 3a, f, h, j, n). HPHCs opfylder ovennævnte kriterier er: 1-aminonaphtalene, Arsen (V), chrom (VI), Crotonaldehyd og Phenol.
HCS
Som Kvalitet Check (QC), positive kontroller er first analyseres for at sikre, at farvningsprocedure er korrekt udført. Repræsentative billeder af positive kontrolceller-behandlede celler er vist i figur 6. Dataværdier normaliseres til køretøj som tidligere beskrevet. Ingen dosisresponskurver plottes som kun tre doser er testet og ikke alle tre doser betragtes på hver gang-point. Positive doser kontrol er valgt (baseret på tidligere eksperimenter, data ikke vist), således at passende svar overholdes for hvert endepunkt på både 4 timer og 24 timer. Navnlig doser 1 og 2 anvendes til at evaluere virkningen på 4 timer, mens doser 2 og 3 anvendes til at evaluere virkningen ved 24 timer. Plader kasseres, hvis der observeres nogen reaktion for den positive kontrol doser. Bemærk, at for alle de endpoints, undtagen mitokondrie membranpotentiale og GSH-indhold, forventes en stigning i signalintensiteten.
Alle forbindelser, undtagen Phenol, inducerede en nekrotisk pheno type, baseret på forøget permeabilitet cellemembranen (figur 7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, chrom (VI), blev Crotonaldehyd og Phenol identificeret som værende genotoksisk baseret på forøget phosphorylering af histon H2AX (figur 7e, j, n, p). Phenol og 1-aminonaphtalene viste sig at fremkalde alvorlig mitokondriel dysfunktion (figur 7b, o), der med en-aminonaphtalene, førte til en øget cytochrom C frigivelse (figur 7c). Påvisning af øget caspase 3/7 aktivitet fremlagde dokumentation for apoptotisk begivenhed på krom eksponering. Oxidativt stress induktion (ROS eller GSH) blev også påvist ved behandling med 1-aminonaphtalene, Crotonaldehyd og Phenol (figur 7d, m, q). Endelig Arsen inducerer celle stress som vist ved den forøgede phosphorylering af transkriptionsfaktoren cJun (figur 7g).
belastning / 53.987 / 53987fig1.jpg "/>
Figur 1. Forbindelse Tox-Profiler Workflow. A) Skematisk af arbejdsgangen fulgte i denne undersøgelse. Først blev en dosis-range finding udført ved hjælp af RTCA platform til at vælge passende doser til efterfølgende HCS at karakterisere sammensatte-specifik toksicitet profiler. B) Eksperimentel design af undersøgelsen. 24 timer efter podning blev cellerne doseret og impedansværdier overvåges løbende over følgende 24 timer, mens HCS-endepunkter blev undersøgt 4 og 24 timer efter dosering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. RTCA Exposure Plate. Forbindelse masterplade genereres først ved at udføre en femtrins 01:10 seriefortynding. Hver forbindelse,herunder vehikelkontrollen (dosis 0) tilsættes derefter in triplo til pladen eksponering sammen med medium og Staurosporin som kontroller. Bemærk, at doserne sekvens opretholdes ved overdragelse, højeste doser er i række nummer 1, mens kontroller køretøjer er i række nummer 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. repræsentant RTCA cellelevedygtighed Resultater. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropan, c) acetamid, d) Acetone, e) acrylamid, f) Arsen (V), g) benzen, h) Chrom (VI) , j) Crotonaldehyd, k) methylethylketon, l) Nickel (II), m) nitrobenzen, n) Phenol, o) quinolin, s) toluen. Ved 24 timer efter dosering, blev arealet under kurven (AUC) beregnes for hver dosis (herunder positiv kontrol og bærestof) og normaliseret i et område fra 0 til -100% aktivitet (y-aksen), hvor 0 afspejler aktiviteten af køretøjet og -100 af den positive kontrol. Værdier blev derefter plottet og monteres med en fire-parameter Hill-ligningen og, når det er muligt, blev LD 50 beregnet. Koncentrationerne er udtrykt på en log skala (x-aksen). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Fortynding Ordning for positiv kontrol forbindelser til HCS Analyser. A) Tilsætning af Positive kontroller og vetøjets til den serielle fortynding pladen. b) Seriel fortynding af de positive kontroller. c) 200X positive kontrolprøver doser. de) fortynding af 200x positive kontrolprøver doser i medium (1:40) for at frembringe den positive kontrol plade indeholdende 5x doser. Bemærk, at hver dosis fortyndes i tre eksemplarer til at afspejle det endelige layout i pladen eksponering). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. HCS Exposure Plate. Forbindelse masterplade genereres først ved at udføre en fem-trins fortynding. Hver forbindelse, herunder kontrollen køretøj (dosis 0) tilsættes derefter in triplo til pladen eksponering sammen med de positive kontroller. Bemærk, at doser orden opretholdes ved overdragelse,højeste doser er i række nummer 1, mens kontroller køretøjer er i række nummer 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Repræsentant Fluorescerende Billeder af antistof- eller Dye-farvede celler a) Nuclear parametre - Nuclear farvestof:. En gennemtrængelig farvestof, der binder sig til DNA i levende eller faste celler. Denne plet bruges til at identificere de enkelte celler mærkning det nukleare område b) Nekrose - gennemtrængelighed Cell membran farvestof:. Dye-baseret detektion af cellemembranens integritet. Reagens er uløseligt impermeabel for cellemembranen. Under nekrose, membranen bliver permeabel og farvestoffet kommer ind i cellen og binder til DNA frembringe et stærkt fluorescerende s. ignal c) Apoptose - Cytochrom C: Antibody-baseret detektion af cytochrom c-frigivelse, en velkendt kendetegnende for tidlig apoptose. Efter induktion af apoptose, er cytochrom c frigivet fra mitokondrier og diffunderer ind i kernen d) DNA Damage - pH2AX:.. Antistof-baserede påvisning af phosphorylering af histon H2AX, en velkendt kendetegnende for dobbeltstrenget DNA-brud e) Stress Kinase - cJun:. antistof-baserede påvisning af phosphorylering ved Ser-73 i cJun, en velkendt kendetegnende for cellulær stress f) Oxidativ stress - DHE: Dye-baseret detektion af superoxidradikaler. Dihydroethidium selv fluorescerer blåt i cytoplasmaet, mens den oxiderede form ethidium fluorescerer rødt på DNA indlejring g) GSH - mBcl:. Dye-baseret detektion af frie GSH molekyler. mBcl reagerer med GSH tilgenerere et stærkt fluorescerende produkt h) Apoptose - Caspase 3/7 aktivering:. Dye-baseret detektion af caspase 3/7 aktivitet. Reagens er ikke-fluorescerende med en fire aminosyre peptid, der inhiberer DNA-binding. Ved caspase-3/7-aktivering, spaltes peptidet muliggør farvestoffet til at binde til DNA og producere en lys, fluorogent respons. Paneler bh viser positive kontrol-behandlede celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. repræsentant HCS Resultater. 1-aminonaphtalene (ae), arsen (V) (f og g), chrom (VI) (HK), Crotonaldehyd (ln) og phenol (OQ). 4 t (blå linje) og24 HR (orange linje) signaler blev beregnet for hver dosis og normaliseret til køretøjets aktivitet (0%). Værdier, der ikke indgår i kurvetilpasning beregninger er vist i gråt. Koncentrationerne er udtrykt på en log skala (x-aksen). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Assay | endpoint # | Biologisk endpoint | cellerum | Output funktionen |
| cytotoksicitet | 1 | Mitokondriemasse 6 | cytoplasma | Spot gennemsnitlige areal |
| 2 | Mitokondrielle membranpotentiale 6 | cytoplasma | Spot gennemsnitlig intensitet | |
| 3 | Cytochrom C frigivelse | nucleus | gennemsnitlig intensitet | | |
| 4 | Cellemembranpermeabilitet 8 | nucleus | gennemsnitlig intensitet | |
| DNA Damage | 5 | phospho-H2AX 9 | nucleus | gennemsnitlig intensitet |
| Stress kinase | 6 | phospho-cJun 10 | nucleus | gennemsnitlig intensitet |
| ROS | 7 | ROS 11 | nucleus | gennemsnitlig intensitet |
| GSH-indhold | 8 | GSH 12 | cytoplasma | Spot gennemsnitlig intensitet |
| Apoptose | 9 | Caspase 3 13 | cytoplasma | Spot gennemsnitlig intensitet |
Tabel 1. Liste over HCS enssays og endpoints.
| Køretøj | RTCA doser (uM) | LD 50 | HCS doser | |||||||||||
| Cellelevedygtighed-udvalgt (uM) | 3R4F (nM) | |||||||||||||
| 1-Aminonaphtalene | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 280 uM | 2.000 | 500 | 200 | 150 | 0,27 | |
| 2-Nitropropane | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| acetamid | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Acetone | Vand | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| akrylamid | Vand | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Arsen (V) | Vand | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 160 uM | 200 | 100 | 50 | 25 | <td> 0,17||
| Benzen | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Chrom (VI) | Vand | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 20 uM | 100 | 50 | 20 | 10 | 0.06 | |
| crotonaldehyd | Vand | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 200 uM | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2.000 | |
| Methylethylketonkrystallisering | Vand | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| Nikkel | Vand | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| nitrobenzen | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Phenol | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 2.300 uM | 5.000 | 2.000 | 1.000 | 500 | 240 | |
| quinolin | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 0.2 | > 20 mM | |||||||
| Toluen | Vand | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
Tabel 2. Liste over Testet HPHC Forbindelser med relativ LD 50 ved 24 timers behandling. Forbindelser udvalgt til HCS-analyse er fremhævet i orange og testede doser er også givet. Den 3R4F dosis svarer til mængden af bestanddel til stede i røgen fra en pind fra henvisningen cigaret 3R4F.
| Assay | Forbindelse | stamopløsning | opløsningsmiddel Dosis (er) (uM) | |||
| cellelevedygtighed | staurosporin | 10 mM | DMSO | 50 | ||
| cytotoksicitet | valinomycin | 10 mM | DMSO | 50 | 20 | 5 |
| DNA Damage | Paraquat | 100 mM | DMSO | 500 | 200 | 50 |
| Stress kinase | anisomycin | 2 mM | DMSO | 10 | 4 | 1 |
| ROS | rotenon | 200 mM | DMSO | 1.000 | 400 | 100 |
| GSH-indhold | ethacrynsyre | 200 mM | DMSO | 1.000 | 400 | 100 |
| Apoptose | staurosporin | 40 mM | DMSO | 200 </ Td> | 50 | 20 |
Tabel 3. Liste over positive kontroller og anvendte koncentrationer for hver analyse.
Discussion
Behovet for alternativer til dyreforsøg og til nye high throughput test tilgange er ofte blevet diskuteret i de seneste år. Dette har ført forskere og regulerende myndigheder til at undersøge alternative metoder til standard toksicitet, udnytte cellulære assays, der nøje efterligner fysiologi målvæv. I dette studie har vi vist anvendeligheden af at kombinere en real-time celle analysator (RTCA) med et højt indhold screening (HCS) platform til at vurdere virkningen af eksponering for enkelte CS vælgere på humane lunge epitelceller. Denne opsætning kan analogt anvendes til at vurdere cytotoksicitet induceret af forskellige andre luftbårne forurenende stoffer, luftbårne partikler og nanopartikler. Desuden kan de opnåede resultater blive matchet med dem fra hel-genom transcriptomics og beregningsmetoder baseret på kausale biologiske netværk. Som tidligere rapporteret, denne tilgang tilladt os at bekræfte data om molekylær vejforstyrrelse på CS eksponering 5 med HCS endpoints, som omhandler disse pathway forstyrrelser også fænotypisk.
Som et flowchart assay, real-time-celle analyse giver cellelevedygtighed-relaterede oplysninger på en dosis- og tidsafhængig opløsning, som giver bedre beslutningsgrundlag hvilken dosis og eksponeringstid punkt kan være gunstige for nedstrøms analyse 14. Princippet i analysatoren er afhængig af ændringer i elektrisk impedans frembragt af cellerne som de tillægger og spredes på en kultur brønd overflade dækket med en guld mikroelektrode. Impedansen omdannes til en dimensionsløs parameter navngivet celle-indeks, som kan anvendes til at overvåge celleadhæsion, spredning, morfologi og i sidste ende cellelevedygtighed. Selvom denne teknik ikke indeholder oplysninger om cytotoksiske mekanismer, dens følsomhed muliggør påvisning af morfologiske celleforandringer selv ved meget lave doser, hvor HCS er ikke informativ (data ikke vist). Baseret på tidli-skellige eksperimenter har vi bemærket, at RTCA metodologi kan detektere morfologiske ændringer ved lavere doser sammenlignet med HCS endpoints.
Efter indledende screening med real-time celle analysator blev en HCS platform, der anvendes til at få mere dybdegående information om den slags cytotoksicitet fremkaldt af hver HPHC. Den HCS assay panel lov til at profilere HPHCs til deres potentielle indvirkning på cellulære rum / organeller samt at identificere dem, fremkalde genotoksicitet eller oxidativ stress. Analysen afslørede distinkte profiler, hvorved de udvalgte HPHCs inducerer cytotoksicitet i NHBE-celler. I almindelighed alle forbindelser undtagen phenol, blev fundet at inducere nekrose ved de højeste testede doser. I overensstemmelse med en potentiel rolle i udviklingen af kræft 1-aminonaphtalene induceret fosforylering af H2AX som markør for genotoksicitet, men HCS panelet også udækket aktiviteten af dette HPHC i mitokondrietoksicitet udlæsning (masse øget og cytochrom C ReleaSE) og oxidativt stress (GSH udtømning). Ligeledes som tidligere beskrevet, Phenol blev identificeret til at inducere mitokondriel dysfunktion, og forårsage DNA-skader samt GSH udtynding. Chrom (VI), en af forbindelserne, der er klassificeret som gruppe I carcinogener, og Crotonaldehyd blev også begge identificeret som genotoksisk, især chrom (VI) også induceret apoptose (caspasekaskaden aktivering) og Crotonaldehyd forårsagede forøget ROS-generering. Endelig Arsen (V), viste sig at inducere cJun phosphorylering, som er en markør for stress kinase pathway aktivering.
I denne undersøgelse anvendte vi NHBE-celler som en model for lunge epiteliale celler in vitro. Ved hjælp af disse celler i en HCS indstilling er uden fortilfælde og muliggjorde undersøgelse af en bredere vifte af endepunkter, herunder genotoksicitet og oxidativ stress markører. Både levende celler og faste cellefarvningsprocedurer fremgangsmåder blev beskrevet i vores protokoller, hvilket viser fleksibiliteten af den samlede teknik. I fhandling, kan de samme protokoller anvendes på et bredere spektrum af mål, der kan adresseres ved brug af noget fluorescerende farvestof eller antistof. For en vellykket gennemførelse af de levende farvningsprotokoller, er det vigtigt at overholde inkubationstiden, som nogle af farvestofferne har en begrænset halveringstid og fluorescenssignalet kan falde inden erhvervelsen billedet er afsluttet. Det er også vigtigt at overveje, at hvis der anvendes en anden celletype, alle farvning betingelser bør revurderes, da den optimale farvestof koncentration og inkubationstiden kan være anderledes.
I den aktuelle papir har vi beskrevet en situation, hvor kun fem forbindelser, hvor screenet med HCS metodologi. I betragtning af den tidligere beskrevne plade layout, blev de doseret over 2 forskellige plade sæt til i alt 24 plader (6 assays og 2 tidspunkter) .Den antal plader kan også forøges, hvilket tillader den samtidige screening af flere forbindelser eller de undersøgtegelse af flere endpoints. Forinden dog bør man tage i betragtning, at visse endpoints (GSH og ROS) kræver øjeblikkelig overtagelse, og som en konsekvens, bør udføres doseringen af pladerne i en forskudt måde at tillade erhvervelsen af den foregående plade. På den anden side, ved hjælp af en fast cellefarvning protokol udgør en fordel, da pladerne kan stables, afbryde protokollen på ethvert trin efter optagelsen, for færdiggørelse af farvningsproceduren på et senere tidspunkt. Denne tilgang, for eksempel, ville give operatøren tid til at færdiggøre alle live celle farvning plader uden at forringe kvaliteten af data.
For yderligere at optimere arbejdsgangen ved at reducere antallet af plader, ville det også være muligt at multiplekse flere endpoints sammen. For eksempel i denne sammenhæng DNA-skader og stress kinase kunne undersøges sammen blot at bruge to sekundært antistof med fluorokromer udsender i forskellige channels. Løbende udvikling af HCS platform, herunder fuldautomatisk cellepodning, forbindelse fortynding, dosering og farvning, samt tilføjelse af nye endepunkter vil yderligere udvide evne til HCS platform som en stærk profilering værktøj til HPHCs på epitel og andre celletyper .
Disclosures
Alle forfattere er ansat af Philip Morris International. Philip Morris International er den eneste kilde til finansiering og sponsor af dette projekt.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Karsta Luettich og Grégory Vuillaume for revision af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| Screener (HCS) | Genedata | NA | |
| CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
| Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
| ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Easy Flask filter cap 75 cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
| 96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
| ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
| GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
| GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
| Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
| Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
| Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
| Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
| Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10x permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
| 4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
| 10x blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
| Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
| Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
| Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
| 1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
| 2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
| Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
| Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
| Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
| Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
| Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
| Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
| Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
| Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
| Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
| Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
| Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
| Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).
