Abstract
Sigarettrøyk (CS) er en viktig risikofaktor for hjerte- og lungesykdommer. Fordi CS er et komplekst aerosol som inneholder mer enn 7000 kjemikalier en det er utfordrende å vurdere bidragene fra den enkelte ingrediens til sin generelle toksisitet. Toksikologiske profiler av individuelle bestanddeler samt blandinger kan imidlertid etablert in vitro, ved å bruke høy gjennomstrømning screening verktøy, som gjør det mulig for profilering av skadelige og potensielt skadelige bestanddeler (HPHCs) av tobakksrøyk, som definert av US Food and Drug Administration (FDA). 2
For en innledende vurdering, ble en impedans basert instrument som brukes for en real-time, etikett-fri vurdering av forbindelsens toksisitet. Instrumentet avlesning er avhengig av celle adhesjon, levedyktighet og morfologi som sammen gir en oversikt over cellen status. En dimensjonsløs parameter, kalt celle index, blir brukt for kvantifisering. Et sett med diflige flekker protokoller ble utviklet for en fluorescens bildebehandling basert undersøkelse og en HCS plattformen ble brukt for å få mer detaljert informasjon om hva slags cytotoksisitet utløst av hver HPHC.
Av de 15 testede bestanddeler, bare fem ble valgt for HCS-baserte analyser som de er registrert, en Computable LD 50 (<20 mm). Disse inkluderte en-aminonaphtalene, arsen (V), krom (VI), Crotonaldehyde og Fenol. Basert på deres virkning i HCS, kan en-aminonaphtalene og Fenol bli identifisert til å indusere mitokondriell dysfunksjon, og, sammen med krom (VI) som genotoksiske basert på den økte histone H2AX fosforylering. Crotonaldehyde ble identifisert som en oksidativt stress indus og Arsen som en stress kinase vei aktivator.
Denne studien viser at en kombinasjon av impedans-baserte og HCS-teknologi gir et robust verktøy for in vitro-evaluering av CS bestanddeler.
Introduction
Toksikologisk risikovurdering har historisk basert på bruk av dyremodeller som, selv om grunnleggende i biovitenskap, er også knyttet til mangler som inkonsekvent translatability til mennesker og høye kostnader. Videre har det vært en økende innsats for å finne alternativer til dyreforsøk i ånden av "The 3R" 2 (erstatning, reduksjon og raffinement). Dette arbeidet har blitt akselerert de siste årene, ikke bare på grunn av nylige fremskritt som high-throughput teknikker og systemer biologi tilnærminger, men også på grunn av lovgivning som begrenser bruken av dyreforsøk, spesielt i EU.
Kompleksiteten av cellulære signalveier som regulerer responsen på toksiske fornærmelser gjør det klart at ved hjelp av enkle toksikologiske endepunkter vil ikke være tilstrekkelig til å beskrive den toksikologiske grunnlag av visse forbindelser. For dette samspillet mellom hundrevis av samspill proteins som bidrar til et biologisk nettverk må også tas i betraktning. For å studere virkningen av giftstoffer på disse nettverkene, et system toksikologi tilnærming kombinert med fenotypiske middels- og high-throughput screening-analyser er nyttig for å utlede potenser og samtidig gi mer informasjon om virkningsmekanismen til de enkelte giftstoffer.
I denne studien benyttet vi HCS som et kraftig screeningverktøy, som er sammensatt av en automatisert mikroskop og et biologisk program, som kan skaffe, bearbeide og analysere bildedata som stammer fra bestemte fluorescens-basert cellulære tester. Dette gjør det mulig for visuelle endringer innenfor en celle som skal kvantifiseres, ved en enkelt celle eller subcellulære nivå, og mange parametere som skal analyseres samtidig. 3. For eksempel, ble DNA-dobbeltstrengbrudd evaluert ved anvendelse av en antistoffbasert identifikasjon av histon H2AX fosforylering og reaktive oksygenarter (ROS) ble kvantifisert ved anvendelse av en celle-permeable superoksid sensitive fargestoff.
Fordi lunge epitelceller representerer første biologisk barriere mot inhalerte miljøgifter, blant annet sigarettrøyk, benyttet vi primære bronkiale epitelceller som en in vitro modell for å profilere effekten av HPHCs utgitt av United States Food and Drug Administration. 4 Manuskriptet er en oppfølging -opp på en tidligere studie 5 der vi evaluerte den biologiske effekten av en annen undergruppe av HPHCs.
Som en del av vår arbeidsflyt for å vurdere cytotoksisitet in vitro, vi først evaluert potenser av et utvalg av 15 HPHC tallet, ved hjelp av en impedans-basert sanntids cellulær analyse (RTCA) system som tillater oss å etablere doseområder, egnet for etterfølgende HCS analyse (figur 1). En toksikologisk HCS vurderingen ble deretter utført ved hjelp av ni multi-paraendepunktene for cellulær toksisitet, hver overvåket på to tidspunkter (4 og 24 hr). Markørene som ble benyttet var en indikasjon på mitokondriell toksisitet, DNA-skade, stress-kinase, reaktive oksygenarter (ROS), glutation (GSH) -innhold, caspase 3 - 7-aktivitet, cytokrom C frigivelse og cellemembranen permeabilitet, som beskrevet i tabell 1.
Vår tilnærming aktivert identifikasjon og karakterisering av virkningen av sigarettrøk bestanddeler gjennom dose- og tidsavhengig sampling. Til syvende og sist, denne produsert en in vitro toksikologisk profil for hver HPHC. Multi-omics tilnærmingsmåter kan også brukes for ytterligere å utfylle HCS analyse. Dette vil til slutt også gi en dypere forståelse av virkningene på cellesignalisering og / eller transkripsjonsnivået.
Protocol
1. Høsting Normal menneske Bronkial Epitelceller (NHBEs)
- Forvarme cellekulturmediet (bronkiale epitel cellevekstmedium supplementert medium), den HEPES, trypsin, trypsin og nøytraliserende oppløsning (TNS) i vannbad ved 37 ° C.
- Høste celler når 80% av samløpet er nådd.
MERK: Følgende NHBE cellekultur poding betingelser kan anvendes for å oppnå optimal konfluens i ubelagte T75-kolber med 20 ml medium:- Seed 1 x 10 6 celler for tre-dagers kultur, 0,5 x 10 6 celler for 4-dagers kultur og 0,25 x 10 6 celler for 5-dagers kultur. Endre medium hver 2. dag når cellene er i kultur for å oppdatere næringsstoffer. Kultur cellene ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Fjern supernatanten fra kolben (e) og legge HEPES å vaske cellene (f.eks., 3 ml for en 75 cm2 kolbe). Rotere hver kolbe for å dekke cellemonolaget med HEPES solution.
- Fjern HEPES løsning og legge trypsin løsning (f.eks., 3 ml for en 75 cm 2 kolbe). Rotere kolben for å dekke cellemonolaget med trypsinoppløsning.
- Inkuber kolben i 5 min ved 37 ± 2 ° C. Overvåk celle avløsning under mikroskopet, og hvis nødvendig, ruge lengre og banke forsiktig på flasken for å løsne eventuelle gjenværende festet celler.
- Legg TNS for å stanse reaksjonen (f.eks., 3 ml for en 75 cm2 kolbe) og overføre cellesuspensjonen i et 15 ml rør.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 x g i 5 min.
- Kast supernatanten og re-suspen cellepelleten i 10 ml friskt medium, blandes forsiktig for å gi en homogen cellesuspensjon.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 100 uM celle sil for å fjerne aggregater og telle cellene. Merk: I vårt laboratorium et elektrisk felt flerkanals celletellingssystem ble brukt til å nøyaktig og konsekvent evaluere viable celler nummer.
2. Real Time Cell Analyzer (RTCA) -baserte Dose Range Finne (DRF)
MERK: En impedans-basert målesystem ble brukt til å: 1) vurdere sammensatte toksisitet, 2) velge forbindelser som skal videre etterforsket av HCS og 3) velge passende doser for HCS. De NHBE cellene i de RCTA platene doseres ved å tilsette 25 ul av testforbindelse fortynninger til 100 ul medium er tilstede i hver brønn. Derfor er alle testløsninger fremstilt ved 5 ganger (5 x) den ønskede sluttkonsentrasjon.
- Seeding NHBE Cells
- Programmere instrument for å definere antall og varighet av impedans målinger. I denne studien ble data registrert hvert 15. minutt i 48 timer (fra 24 timer ± 2 timer før og 24 timer etter dosering av cellene med testmidlene).
- Mål plate bakgrunnen ved å pipettere 50 pl forvarmet medium i hver brønn av en 96-brønns plate RTCA. Merk: Dette trinnet representerer et teknisk kravfor instrumentet for beregning av middels elektriske motstand som deretter brukes som en basis for referanse cellebasert beregning.
- Fremstille en cellesuspensjon med en konsentrasjon på 144.000 celler / ml (± 5%) og tilsett 50 ul cellesuspensjon (7,200 celler / brønn) til hver brønn av RTCA platen i hvilken 50 ul / brønn av medium ble allerede tilsatt for instrument bakgrunn mål.
- La cellene holder seg i 30 minutter ved romtemperatur før den plasseres i det RTCA holderen (for å forbedre homogen fordeling av cellene). Inkuber RTCA platene i RTCA vugge i inkubator (37 ° C og 5% CO 2) og starte registrering av data for de neste 24 ± 2 timer før dosering.
- Fortynninger av HPHCs og positive kontroller
- Positiv kontroll fortynning
- Fortynn Staurosporin stamoppløsning (10 mM) 1:10 i DMSO (se tabell 3) og tilsett 5 mL av dilution til 195 ul medium for å oppnå en 5 x arbeidsløsning.
- HPHC fortynning
- Oppløs / fortynne hver HPHC i kjøretøyet (tabell 2) for å generere en 1M stamløsning. Fortynn hver HPHC stamløsning 1:10 i medium for å generere en 100 mM oppløsning.
- Generer den "sammensatte master plate" ved å utføre en fem-trinns 01:10 seriefortynning ved hjelp av medium + 10% kjøretøy for å oppnå de arbeidsløsninger 5x (figur 2). Merk: I siste instans vil de endelige dosene være: 0,2 uM, 2 uM, 20 uM, 0,2 mM, 2 mM, 20 mM. Også fremstille doserings 0, som svarer til den eneste kjøretøy, i dette trinnet.
- dosering
- Pause RTCA instrument og åpne holderen for å fjerne platen.
- Ta av platen og legg den i RTCA platetemperatur verktøy (utviklet for å stabilisere temperaturen på RTCA plate under eksperimentelle prosedyrer utenfor RTCAstasjon) for å unngå kjøling av celler, noe som kan påvirke impedansmåling.
- Tilsett 25 ul 5x løsning fra den "sammensatte master plate" til cellene i triplikat å opprettholde den samme dosering rekkefølge som i forbindelsen master plate (høyeste dose i den øverste raden og bærerkontrollen i raden nummer 7) (figur 2). Ikke fjern den eksisterende (100 ul) cellekulturmedium.
- Legg 25 ul 5x positiv kontroll løsning til cellene i den nederste raden (halvt høyre) uten å fjerne eksisterende kulturmediet. Legg 25 ul medium på cellene i den nedre raden (halvt venstre) uten å fjerne eksisterende cellekulturmedium.
- Tett plate med plate sealer. Sett platen tilbake i RTCA holderen og lås den. Restart dataregistrering for ønsket eksponeringstid (f.eks., 24 timer). Merk: Bruken av denne tetningsmasse film anbefales å unngå potensiell forurensning, herunder brønn-til-brønn krysskontaminering.
- <strong> Data Analysis RTCA og LD 50 Beregning
- Eksport rådata som en tekstfil (.txt) eller Excel (xls-fil). Merk: Filen vil inneholde all informasjon om platen layout (forbindelser, doser og godt posisjon). Raw celleindeksverdier er organisert i en 96 brønns (speiling plate vel distribusjon) og er gitt for hver gang punkter hvor innspillingen fant sted. Verdien i posisjon i i 96-brønners plate ved tiden t er betegnet med CI t (i).
- Identifisere som et normaliserings referere til den siste tidspunktet før dosering for hver posisjon i i 96 brønners plate (som Cell indeks ved 23 t 50 min 00 sek i posisjon i, CI t (i) = 23: 50: 00 = CI Ref (i)). Merk: Denne informasjonen skal anmerkes når doseringen er utført.
- Divide, på et godt utgangspunkt, hver gang poengverdier ved normalisering referanse til normal alle verdiene på doserings tid. Den normaliserte verdien ved posisjoneringni i 96-brønners plate ved tiden t er betegnet med NCI t (i), og er således definert ved NCI t (i) = CI t (i) / CI Ref (i) for alle t.
- Beregne arealet under kurven (AUC) på 24 timer etter dosering for hver prøve i (stilling I i 96-brønners plate), herunder stillinger for positiv kontroll og kjøretøy.
- Skaff AUC i posisjon jeg oppnås ved å summere de områdene av hvert rektangel, hvert rektangel være mellom to tidspunkter merket med t k og t l (t k <t l); beregne hvert rektangel område med x * y med x = t l - t k er avstanden mellom to tidspunkter og Y er gjennomsnittet av aktiviteten av de to tidspunkter (Y = (NCI tk (i) + NCI tl (i)) / 2).
Merk: AUC på 24 timer etter dosering for stillingen jeg er merket med AUC (i). Når alle betingelser er belagt i triplikate brønner medianen av de tre verdiene blir brukt.
<li> Normal verdiene ved bruk av følgende ligning: - Skaff AUC i posisjon jeg oppnås ved å summere de områdene av hvert rektangel, hvert rektangel være mellom to tidspunkter merket med t k og t l (t k <t l); beregne hvert rektangel område med x * y med x = t l - t k er avstanden mellom to tidspunkter og Y er gjennomsnittet av aktiviteten av de to tidspunkter (Y = (NCI tk (i) + NCI tl (i)) / 2).
hvor i er den stilling i 96-brønners plate som AUC ble beregnet til 24 timer etter dosering,
Bilen er medianen av AUC-verdier for kjøretøy brønnene på en plate på 24 timer etter dosering,
Positiv kontroll er medianen av AUC-verdiene for de positive kontrollbrønner på en plate på 24 timer etter dosering,
CR er den ønskede median normaliserte verdi for kjøretøyet (0%), og
SC er den ønskede median normaliserte verdi for de positive kontrollene (-100%)
MERK: Ved slutten av dette trinn blir en datasettet innhentet som inneholder, for hver posisjon i i 96-brønners plate, en konsentrasjon ci (i logaritmiske enheter) som påføres prøven som inneholdes i stilling / brønn i og dens tilhørende normalisert AUC på 24 timer etter dosering AUC_normalized (i). - Plot og monter (c i, AUC_normalized (i)) -verdier ved hjelp av en 4-parametere Hill ligningen. Når det er mulig, også beregne LD 50.
hvor Y = AUC_normalized,
Null Aktivitet S 0 = Aktivitetsnivå ved null konsentrasjon av testforbindelse,
Infinite aktivitet S inf = Aktivitetsnivået ved uendelig konsentrasjon,
AC50 = konsentrasjon ved hvilken aktiviteten når 50% av maksimumsnivå,
Hill koeffisient n = Mål av skråningen på AC50, og
c = konsentrasjon i logaritmiske enheter som svarer til de verdier på x-aksen av dose-responskurve plot.
MERK: AC50 tilsvarer LD 50 (cytotoksisitetsassayer). Det er et mål på styrken hvor lave verdier indikerer høy potens.
- Positiv kontroll fortynning
3. Måling toksikologiske effekter av HCS
MERK: I alt ni multi-para markører for toksisitet, gruppert i seks ulike analyser, måles i den HCS plattform (tabell 1). Basert på RTCA celleviabilitet analyse (§ 2) doseområdet hver bestanddel er definert og en 3R4F referansedose er også inkludert. Referanse dose er ekvivalent med mengden av HPHC tilstede i røyken av en stokk fra referanse sigaretten 3R4F.
- Seeding NHBE Cells
- Fremstille en cellesuspensjon på 120.000 celler / ml (± 5%) og tilsett 100 ul cellesuspensjon til hver brønn i en 96-brønns plate HCS (12.000 celler / brønn). Forbered nok plater for vurdering av alle analyser (cytotoksisitet DNA skader, stress kinase, ROS, GSH innhold og apoptose) og tidspunkter (4 og 24 timers).
- La HCS-platene ved romtemperatur i 30 min for å tillate cellene å feste til brønnene og deretter inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 ± 2 timer før dosering.
- Fortynning av HCHPs og positive kontroller
MERK: NHBE celler i HCS-platene vil bli dosert ved å tilsette 25 ul av testprøveløsninger til 100 ul av medium som allerede er tilstede i hver brønn. Derfor er alle doser fremstilles ved 5 x den ønskede sluttkonsentrasjon.- Positive kontroller Fortynning (positiv kontroll Plate)
- Dispensere 40 ul lagerløsning av hver positiv kontroll (se tabell 3) i kolonne # 2 (figur 4a, brønner skraverte i rødt). Tilsett 20 mL av kjøretøy i kolonner # 3 og # 5 (Figur 4a, brønner skraverte i lys blå) og 40 ul kjøretøy i kolonnen # 4 (Figur 4a, brønner skraverte i lyseblått).
- Uttak 12 pl fra brønnene i kolonne # 2, fordeles det til brønnene i kolonne # 3 og bland (figur 4b), Fortsette til et endelig seriell fortynning med 3 doser (d1, d2, og D3) og kjøretøy (V) for hver positiv kontrollforbindelse erholdt (figur 4c). For å generere positiv kontroll plate, utarbeide en 1:40 fortynning av forbindelser i media (figur 4d).
- HPHC Fortynning (forbindelse Master Plate)
MERK: De valgte doseområder av HPHCs for HCS er listet opp i tabell 2.- Fortynn hver HPHC stamoppløsning (1 M) 1:10 i medium til en konsentrasjon på 100 mM. Utfør fortynninger bruker medium med 10% redskap for å oppnå de valgte 5x doser for hver HPHC.
- Positive kontroller Fortynning (positiv kontroll Plate)
- dosering
- Tilsett 25 ul 5x oppløsninger fra forbindelsen master plate til cellene in triplo opprettholde den samme dosering rekkefølge som i forbindelsen master plate (høyeste dose i den øverste raden og bærerkontrollen i raden nummer 7) (figur 5). Ikke fjern existing (100 ul) cellekulturmedium.
- Tilsett 25 ul 5x oppløsning fra den positive styreplaten til cellene i den nederste raden opprettholde den samme dosering orden som i den positive styreplaten (figur 5). Ikke fjern den eksisterende (100 ul) cellekulturmedium. Merk: Hver analyse har en spesifikk positiv kontroll; se tabell 3. Inkuber platen ved 37 ° C og 5% CO2 i den ønskede eksponeringstid (4 eller 24 timer).
- farging
- Forberedelse for alle analyser
- Forvarme den vaskebuffer (PBS) oppløsninger ved 37 ° C.
- Klargjør Fiksering-løsning (4% formaldehyd-oppløsning) tilsetning av 10,81 ml 37% formaldehyd til 89,19 ml av vaskebuffer og pre-varme det ved 37 ° C.
- Klargjør permeabiliseringsbuffer ved tilsetning av 10 ml av 10x permeabiliseringsbuffer til 90 ml vaskebuffer, og pre-varme det ved 37 ° C.
- Klargjør Blocking buffer ved tilsetning av 10 ml av 10x blokkeringsbuffer til 90 ml vaskebuffer, og pre-varme det ved 37 ° C.
- Forvarme cellekulturmediet ved 37 ° C.
- Fjern HCS plater fra inkubatoren når de 4 og 24 timers eksponeringstider er nådd og utføre følgende spesifikke protokoller for hver analyse.
- Cvtotoksisitetsmålinq
- Forbered et tilstrekkelig volum (V) over Live Cell Farging Solution i henhold til følgende formel: Volum av Medium (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antall brønner)
- Fortynn Mitokondrier fargestoff i Live-Cell Farging Solution i henhold til leverandørens instruksjoner. Fortynn Membran Permeabilitet fargestoff i levende celle Farging Solution i henhold til leverandørens instruksjoner.
- Tilsett 50 ul Levende cellefarging løsning til hver brønn på platen (e) betegnet "Cytotoksisitet assay". IKKE fjerne cellekulturmedium og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO
- Forsiktig aspirere mediet og fargeløsning og tilsett 100 ul / brønn av fikseringsløsning til hver brønn, og deretter inkuberes platen (e) i 20 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Forsiktig aspirere fikseringsløsning og vask en gang med 100 ul / brønn vaskebuffer.
- Fjerne vaskebuffer og tilsett 100 ul / brønn 1x permeabiliseringsbuffer til hver brønn og inkuber i 10 min ved romtemperatur i mørke.
- Aspirer permeabiliseringsbuffer og vask plate to ganger med 100 ul / brønn vaskebuffer.
- Aspirer vaskebuffer og tilsett 100 ul av 1 x blokkeringsbuffer til hver brønn og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Fremstille et tilstrekkelig volum (V) av primær antistoffløsning i henhold til den følgende formel: Volum av blokkeringsbuffer (il) V = 50 x B x 1.2 (W Antall brønner). Fortynne anti-cytokrom C antistoff (mus) 1: 250 i primær antistoff løsning.
- Sug blokkering buffer end tilsett 50 ul / brønn primær antistoffløsning til hver brønn og inkuber i 60 min ved romtemperatur i mørke.
- Fremstille et tilstrekkelig volum (V) av sekundære antistoff og Nuclear Løsning i henhold til følgende formel: Volum av blokkeringsbuffer (il) V = 50 x B x 1.2 (W Antall brønner). Fortynne anti-mus antistoff 1: 500 i sekundære antistoff og Nuclear Solution. Fortynne Nuclear fargestoff 1: 1000 i sekundære antistoff og Nuclear Solution.
- Aspirer primær antistoffløsning og vask plate tre ganger med 100 ul / brønn vaskebuffer ved hjelp av platevasker.
- Aspirer vaskebuffer og tilsett 50 ul / brønn av sekundære antistoff og Nuclear løsning i hver brønn på platen (e) og inkuberes i 60 min ved romtemperatur i mørke.
- Aspirer sekundære antistoff og Nuclear løsning og vaske platen tre ganger med 100 ul / brønn vaskebuffer ved hjelp av platevasker. Tilsett 100 ul / brønn vaskebuffer. Plate (s) er (er) nåklar til å bli evaluert på HCS leseren.
- DNA Damage analyse
- Forsiktig aspirere mediet fra platene betegnet "DNA-skade".
- Utfør den samme fremgangsmåten som er beskrevet i rekkefølge: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Legg merke til at i dette tilfellet er det kun medium fjernet under punkt 3.4.2.4.
- Fremstille et tilstrekkelig volum (V) av primær antistoffløsning i henhold til den følgende formel: Volum av blokkeringsbuffer (il) V = 50 x B x 1.2 (W Antall brønner)
- Fortynne anti-fosfor H2AX antistoff (mus) 1: 2000 i primært antistoff Solution.
- Utfør den samme skritt som beskrevet i 3.4.2.10.
- Fremstille et tilstrekkelig volum (V) av sekundære antistoff og Nuclear Løsning i henhold til følgende formel: Volum av blokkeringsbuffer (il) V = 50 x B x 1.2 (W Antall brønner)
- Fortynne anti-mus antistoff 1: 500 i sekundære antistoff og Nuclear Solution.
- Fortynne Nuclear fargestoff 1: 1000 i sekundære antistoff og Nuclear Solution.
- Utfør den samme fremgangsmåten som er beskrevet i rekkefølge: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- Stress Kinase Assay
- Forsiktig aspirere mediet fra hver av platene betegnet "Stress Kinase".
- Utfør den samme fremgangsmåten som er beskrevet i rekkefølge: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Legg merke til at i dette tilfellet er det kun medium fjernet under punkt 3.4.2.4.
- Fremstille et tilstrekkelig volum (V) av primær antistoffløsning i henhold til den følgende formel: Volum av blokkeringsbuffer (il) V = 50 x B x 1.2 (W Antall brønner)
- Fortynne anti-fosfor cJun antistoff (kanin) 1: 200 i primær antistoff løsning.
- Utfør den samme skritt som beskrevet i 3.4.2.10.
- Fremstille et tilstrekkelig volum (V) av sekundære antistoff og Nuclear Løsning i henhold til følgende formel: Volum av blokkeringsbuffer (il) V = 50 x B x 1.2 (W Antall brønner)
- Fortynne anti-kanin antistoff 1: 500 i sekundære antistoff og Nuclear Solution.
- Fortynne Nuclear fargestoff 1: 1000 i sekundære antistoff og Nuclear Solution.
- Utfør den samme fremgangsmåten som er beskrevet i rekkefølge: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- ROS-analysen
- Forbered et tilstrekkelig volum (V) over Live Cell Farging Solution i henhold til følgende formel: Volum av Medium (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antall brønner).
- Fortynn ROS fargestoff Live Cell Farging Solution i henhold til leverandørens instruksjon
- Fortynne Nuclear fargestoff 1: 1000 Live Cell Farging Solution.3.4.5.4) Tilsett 50 mL Live-Cell Farging løsning i hver brønn plater utpekte "ROS"; IKKE fjerne celledyrkningsmedier og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Forsiktig aspirere mediet og fargeløsning og vask plate tre ganger med 100 ul / brønn medium.
- Aspirer medium, tilsett 100 _6, l / brønn fikseringsløsning til hver brønn og inkuber platen i 20 minutter ved romtemperatur i mørke.
- Forsiktig aspirere fikseringsløsning og vask plate tre ganger med 100 ul / brønn vaskebuffer.
- Tilsett 100 ul / brønn vaskebuffer. Plate (s) er (er) nå klar.
- Evaluere plate på HCS leseren innen 1 time.
- GSH innhold analyse
- Forbered et tilstrekkelig volum (V) over Live Cell Nuclear Farging Solution i henhold til følgende formel: Volum av Medium (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antall brønner).
- Fortynn Nuclear fargestoff (Far Red) 1: 1000 Live Cell Nuclear Farging Solution.3.4.6.3). Tilsett 50 ul av levende celle nukleær farging løsning i hver brønn av platene betegnet "GSH-innhold". IKKE fjerne celledyrkningsmedier og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Forbered et tilstrekkelig volum (V) over Live Cell GSH Farging Solution i henhold tilfølgende formel: Volum av HBSS (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antall brønner)
- Fortynn GSH fargestoff Live Cell GSH Farging Solution i henhold til leverandørens anvisninger.
- Forsiktig aspirere mediet og nukleær farging løsningen og vask plate tre ganger med 100 ul / brønn medium.
- Aspirer medium og tilsett 100 ul / brønn av levende celle GSH fargeløsning til hver brønn på platen (e).
- Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur i mørke. Plate (s) er (er) nå klar.
- Evaluere platen (e) på HCS Reader i 1 time.
- apoptose analyse
- Forbered et tilstrekkelig volum (V) over Live Cell Farging Solution i henhold til følgende formel: Volum av Medium (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antall brønner).
- Spe caspase fargestoff 1: 300 Live Cell Farging Solution.
- Fjern cellekultur media, tilsett 50 mL Live-Cell Farging løsning i hver brønn av tHan plate (e) som er betegnet "Apoptose" og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Forbered et tilstrekkelig volum (V) over Live Cell Nuclear Farging Solution i henhold til følgende formel: Volum av Fix løsning (III) V = 50 x B x 1,2 (W Antall brønner).
- Fortynne Nuclear fargestoff 1: 1000 Live Cell Nuclear Farging Solution.
- Fjern den levende celle fargeløsning, tilsett 100 ul / brønn av levende celle nukleær farging løsning i hver brønn på platen (e) og inkuber i 30 min ved romtemperatur i mørke.
- Aspirer fiksativ / kjernefargeløsning og vaskes platen (e) tre ganger med 100 ul / brønn vaskebuffer.
- Tilsett 100 ul / brønn vaskebuffer. Plate (s) er (er) nå klar.
- Evaluere platen (e) på HCS leseren.
- Forberedelse for alle analyser
- Data Analysis HCS
- Eksport rådata som excel (xls-fil). Merk: Rå celle indeksverdier er organisert i en 96 godt skjemapå (speiling plate vel distribusjon) og er gitt for hvert endepunkt på et gitt tidspunkt etter dosering.
- Normalisere verdier ved hjelp av følgende ligning:
hvor i er den målte rå signalverdi i en brønn,
Kjøretøy er medianen av de målte signalverdiene for kjøretøyet brønner på en plate,
CR er den ønskede median normaliserte verdi for kjøretøyet (0%), og
SC er den ønskede median normaliserte verdi for de positive kontroller (100),
MERK: Ved slutten av dette trinn blir en datasettet innhentet som inneholder, for hver posisjon i i 96-brønners plate, en konsentrasjon c i (i logaritmiske enheter) som ble påført på prøven som befinner seg i stilling / brønn i og dens tilsvarende normalisert signal N (i). - Plot og monter (c i, N (i)) - verdier ved hjelp av en 4-parametere Hill ligning.
hvor Null Aktivitet S 0 = Aktivitetsnivå ved null konsentrasjon av testforbindelse,
Infinite aktivitet S inf = Aktivitetsnivået ved uendelig konsentrasjon,
AC50 = konsentrasjon ved hvilken aktiviteten når 50% av maksimumsnivå,
Hill koeffisient n = Mål av skråningen på AC50, og
c = konsentrasjon i logaritmiske enheter som svarer til de verdier på x-aksen av dose-responskurve plot.
MERK: AC50 er et mål på styrken hvor lave verdier indikerer høy potens.
Representative Results
RTCA
Fordi HCS endepunkter ikke vil være informativt når ingen toksisk effekt blir detektert, vil disse forbindelser ikke viser redusert cellelevedyktighet opp til den høyeste konsentrasjon i RCTA ikke er testet av HCS (figur 3b, c, d, g, k, l, m , s). Forbindelser som viste nedsatt celle levedyktighet på bare den høyeste konsentrasjonen (figur 3e, o) er også merket for HCS. Til slutt er det bare de bestanddeler med en Computable LD 50 (<20 mm) utvalgt for videre analyse HCS (figur 3a, f, h, j, n). HPHCs som oppfyller kriteriene ovenfor er: 1-aminonaphtalene, arsen (V), krom (VI), Crotonaldehyde og Fenol.
HCS
Som en kvalitetssikring (QC), positive kontroller er first analysert for å sikre at fargeprosedyre er riktig utført. Representative bilder av positiv kontroll-behandlede celler er vist i figur 6. Dataverdier er normalisert til kjøretøy som tidligere beskrevet. Det er ingen dose-respons-kurver er plottet som bare tre doser er testet, og ikke alle tre doser er vurdert på hvert tidspunkt. Positive kontroll doser er valgt (basert på tidligere forsøk, data ikke vist), slik at hensiktsmessige responser observert for hvert endepunkt ved både 4 timer og 24 timer. I spesielle doser 1 og 2 er brukt til å evaluere effekten på 4 timer mens doser 2 og 3 er benyttet for å evaluere effekten på 24 timer. Platene blir forkastet hvis ingen respons blir observert for den positive kontroll doser. Legg merke til at for alle endepunktene, med unntak av mitokondriemembranpotensialet og GSH-innhold, er en økning av signalintensiteten forventet.
Alle forbindelser, bortsett fra Fenol, induserte en nekrotisk pheno typen, basert på økt cellemembran permeabilitet (figur 7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, krom (VI), ble Crotonaldehyde og fenol identifisert til å være genotoksiske basert på økt fosforylering av histon H2AX (figur 7e, j, n, p). Fenol og 1-aminonaphtalene ble funnet å indusere alvorlig mitokondriell dysfunksjon (figur 7b, o) som, med en-aminonaphtalene, ført til et økt cytokrom C frigivelse (figur 7c). Påvisning av økt caspase 3/7 aktivitet gitt bevis for apoptotisk hendelse på krom eksponering. Oksidativt stress induksjon (ROS eller GSH) ble også påvist ved behandling med 1-aminonaphtalene, krotonaldehyd og fenol (figur 7d, m, q). Endelig induserer Arsen celle spenning som demonstrert ved økt fosforylering av transkripsjonsfaktoren cJun (figur 7g).
belastning / 53987 / 53987fig1.jpg "/>
Figur 1. Forbindelse Tox-Profiler arbeidsflyt. A) Skjematisk av arbeidsflyt som følges i denne studien. Først ble en dose-avstandsmåling utføres ved hjelp av RTCA plattformen for å velge passende doser for etterfølgende HCS å karakterisere de sammensatte spesifikke toksisitetsprofil. B) Eksperimentell utforming av studien. 24 timer etter såing, ble cellene dosert og impedansverdier kontinuerlig overvåket over følgende 24 timer, mens HCS endepunkter ble undersøkt 4 og 24 timer etter dosering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. RTCA Eksponering Plate. Forbindelse master plate først genereres ved å utføre en fem-trinns 01:10 seriell fortynning. Hver forbindelse,herunder bilen kontroll (dose 0) blir deretter tilsatt i triplikat til den eksponering plate sammen med medium og Staurosporin som kontroller. Merk at dosene sekvens opprettholdes ved overføring, høyeste dosene er i rad nummer en, mens kjøretøykontroller er i rad nummer 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative RTCA celleviabilitet resultater. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropan, c) acetamid, d) Aceton, e) Akrylamid, f) Arsen (V), g) Benzen, h) Krom (VI) , j) Crotonaldehyde, k) metyletylketon, l) Nickel (II), m) nitrobenzen, n) fenol, o) kinolin, s) Toluen. Ved 24 timer etter dosering, ble arealet under kurven (AUC) beregnes for hver dose (inkludert positiv kontroll og kjøretøy) og normalisert i en område fra 0 til -100% aktivitet (y-aksen), hvor 0 gjenspeiler aktiviteten av kjøretøyet og -100 av den positive kontrollen. Verdier ble deretter plottet og monteres ved hjelp av en fire-parameter Hill ligningen og, når det er mulig, ble LD 50 beregnes. Konsentrasjoner uttrykkes på en log skala (x-aksen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Fortynning Ordningen for positiv kontroll Forbindelser for HCS analyser. A) Tilsetting av Positive kontroller og vekjøretøyet til seriefortynning platen. b) Seriell fortynning av de positive kontrollene. c) 200X positive kontroller doser. de) Fortynning av de 200x positive kontrolldoser i medium (01:40) for å generere den positive kontrollplate som inneholder 5x doser. Merk at hver doser er fortynnet i tre paralleller for å reflektere den endelige utformingen i eksponerings plate). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. HCS eksponering Plate. Forbindelse master plate blir først generert ved å utføre en fem-trinns fortynning. Hver forbindelse, herunder bilen kontroll (dose 0) blir deretter tilsatt i triplikat til den eksponering platen sammen med de positive kontroller. Merk at doser orden blir opprettholdt ved overføring,høyeste dosene er i rad nummer en, mens kjøretøykontroller er i rad nummer 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Representant Fluorescent Bilder av antistoff eller Dye-fargede celler a) Kjernefysiske parametere - Nuclear dye: a. Gjennomtrengelig fargestoff som binder seg til DNA i levende eller faste celler. Denne flekken brukes til å identifisere enkeltceller merking atom region b) Nekrose - Cell membran permeabilitet fargestoff. Dye-basert gjenkjenning av cellemembranen integritet. Reagens er iboende ugjennomtrengelig til cellemembranen. I løpet av nekrose, blir membranen permeabel og fargestoffet kommer inn i cellen og binder seg til DNA skape et sterkt fluorescerende s. ignal c) Apoptose - Cytokrom C: Antistoff-basert gjenkjenning av cytokrom C utgivelse, en velkjent kjennetegn på tidlig apoptose. Ved induksjon av apoptose, er cytokrom c frigjøres fra mitochondria og diffunderer inn i kjernen d) DNA-skade - pH2AX:.. Antistoff-basert deteksjon av fosforylering av histon H2AX, et velkjent kjennetegn på dobbeltkjedet DNA bryter e) Stress Kinase - cJun. antistoff-basert gjenkjenning av fosforylering ved Ser-73 av cJun, en velkjent kjennetegn på cellulært stress f) Oksidativt stress - DHE: Dye-basert deteksjon av superoksidradikaler. Dihydroethidium selv fluoresces blå i cytoplasma mens oksidert form ethidium fluoresces rød på DNA intercalation g) GSH - mBcl. Dye-basert gjenkjenning av gratis GSH molekyler. mBcl reagerer med GSH tilgenerere et sterkt fluorescerende produkt h) Apoptose - caspase 3/7 aktivering. Dye-basert deteksjon av caspase 3/7 aktivitet. Reagens er ikke-fluoriserende med en fire-aminosyre peptid som hemmer DNA-binding. Ved caspase-3/7 Aktivering blir peptidet spaltet slik at fargestoffet til å binde til DNA og fremstille et lyst, fluorogen respons. Paneler Bh vise positive kontrollbehandlede celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Representant HCS resultater. 1-aminonaphtalene (ae), arsen (V) (f og g), krom (VI) (HK), Crotonaldehyde (ln) og Fenol (OQ). 4 timers (blå linje) og24 hr (oransje linje) signaler ble beregnet for hver dose og normalisert til kjøretøyet aktivitet (0%). Verdier som ikke inngår i kurvetilpasning beregninger er vist i grått. Konsentrasjoner uttrykkes på en log skala (x-aksen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| analyse~~POS=TRUNC | Endpoint # | biologisk endepunkt | Cellular rommet | utgang funksjonen |
| cytotoksisitet | 1 | Mitokondrie masse 6 | cytoplasma | Spot gjennomsnittlig areal |
| 2 | Mitokondriemembranpotensialet 6 | cytoplasma | Spot middels intensitet | |
| 3 | Cytokrom C utgivelse | Nucleus | Gjennomsnittlig intensitet | | |
| 4 | Cellemembranen permeabilitet 8 | Nucleus | Gjennomsnittlig intensitet | |
| DNA Damage | 5 | fosfor-H2AX 9 | Nucleus | Gjennomsnittlig intensitet |
| Stress Kinase | 6 | fosfor-cJun 10 | Nucleus | Gjennomsnittlig intensitet |
| ROS | 7 | ROS 11 | Nucleus | Gjennomsnittlig intensitet |
| GSH innhold | 8 | GSH 12 | cytoplasma | Spot middels intensitet |
| apoptose | 9 | Caspase 3 13 | cytoplasma | Spot middels intensitet |
Tabell 1. Liste over HCS enssays og endepunkter.
| Kjøretøy | RTCA doser (mm) | LD 50 | HCS doser | |||||||||||
| Celleviabilitet valgt (mm) | 3R4F (nM) | |||||||||||||
| 1-Aminonaphtalene | EtOH | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 280 mikrometer | 2000 | 500 | 200 | 150 | 0,27 | |
| 2-nitropropan | EtOH | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| acetamide | EtOH | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| aceton | Vann | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| akrylamid | Vann | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Arsen (V) | Vann | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 160 mikrometer | 200 | 100 | 50 | 25 | <td> 0,17||
| benzen | EtOH | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Krom (VI) | Vann | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 20 pM | 100 | 50 | 20 | 10 | 0,06 | |
| Crotonaldehyde | Vann | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 200 mikrometer | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2000 | |
| Metyletylketon | Vann | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mm | ||||||
| nikkel | Vann | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| nitrobenzen | EtOH | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| fenol | EtOH | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 2300 mikrometer | 5000 | 2000 | 1000 | 500 | 240 | |
| quinoline | EtOH | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 0.2 | > 20 mM | |||||||
| toluen | Vann | 20000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
Tabell 2. Liste over Testet HPHC Forbindelser med Relative LD 50 på 24 timer for behandling. Forbindelser valgt for HCS analyse er uthevet i oransje og testede doser er også gitt. Den 3R4F dose er ekvivalent til mengden av bestanddelen som er tilstede i røyken av en stokk fra referanse sigaretten 3R4F.
| analyse~~POS=TRUNC | forbindelse | Stock Solution | Løsemiddel Dose (r) (pM) | |||
| celleviabilitet | staurosporin | 10 mm | DMSO | 50 | ||
| cytotoksisitet | valinomycin | 10 mm | DMSO | 50 | 20 | 5 |
| DNA Damage | paraquat | 100 mm | DMSO | 500 | 200 | 50 |
| Stress Kinase | Anisomycin | 2 mm | DMSO | 10 | 4 | 1 |
| ROS | rotenon | 200 mm | DMSO | 1000 | 400 | 100 |
| GSH innhold | etakrynsyre | 200 mm | DMSO | 1000 | 400 | 100 |
| apoptose | staurosporin | 40 mm | DMSO | 200 </ Td> | 50 | 20 |
Tabell 3. Liste over positive kontroller og konsentrasjoner brukt for hver analyse.
Discussion
Behovene for alternativer til dyreforsøk og for nye høy gjennomstrømning testing tilnærminger har vært mye diskutert de siste årene. Dette har ført forskere og myndigheter for å undersøke alternative metoder for standard toksisitetstesting, utnytte cellulære tester som tett etterligner fysiologi av målet vev. I denne studien har vi vist anvendbarheten av å kombinere en real-time celle analysator (RTCA) med et høyt innhold screening (HCS) plattform for å vurdere effekten av eksponering for enkelt CS bestanddeler på humane lunge epitelceller. Dette oppsettet kan være analogt brukes til å vurdere cytotoksisitet indusert av diverse andre luftbåren forurensing, luftbårne partikler og nanopartikler. Videre kan de oppnådde resultatene sammenliknes med de fra hel-genom transcriptomics og beregningsmetoder basert på årsaks biologiske nettverk. Som tidligere rapportert, denne tilnærmingen tillot oss å underbygge data på molekylær veiforstyrrelse på CS eksponering 5 med HCS endepunkter, ta opp disse pathway forstyrrelser også fenotypisk.
Som et flytdiagram analysen, gir sanntids celle analyse av cellenes levedyktighet relatert informasjon på en dose- og tidsavhengig oppløsning, noe som gir bedre beslutninger som dose og eksponeringstid punktet kan være fordelaktig for nedstrøms analyse 14. Prinsippet om analysatoren er avhengig av endringer i elektrisk impedans som dannes av cellene som de skal festes, og spredt på en kultur brønnoverflaten er dekket med et gull microelectrode. Impedansen blir omdannet til en dimensjonsløs parameter kalt celle-indeksen, som kan brukes til å overvåke celle adhesjon, spredning, morfologi og til slutt celleviabilitet. Selv om denne teknikken ikke gi informasjon om cytotoksiske mekanismer, muliggjør deteksjon av morfologiske celleforandringer selv ved svært lave doser ved hvilke HCS er ikke informativt dens følsomhet (data ikke vist). Basert på Previlige eksperimenter, har vi registrert at RTCA metodikken er i stand til å oppdage morfologiske endringer ved lavere doser sammenlignet med de HCS endepunkter.
Etter innledende screening med sanntids celle analysator, ble en HCS plattform brukes for å få mer detaljert informasjon om hva slags cytotoksisitet utløst av hver HPHC. HCS analysen panel lov til å profilere HPHCs mot deres potensielle innvirkning på cellulære avdelinger / organeller, samt å identifisere de som utløste gentoksisitet eller oksidativt stress. Analysen avdekket tydelige profiler der de valgte HPHCs induserer cytotoksisitet i NHBE celler. Generelt er alle forbindelser som, bortsett fra fenol, ble funnet å indusere nekrose ved den høyeste testede doser. I samsvar med en potensiell rolle i utviklingen av kreft 1-aminonaphtalene indusert fosforylering av H2AX som en markør for genotoksisitets- imidlertid HCS-panelet også avdekket aktivitet av denne HPHC i mitokondriell toksisitet avlesning (masse økes og cytokrom C releaSE) og oksidativt stress (GSH depletion). På samme måte som tidligere beskrevet, Fenol ble identifisert til å indusere mitokondriell dysfunksjon, og føre til DNA-skade, så vel som GSH uttømming. Krom (VI), en av forbindelsene klassifisert som gruppe I kreftfremkallende, og Crotonaldehyde ble også begge identifisert som genotoksiske, spesielt krom (VI) også apoptose (caspase kaskade aktivering) og Crotonaldehyde forårsaket øket ROS generasjon. Endelig arsen (V), ble funnet å indusere cJun fosforylering som er en markør for stress-kinasereaksjonsveien aktivering.
I denne studien, benyttet vi NHBE celler som en modell for lunge-epitelceller in vitro. Ved hjelp av disse cellene i en HCS innstillingen er enestående og aktivert etterforskningen av et bredere spekter av endepunkter, inkludert gentoksiske og oksidativt stress markører. Både levende celle og faste cellefarging tilnærminger ble beskrevet i våre protokoller, demonstrerer fleksibiliteten i den generelle teknikken. i fhandling, kan de samme protokoller påføres et bredere spekter av mål, som kan løses ved bruk av en hvilken som helst fluorescerende fargestoff eller antistoff. For en vellykket gjennomføring av de levende farge protokollene, er det viktig å respektere inkubasjonstid, som noen av de fargestoffer som har en begrenset halveringstid og fluorescens-signalet kan reduseres før bildeinnlastingen er fullført. Det er også viktig å tenke på at hvis en annen celletype som brukes, alle flekker forhold bør vurderes på nytt, da den optimale fargekonsentrasjons og inkubasjonstiden kan være forskjellig.
I dagens papir har vi beskrevet et scenario der kun fem forbindelser hvor screenet med HCS metodikk. Tatt i betraktning den tidligere beskrevne plate oppsettet, ble de dosert over 2 forskjellige platesett for en total av 24 plater (6-analyser og 2 tidspunkter) sikret antall plater kan også økes, for derved å tillate for samtidig screening av flere forbindelser eller de investigation av flere endepunkter. Før du gjør det, men bør man ta i betraktning at visse endepunkter (GSH og ROS) krever umiddelbar anskaffelse, og som en konsekvens, bør doseringen av platene skal utføres i en forskjøvet måte å tillate oppkjøpet av forrige plate. På den annen side, ved hjelp av en fast cellefarging protokoll representerer en fordel, da platene kan stables, avbryte protokollen ved hvilket som helst trinn etter fiksering, for gjennomføring av fargeprosedyre på et senere tidspunkt. Denne tilnærmingen, for eksempel, ville gi operatøren tid til å fullføre alle levende celle flekker plater uten at datakvalitet.
For ytterligere å optimalisere arbeidsflyt ved å redusere antall plater, ville det også være mulig å multiplekse flere endepunkter sammen. For eksempel i denne sammenheng DNA Damage og Stress kinase kan bli undersøkt sammen rett og slett å bruke to sekundære antistoff med fluorokromer emitting i annen channels. Kontinuerlig utvikling av HCS plattform, herunder fullt automatisert celle såing, forbindelsen fortynning, dosering og flekker, så vel som tilsetningen av nye endepunkter vil ytterligere utvide kapasiteten til HCS plattformen som en kraftig profilering verktøy for HPHCs for epitelisk og andre celletyper .
Disclosures
Alle forfatterne er ansatt i Philip Morris International. Philip Morris International er den eneste kilden til finansiering og sponsor av dette prosjektet.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Kårsta Luettich og Grégory Vuillaume for deres vurdering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| Screener (HCS) | Genedata | NA | |
| CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
| Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
| ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Easy Flask filter cap 75 cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
| 96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
| ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
| GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
| GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
| Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
| Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
| Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
| Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
| Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10x permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
| 4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
| 10x blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
| Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
| Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
| Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
| 1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
| 2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
| Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
| Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
| Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
| Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
| Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
| Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
| Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
| Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
| Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
| Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
| Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
| Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).
