Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عالية تحليل فحص المحتوى لتقييم الآثار السمية للمكونات الضارة والمؤذية يحتمل (HPHC)

Published: May 10, 2016 doi: 10.3791/53987
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological System Research (BSR), Philip Morris International R&D

Abstract

دخان السجائر (CS) هو عامل خطر رئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية والرئة. لأن CS هو الهباء الجوي المعقدة التي تحتوي على أكثر من 7000 مادة كيميائية (1)، يمثل تحديا لتقييم مساهمات المكونات الفردية لسميتها العامة. ملامح السمية من المكونات الفردية وكذلك خليط يمكن مع ذلك وضع في المختبر، من خلال تطبيق أعلى مستوى من خلال-وضع أدوات الفحص، التي تمكن التنميط المكونات الضارة والمؤذية يحتمل (HPHCs) من دخان التبغ، على النحو المحدد من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية إدارة (FDA) 2

لتقييم أولي، تم استخدام أداة القائم على مقاومة لفي الوقت الحقيقي، وتقييم التسمية خالية من السمية في المجمع. تعتمد قراءات صك بشأن التصاق الخلية، الجدوى والتشكل التي توفر جميع معا لمحة عامة عن الوضع الخلية. معلمة أبعاد، واسمه مؤشر الخلية، ويستخدم لتقدير. وهناك مجموعة من DIFوقد وضعت ferent بروتوكولات تلطيخ لتحقيق مقرها التصوير مضان وكانت تستخدم منصة HCS للحصول على معلومات أكثر تعمقا على نوع من السمية الخلوية التي تسببها كل HPHC.

من 15 مكونات اختبار، وقد تم اختيار خمسة فقط من أجل التحليل القائم HCS-كما سجلت LD محسوب 50 (<20 مم). وشملت هذه 1-aminonaphtalene، الزرنيخ (V) والكروم (VI)، Crotonaldehyde والفينول. وبناء على تأثيرها في HCS، يمكن تحديد 1-aminonaphtalene والفينول للحث على ضعف الميتوكوندريا، و، جنبا إلى جنب مع الكروم (VI) كما السمية الوراثية على أساس زيادة الفسفرة هيستون H2AX. وقد تم تحديد Crotonaldehyde بمثابة محفز الاكسدة والزرنيخ كما إجهاد كيناز مسار المنشط.

وتوضح هذه الدراسة أن مجموعة من التكنولوجيات القائمة على مقاومة وHCS يوفر أداة قوية لتقييم في المختبر من مكونات CS.

Introduction

وقد اعتمد تقييم المخاطر السمية تاريخيا على استخدام النماذج الحيوانية التي، على الرغم أساسية في علوم الحياة، وترتبط أيضا مع أوجه القصور مثل ترجمتها غير متناسقة للبشر والتكلفة العالية. وعلاوة على ذلك، كانت هناك جهود متزايدة لإيجاد بدائل للتجارب على الحيوانات في روح "و3RS" 2 (استبدال، والحد، وصقل). وقد تسارعت هذه الجهود على مدى السنوات القليلة الماضية، ليس فقط بسبب التطورات الحديثة مثل تقنيات عالية الإنتاجية ونهج النظم البيولوجية، ولكن أيضا بسبب التشريعات التي تقيد استخدام التجارب على الحيوانات، وخاصة في الاتحاد الأوروبي.

تعقيد مسارات الإشارات الخلوية التي تنظم ردا على الشتائم السامة يجعل من الواضح أن استخدام نهايات سمية واحدة لن تكون كافية لوصف أساس سمية بعض المركبات. لهذا، فإن التفاعل بين مئات من التفاعل صسوف roteins المساهمة في شبكة البيولوجية أيضا بحاجة إلى أن تؤخذ بعين الاعتبار. لدراسة تأثير المواد السامة على تلك الشبكات، نهج النظام السموم جنبا إلى جنب مع المتوسط ​​المظهرية وعالية الإنتاجية فحوصات الكشف مفيد للاستدلال الفعليات، وفي الوقت نفسه توفير مزيد من المعلومات حول آلية عمل المواد السامة الفردية.

في هذه الدراسة، قمنا بتوظيف HCS كأداة فحص قوية، والتي تتألف من المجهر الآلي وتطبيق البرمجيات البيولوجي، التي يمكن اكتساب ومعالجة وتحليل البيانات صورة المستمدة من المقايسات الخلوية محددة على أساس مضان. وهذا يسمح لالتغيرات البصرية داخل الخلية ليكون كميا، في خلية واحدة أو على مستوى التحت خلوية، والعديد من المعلمات ليتم تحليلها في وقت واحد. 3 على سبيل المثال، تم تقييم الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة باستخدام الهوية القائمة على الضد من الفسفرة هيستون H2AX و وتم قياس كمية أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام خلية بيرمالفائق eable صبغة حساسة.

لأن الرئة الخلايا الظهارية تمثل عائقا البيولوجي الأول ضد المواد السامة عن طريق الاستنشاق، بما في ذلك دخان السجائر، ونحن استخدام الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الأولية باعتبارها نموذجا في المختبر لمحة عن تأثير HPHCs نشرت من قبل إدارة الغذاء والدواء في الولايات المتحدة. 4 هذه المخطوطة هي متابعة -up على دراسة سابقة 5 التي قمنا بتقييم الأثر البيولوجي من مجموعة فرعية مختلفة من HPHCs.

كجزء من سير العمل لدينا لتقييم سمية الخلايا في المختبر، قمنا بتقييم البداية الفعليات من مجموعة مختارة من 15 في HPHC، وذلك باستخدام الوقت الحقيقي التحليل الخلوي على أساس مقاومة (RTCA) النظام الذي يسمح لنا لإقامة جرعة نطاقات، ومناسبة لHCS لاحق تحليل (الشكل 1). تقييم HCS السمية وبعد ذلك أجريت باستخدام تسع نقاط النهاية متعددة حدودي السمية الخلوية، ومراقبة كل في نقطتين الساعة (4 و 24 ساعة). كانت علامات المستخدمة تدل على سمية الميتوكوندريا، الحمض النووي من التلف، كيناز الإجهاد، وأنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، الجلوتاثيون المحتوى (GSH)، كاسباس 3-7 النشاط، السيتوكروم الإفراج C ونفاذية غشاء الخلية، كما هو موضح في الجدول رقم 1.

نهجنا تمكين تحديد وتوصيف تأثير مكونات دخان السجائر من خلال أخذ العينات dose- وتعتمد على الوقت. في نهاية المطاف، وهذا ينتج في المختبر السمي لكل HPHC. ويمكن أيضا نهج متعدد OMICS استخدامها لزيادة تكمل التحليل HCS. وهذا من شأنه في نهاية المطاف أيضا توفير فهم أعمق للآثار في الخلايا مما يشير الى و/ أو مستوى النسخي.

Protocol

1. خلايا الشعب الهوائية طلائي حصاد عادي الإنسان (NHBEs)

  1. قبل تدفئة مستنبت الخلية (القصبي نمو الخلايا الظهارية تستكمل المتوسطة المتوسطة)، وHEPES، التربسين، والحل التربسين تحييد (TNS) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  2. حصاد الخلايا عند الوصول إلى 80٪ من التقاء.
    ملاحظة: زراعة الخلايا NHBE التالية البذر الظروف يمكن استخدامها للحصول على التقاء الأمثل في قوارير T75 غير المصقول مع 20 مل المتوسطة:
    1. البذور 1 × 10 6 خلايا للثقافة لمدة 3 أيام، 0.5 × 10 6 خلايا للثقافة لمدة 4 أيام و 0.25 × 10 6 خلايا للثقافة لمدة 5 أيام. تغيير المتوسط ​​كل يوم 2 عندما الخلايا في الثقافة لتحديث المواد المغذية. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  3. إزالة طاف من قارورة (ق) وإضافة HEPES لغسل الخلايا (على سبيل المثال، 3 مل لمدة 75 سم 2 قارورة). وتناوب كل قارورة لتغطية أحادي الطبقة الخلية مع سول HEPESution.
  4. إزالة حل HEPES وإضافة الحل التربسين (على سبيل المثال، 3 مل لمدة 75 سم 2 قارورة). تدوير قارورة لتغطية أحادي الطبقة الخلية مع حل التربسين.
  5. احتضان القارورة لمدة 5 دقائق عند 37 ± 2 درجة مئوية. مراقبة انفصال الخلايا تحت المجهر وإذا لزم الأمر، واحتضان لفترة أطول والاستفادة من قارورة الإفراج عن أي خلايا تعلق المتبقية بلطف.
  6. إضافة TNS لوقف رد الفعل (على سبيل المثال، 3 مل لمدة 75 سم 2 قارورة) ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
  7. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
  8. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل من متوسطة جديدة، والخلط بلطف لتسفر عن التعليق الخلية متجانسة.
  9. تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر لإزالة الركام وعدد الخلايا. ملاحظة: في المختبر لدينا تم استخدام متعدد القنوات نظام عد الخلايا الحقل الكهربائي إلى بدقة وباستمرار تقييم viablعدد الخلايا ه.

2. في الوقت الحقيقي محلل الخليوي (RTCA) القائم على الجرعة المدى الحقائق (DRF)

ملاحظة: تم استخدام نظام قياس القائم على مقاومة إلى: 1) تقييم سمية مركب، 2) مركبات مختارة إلى المزيد من التحقيق من قبل HCS و 3) تحديد الجرعات المناسبة لHCS. ومداوي الخلايا NHBE في لوحات RCTA بإضافة 25 ميكرولتر من التخفيفات مجمع الاختبار إلى 100 الحاضر المتوسط ​​ميكرولتر في كل بئر. لذلك، يتم إعداد جميع الحلول اختبار في 5 مرات (5X) التركيز النهائي المطلوب.

  1. خلايا NHBE بذر
    1. برمجة أداة لتحديد عدد ومدة قياسات مقاومة. في هذه الدراسة، تم تسجيل البيانات كل 15 دقيقة لمدة 48 ساعة (من 24 ساعة ± 2 ساعة قبل وبعد 24 ساعة الجرعات الخلايا مع وكلاء اختبار).
    2. قياس الخلفية لوحة من قبل pipetting 50 ميكرولتر من المتوسط ​​قبل تحسنت في كل بئر من لوحة RTCA 96-جيدا. ملاحظة: تمثل هذه الخطوة المتطلبات التقنيةلالصك لحساب المقاومة المتوسطة كهربائية والتي يتم بعد ذلك استخدامها كمرجع الأساسية لحساب خلية القاعدة.
    3. إعداد تعليق الخلية بتركيز 144000 خلية / مل (± 5٪) وإضافة تعليق الخلية 50 ميكرولتر (7200 خلية / أيضا) إلى كل بئر من لوحة RTCA التي 50 ميكرولتر / بئر المتوسطة وأضفت لخلفية أداة قياس.
    4. السماح للخلايا الالتزام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل وضعها في مهد RTCA (لتحسين توزيع متجانس من الخلايا). احتضان لوحات RTCA في المهد RTCA في الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2)، وبدء تسجيل البيانات الخاصة القادمة 24 ± 2 ساعة قبل الجرعات.
  2. التخفيفات من HPHCs والضوابط الإيجابية
    1. تحكم إيجابي التخفيف
      1. تمييع الحل الأسهم Staurosporine (10 ملم) 01:10 في DMSO (انظر الجدول 3) وإضافة 5 ميكرولتر من دilution إلى 195 ميكرولتر من المتوسطة للحصول على حل العمل 5X.
    2. HPHC التخفيف
      1. حل / تمييع كل HPHC في السيارة (الجدول 2) لإنشاء حل الأوراق المالية 1 م. تمييع كل حل الأسهم HPHC 01:10 في المتوسط ​​لتوليد حل 100 ملم.
      2. توليد "مجمع لوحة رئيسية" عن طريق إجراء خمس خطوات 1:10 التخفيف المتسلسل باستخدام المتوسطة + 10٪ السيارة للحصول على حلول العمل 5X (الشكل 2). ملاحظة: في نهاية المطاف، فإن الجرعات النهائية ستكون: 0.2 ميكرومتر، 2 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 0.2 ملم، 2 مم، 20 مم. كما تعد الجرعة 0، الموافق الوسيلة الوحيدة، في هذه الخطوة.
    3. الجرعات
      1. وقفة الصك RTCA وفتح المهد إلى إزالة لوحة.
      2. إزالة لوحة ووضعها في RTCA أداة درجات الحرارة لوحة (المصممة لتحقيق الاستقرار في درجة الحرارة من لوحة RTCA خلال الإجراءات التجريبية خارج RTCAالمحطة) لتجنب تبريد الخلايا، والتي يمكن أن تؤثر على قياس مقاومة.
      3. إضافة 25 ميكرولتر 5X حل من "لوحة المركبة سيد" إلى الخلايا في ثلاث نسخ الحفاظ على نفس الترتيب الجرعات كما هو الحال في لوحة رئيسية مجمع (أعلى جرعة في أعلى السيطرة التوالي ومركبة في الصف رقم 7) (الشكل 2). لا تقم بإزالة (100 ميكرولتر) زراعة الخلايا المتوسطة القائمة.
      4. إضافة 25 ميكرولتر 5X حل التحكم الإيجابي إلى الخلايا في الصف السفلي (النصف الأيمن) دون إزالة مستنبت القائمة. إضافة 25 ميكرولتر المتوسطة إلى الخلايا في الصف السفلي (نصف الأيسر) دون إزالة مستنبت الخلية الحالية.
      5. ختم اللوحة مع لوحة سداده. وضع لوحة مرة أخرى في مهد RTCA وقفله. البيانات إعادة تشغيل تسجيل لوقت التعرض المطلوب (على سبيل المثال، 24 ساعة). ملاحظة: استخدام هذا الفيلم تسرب ينصح لتجنب التلوث المحتملة، بما في ذلك أيضا إلى جانب انتقال التلوث.
    4. <قوي> تحليل البيانات RTCA وLD 50 حساب
      1. تصدير البيانات الخام كما نص (النص) أو ملف اكسل (.XLS). ملاحظة: سوف يحتوي الملف على كافة المعلومات المتعلقة تخطيط لوحة (التجمعات، الجرعات وموقف جيد). ويتم تنظيم القيم مؤشر الخلية الخام في 96 شكل جيد (يعكس التوزيع جيدا لوحة) ويتم توفيرها لكل نقاط الوقت الذي وقع فيه تسجيل. يرمز قيمة في موقف i في 96 لوحة جيدا في الوقت t بواسطة t CI (ط).
      2. تحديد بمثابة تطبيع مرجع آخر نقطة زمنية قبل الجرعات لكل منصب i في 96 لوحة جيدا (على سبيل المثال، مؤشر الخلية في 23 ساعة 50 دقيقة 00 ثانية في المركز الأول، CI ر (ط) = 23: 50: 00 = CI المرجع (ط)). ملاحظة: يجب أن المشروح هذه المعلومات عندما يتم تنفيذ الجرعات.
      3. الفجوة، على قاعدة جيدة، كل القيم نقطة زمنية من الإشارة التطبيع على تطبيع جميع القيم في الوقت الجرعات. قيمة تطبيع في positioني في 96 لوحة جيدا في الوقت t راشي NCI ر (ط)، وبالتالي يحددها NCI ر (ط) = ر CI (ط) / CI الرقم (ط) لجميع ر.
      4. حساب المساحة تحت منحنى (AUC) في 24 ساعة بعد الجرعات لكل عينة ط (موقف i في 96 لوحة جيدا)، بما في ذلك المناصب للسيطرة الإيجابية والمركبات.
        1. الحصول مفوضية الاتحاد الأفريقي في موقف يتم الحصول عليها عن طريق جمع ط مجالات كل مستطيل، كل مستطيل يجري بين اثنين timepoints تدل كتبها ر ك و ر ل (ر ك <ر ل). حساب كل منطقة المستطيل باستخدام س * ص مع x = ر ل - ر ك كونها المسافة بين اثنين من timepoints و y كونها متوسط ​​النشاط اثنين من timepoints (ذ = (TK NCI (ط) + NCI ليرة تركية (ط)) / 2).
          ملاحظة: الجامعة الأمريكية بالقاهرة في 24 ساعة بعد الجرعات لموقف يرمز لي من قبل الجامعة الأمريكية بالقاهرة (ط). كما ومطلي جميع الشروط في الآبار ثلاث نسخ يتم استخدام متوسط ​​القيم الثلاث.
        5. <لى> تطبيع القيم باستخدام المعادلة التالية:
        المعادلة 1
        حيث أنا هو الموقف في 96 لوحة جيدا والتي تم حسابها الجامعة الأمريكية بالقاهرة في 24 ساعة بعد الجرعات،
        السيارة هي متوسط ​​قيم AUC لآبار مركبة على لوحة في 24 ساعة بعد الجرعات،
        السيطرة الإيجابية هي متوسط ​​قيم AUC لآبار مراقبة إيجابية على طبق من ذهب في 24 ساعة بعد الجرعات،
        CR هو قيمة تطبيع متوسط ​​المطلوب للسيارة (0٪)، و
        SC هو قيمة تطبيع متوسط ​​المطلوب لعناصر إيجابية (-100٪)
        ملاحظة: في نهاية هذه الخطوة، يتم الحصول على مجموعة البيانات التي تحتوي على، لكل منصب i في 96 لوحة جيدا، وCI التركيز (في وحدات لوغاريتمي) التي يتم تطبيقها على عينة الواردة في موقف / ط جيدا وفي المقابلة الجامعة الأمريكية بالقاهرة تطبيع في 24 ساعة بعد إعطاء الجرعة AUC_normalizإد (ط).
      5. مؤامرة وتناسب (ج ط، AUC_normalized (ط)) -values ​​باستخدام 4 معلمات هيل المعادلة. عندما يكون ذلك ممكنا، أيضا حساب LD 50.
        المعادلة 2
        حيث Y = AUC_normalized،
        صفر آخر S مستوى 0 = آخر في تركيز الصفر من اختبار مركب،
        اللانهائي آخر S مستوى الوقود النووي المشع = آخر في تركيز لا حصر له،
        AC50 = تركيز على النشاط الذي يصل 50٪ من الحد الأقصى،
        هيل معامل ن = قياس المنحدر في AC50، و
        ج = تركيز في وحدات لوغاريتمي الموافق القيم على محور س منحنى مؤامرة الاستجابة للجرعة.
        ملاحظة: AC50 يتوافق مع LD 50 (المقايسات السمسة). وهو مقياس لقوة حيث تشير القيم المنخفضة رجولية عالية.

3. قياس السمية تأثيرات كتبها HCS

ملاحظة: ما مجموعه تسع علامات متعددة حدودي السمية، مجمعة في ستة فحوصات مختلفة يتم قياسها، وذلك باستخدام منصة HCS (الجدول 1). ويعرف استنادا إلى تحليل بقاء الخلية RTCA (القسم 2) مجموعة جرعة من كل التأسيسية ويتم تضمين الجرعة المرجعية 3R4F أيضا. الجرعة المرجعية ما يعادل مبلغ HPHC موجودة في الدخان من عصا واحدة من 3R4F إشارة السجائر.

  1. خلايا NHBE بذر
    1. إعداد تعليق خلية في 120،000 خلية / مل (± 5٪) وإضافة تعليق الخلية 100 ميكرولتر لكل بئر من لوحة HCS 96-جيدا (12000 خلية / جيد). إعداد ما يكفي من لوحات لتقييم جميع المقايسات (السمسة، الحمض النووي من التلف، كيناز الإجهاد، ROS، المحتوى GSH وموت الخلايا المبرمج) وtimepoints (4 و 24 ساعة).
    2. ترك لوحات HCS في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على الآبار وثم احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ± 2 ساعة قبل الجرعات.
  2. التخفيف من HCHPs والضوابط الإيجابية
    ملاحظة: الخلايا NHBE في لوحات HCS سيتم مداوي بإضافة 25 ميكرولتر من الحلول عينة الاختبار إلى 100 ميكرولتر من المتوسطة موجودة بالفعل في كل بئر. لذلك، يتم إعداد كل جرعة في 5X التركيز النهائي المطلوب.
    1. الضوابط الإيجابية التخفيف (التحكم إيجابي بلايت)
      1. الاستغناء عن 40 ميكرولتر من محلول المخزون من كل مراقبة إيجابية (انظر الجدول 3) في العمود رقم 2 (الشكل 4A، الآبار المظللة باللون الأحمر). الاستغناء عن 20 ميكرولتر من مركبة في الأعمدة رقم 3 ورقم 5 (الشكل 4A، الآبار مظللة باللون الأزرق الفاتح) و 40 ميكرولتر من المركبات في العمود رقم 4 (الشكل 4A، الآبار مظللة باللون الأزرق الفاتح).
      2. سحب 12 ميكرولتر من الآبار في العمود رقم 2، موزعة على الآبار في العمود رقم 3 ومزيج (الشكل 4B)، تستمر حتى التخفيف التسلسلي النهائي مع 3 جرعات (D1، D2، و D3) وسيارة (V) ​​لكل مركب السيطرة إيجابي يتم الحصول عليها (الشكل 4C). لإنشاء لوحة تحكم إيجابية، وإعداد 1:40 التخفيف من المركبات في وسائل الإعلام (الشكل 4D).
    2. HPHC التخفيف (مجمع سيد بلايت)
      ملاحظة: يتم سرد نطاقات جرعة محددة من HPHCs لHCS في الجدول 2.
      1. تمييع كل حل الأسهم HPHC (1 M) 01:10 في المتوسط ​​لتركيز 100 مم. أداء التخفيفات باستخدام المتوسطة مع سيارة 10٪ للحصول على جرعات 5X المختارة لكل HPHC.
  3. الجرعات
    1. إضافة 25 ميكرولتر من الحلول 5X من لوحة رئيسية مركب إلى الخلايا في ثلاث نسخ الحفاظ على نفس الترتيب الجرعات كما هو الحال في لوحة رئيسية مجمع (أعلى جرعة في أعلى السيطرة التوالي ومركبة في الصف رقم 7) (الشكل 5). لا تقم بإزالة هxisting (100 ميكرولتر) مستنبت الخلية.
    2. إضافة 25 ميكرولتر من 5X الحل من لوحة تحكم إيجابية إلى الخلايا في الصف السفلي الحفاظ على نفس الترتيب الجرعات كما هو الحال في لوحة تحكم إيجابية (الشكل 5). لا تقم بإزالة (100 ميكرولتر) زراعة الخلايا المتوسطة القائمة. ملاحظة: كل فحص لديه تحكم إيجابية محددة؛ انظر الجدول 3. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ لمدة التعرض المطلوبة (4 أو 24 ساعة).
  4. تلطيخ
    1. إعداد لجميع فحوصات
      1. قبل تدفئة العازلة غسل (PBS) الحلول عند 37 درجة مئوية.
      2. تحضير محلول التثبيت (4٪ محلول الفورمالديهايد) مضيفا 10.81 مل من 37٪ الفورمالديهايد إلى 89.19 مل من غسل العازلة وقبل دافئ أنه عند 37 درجة مئوية.
      3. إعداد المخزن المؤقت Permeabilization بإضافة 10 مل من العازلة 10X permeabilization إلى 90 مل من غسل العازلة وقبل دافئ أنه عند 37 درجة مئوية.
      4. إعداد BLOعازلة cking وب بإضافة 10 مل من 10X عازلة تمنع إلى 90 مل من غسل العازلة وقبل دافئ أنه عند 37 درجة مئوية.
      5. قبل تدفئة مستنبت الخلية عند 37 درجة مئوية.
      6. إزالة لوحات HCS من الحاضنة مرة واحدة وصلت مرات التعرض ساعة 4 و 24 وتنفيذ البروتوكولات المحددة التالية لكل فحص.
    2. سمية الخلايا الفحص
      1. إعداد كمية كافية (V) من لايف تلطيخ خلية الحل وفقا للمعادلة التالية: حجم متوسط ​​(ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار)
      2. تخفيف الصبغة الميتوكوندريا في لايف الحل تلطيخ خلية وفقا لتعليمات البائع. تمييع صبغة نفاذية الأغشية في لايف الحل تلطيخ خلية وفقا لتعليمات البائع.
      3. إضافة 50 ميكرولتر الخلية الحية حل تلطيخ على كل جانب من لوحة (ق) المعين "السمسة مقايسة". لا تقم بإزالة مستنبت الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO
      4. نضح بلطف الحل المتوسطة وتلطيخ وإضافة 100 ميكرولتر / بئر حل التثبيت على كل جانب، ثم احتضان لوحة (ق) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      5. نضح بلطف الحل تثبيت ويغسل مرة واحدة مع 100 ميكرولتر / جيد غسل العازلة.
      6. إزالة غسل العازلة وإضافة 100 ميكرولتر / العازلة permeabilization 1X جيدا إلى كل بئر واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      7. عازلة نضح permeabilization ولوحة غسل مرتين مع 100 ميكرولتر / بئر غسل العازلة.
      8. نضح غسل العازلة وإضافة 100 ميكرولتر من 1X عازلة تمنع على كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      9. إعداد كمية كافية (V) الابتدائية الجسم المضاد الحل وفقا للمعادلة التالية: حجم عازلة تمنع (ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار). تمييع C المضادة للأجسام المضادة السيتوكروم (الماوس) 1: 250 في الابتدائية الجسم المضاد الحل.
      10. نضح عرقلة العازلة لد إضافة 50 ميكرولتر / جيد الابتدائية الجسم المضاد الحل إلى كل بئر واحتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      11. إعداد كمية كافية (V) من الأجسام المضادة الثانوية والحل النووية وفقا للمعادلة التالية: حجم عازلة تمنع (ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار). تمييع الأضداد المضادة للماوس 1: 500 في الجسم المضاد الثانوي والحل النووية. تخفيف الصبغة النووي 1: 1000 في الجسم المضاد الثانوي والحل النووية.
      12. نضح الابتدائية الجسم المضاد الحل ولوحة غسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / بئر غسل العازلة تستخدم غسالة لوحة.
      13. نضح غسل العازلة وإضافة 50 ميكرولتر / بئر الجسم المضاد الثانوي والحل النووية إلى كل بئر من لوحة (ق)، واحتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      14. نضح الثانوية الأجسام المضادة والحل النووية ولوحة غسل ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / بئر غسل العازلة تستخدم غسالة لوحة. إضافة 100 ميكرولتر / بئر غسل العازلة. لوحة (ق) هو (هي) الآنعلى استعداد ليتم تقييمها على القارئ HCS.
    3. الحمض النووي الأضرار الفحص
      1. نضح بلطف المتوسطة من لوحات المعين "الحمض النووي من التلف".
      2. أداء نفس الخطوات كما هو موضح في تسلسل: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. لاحظ أنه في هذه الحالة، يتم إزالة المتوسطة فقط خلال خطوة 3.4.2.4.
      3. إعداد كمية كافية (V) الابتدائية الجسم المضاد الحل وفقا للمعادلة التالية: حجم عازلة تمنع (ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار)
      4. تمييع H2AX الأجسام المضادة لمكافحة الفوسفات (الماوس) 1: 2000 في الابتدائية الجسم المضاد الحل.
      5. تنفيذ الخطوة نفسها كما هو موضح في 3.4.2.10.
      6. إعداد كمية كافية (V) من الأجسام المضادة الثانوية والنووية الحل وفقا للمعادلة التالية: حجم عازلة تمنع (ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار)
      7. تمييع الأضداد المضادة للماوس 1: 500 في الجسم المضاد الثانوي والحل النووية.
      8. تمييع Nucleaص صبغ 1: 1000 في الجسم المضاد الثانوي والحل النووية.
      9. أداء نفس الخطوات كما هو موضح في تسلسل: 3.4.2.12-3.4.2.14.
    4. الإجهاد كيناز الفحص
      1. نضح بلطف المتوسطة من كل من لوحات المعين "الإجهاد كيناز".
      2. أداء نفس الخطوات كما هو موضح في تسلسل: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. لاحظ أنه في هذه الحالة، يتم إزالة المتوسطة فقط خلال خطوة 3.4.2.4.
      3. إعداد كمية كافية (V) الابتدائية الجسم المضاد الحل وفقا للمعادلة التالية: حجم عازلة تمنع (ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار)
      4. تمييع مكافحة الفوسفات cJun الأجسام المضادة (أرنب) 1: 200 في الابتدائية الجسم المضاد الحل.
      5. تنفيذ الخطوة نفسها كما هو موضح في 3.4.2.10.
      6. إعداد كمية كافية (V) من الأجسام المضادة الثانوية والنووية الحل وفقا للمعادلة التالية: حجم عازلة تمنع (ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار)
      7. تخفيف المضادة للأرنب الضد 1: 500 في الجسم المضاد الثانوي والحل النووية.
      8. تخفيف الصبغة النووي 1: 1000 في الجسم المضاد الثانوي والحل النووية.
      9. أداء نفس الخطوات كما هو موضح في تسلسل: 3.4.2.12-3.4.2.14.
    5. ROS الفحص
      1. إعداد كمية كافية (V) من لايف الحل تلطيخ خلية وفقا للمعادلة التالية: حجم متوسط ​​(ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار).
      2. تخفيف الصبغة ROS في الخلية الحية تلطيخ الحل وفقا لتعليمات بائع
      3. تخفيف الصبغة النووي 1: 1000 في الخلية الحية تلطيخ Solution.3.4.5.4) إضافة 50 ميكرولتر تلطيخ الخلية الحية الحل في كل لوحات جيدا المعين "روس". لا تقم بإزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      4. نضح بلطف الحل المتوسطة وتلطيخ وغسل لوحة ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / بئر المتوسطة.
      5. نضح المتوسطة، إضافة 100 _6؛ ل / جيد حل التثبيت على كل بئر واحتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      6. نضح بلطف الحل تثبيت وغسل لوحة ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / جيد غسل العازلة.
      7. إضافة 100 ميكرولتر / جيد غسل العازلة. لوحة (ق) هو (هي) الآن جاهزة.
      8. تقييم لوحة على القارئ HCS حدود 1 ساعة.
    6. GSH الفحص المحتوى
      1. إعداد كمية كافية (V) من الخلية الحية تلطيخ الحل النووية وفقا للمعادلة التالية: حجم متوسط ​​(ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار).
      2. تخفيف الصبغة النووية (الاقصى الأحمر) 1: 1000 في الخلية الحية النووية تلطيخ Solution.3.4.6.3). إضافة 50 ميكرولتر من الخلية الحية تلطيخ الحل النووية إلى كل بئر من لوحات المعين "محتوى GSH". لا تقم بإزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
      3. إعداد كمية كافية (V) من الخلية الحية GSH تلطيخ الحل وفقا لالمعادلة التالية: حجم HBSS (ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار)
      4. تخفيف الصبغة GSH في الخلية الحية GSH تلطيخ الحل وفقا لتعليمات البائع.
      5. نضح بلطف الحل تلطيخ النووي المتوسطة ووغسل لوحة ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / بئر المتوسطة.
      6. نضح المتوسطة وإضافة 100 ميكرولتر / بئر خلايا الحية GSH تلطيخ حل لكل بئر من لوحة (ق).
      7. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لوحة (ق) هو (هي) الآن جاهزة.
      8. تقييم لوحة (ق) على القارئ HCS حدود 1 ساعة.
    7. موت الخلايا المبرمج الفحص
      1. إعداد كمية كافية (V) من لايف الحل تلطيخ خلية وفقا للمعادلة التالية: حجم متوسط ​​(ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار).
      2. تخفيف الصبغة كاسباس 1: 300 في الخلية الحية تلطيخ الحل.
      3. إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية، إضافة 50 ميكرولتر تلطيخ الخلية الحية الحل في كل بئر من ركان لوحة (ق) المعين "موت الخلايا المبرمج" واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
      4. إعداد كمية كافية (V) من الخلية الحية تلطيخ الحل النووية وفقا للمعادلة التالية: حجم حل فيكس (ميكرولتر) V = 50 × عرض × 1.2 (W عدد من الآبار).
      5. تخفيف الصبغة النووي 1: 1000 في الخلية الحية تلطيخ الحل النووية.
      6. إزالة يعيش حل الخلية تلطيخ، إضافة 100 ميكرولتر / بئر خلايا الحية النووية تلطيخ حل لكل بئر من لوحة (ق)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      7. نضح تثبيتي / محلول الصبغة النووي وغسل لوحة (ق) ثلاث مرات مع 100 ميكرولتر / يغسل جيدا العازلة.
      8. إضافة 100 ميكرولتر / جيد غسل العازلة. لوحة (ق) هو (هي) الآن جاهزة.
      9. تقييم لوحة (ق) على القارئ HCS.
  5. تحليل البيانات HCS
    1. تصدير البيانات الأولية في ملف اكسل (.XLS). ملاحظة: يتم تنظيم القيم مؤشر الخلية الخام في شكل 96 جيدفي (يعكس التوزيع جيدا لوحة) ويتم توفيرها لكل نقطة نهاية في معين نقطة زمنية ما بعد الجرعات.
    2. تطبيع القيم باستخدام المعادلة التالية:
      المعادلة 3
      أين يمكنني هي قيمة إشارة الخام قياس بئر،
      السيارة هي متوسط ​​القيم إشارة قياس لآبار مركبة على طبق من ذهب،
      CR هو قيمة تطبيع متوسط ​​المطلوب للسيارة (0٪)، و
      SC هو قيمة تطبيع متوسط ​​المطلوب لعناصر إيجابية (100)،
      ملاحظة: في نهاية هذه الخطوة، يتم الحصول على مجموعة البيانات التي تحتوي على، لكل منصب i في 96 لوحة جيدا، وتركيز ج ط (في وحدات لوغاريتمي) التي تم تطبيقها على عينة الواردة في موقف / ط جيدا ولها المقابلة تطبيع إشارة N (ط).
    3. مؤامرة وتناسب (ج ط، N (ط)) - القيم باستخدام 4 معلمات هيل المعادلة.
      المعادلة 4
      حيث صفر آخر S مستوى 0 = آخر في تركيز صفر اختبار مركب،
      اللانهائي آخر S مستوى الوقود النووي المشع = آخر في تركيز لا حصر له،
      AC50 = تركيز على النشاط الذي يصل 50٪ من الحد الأقصى،
      هيل معامل ن = قياس المنحدر في AC50، و
      ج = تركيز في وحدات لوغاريتمي الموافق القيم على محور س منحنى مؤامرة الاستجابة للجرعة.
      ملاحظة: AC50 هو مقياس قوة حيث تشير القيم المنخفضة رجولية عالية.

Representative Results

RTCA

لأن في النهاية HCS لا تكون مفيدة عندما يتم الكشف عن أي تأثير سام، وانخفضت هذه المركبات لا تظهر خلية الجدوى يصل إلى أعلى تركيز في RCTA لم يتم اختبارها من قبل HCS (الشكل 3B، ج، د، ز، ك، ل، م ، ع). مركبات الاداء انخفض بقاء الخلية على فقط على أعلى تركيز (الشكل 3E، س) وإلغاء تحديد أيضا لHCS. وأخيرا، يتم اختيار فقط المكونات مع LD محسوب 50 (<20 مم) لمزيد من التحليل HCS (الشكل 3A، و، ح، ي، ن). HPHCs تلبية المعايير المذكورة أعلاه هي: 1-aminonaphtalene، الزرنيخ (V) والكروم (VI)، Crotonaldehyde والفينول.

HCS

ونتيجة لفحص الجودة (QC)، والضوابط الإيجابية فايتحليل RST لضمان إجراء تلطيخ تتم بشكل صحيح. وتظهر الصور التمثيلية الخلايا المعالجة مراقبة إيجابية في الشكل (6). القيم البيانات هي طبيعية إلى السيارة كما هو موضح سابقا. يتم رسم منحنيات لا الجرعة والاستجابة كما يتم اختبار الجرعات الثلاث فقط ولا تعتبر جميع الجرعات الثلاث في كل مرة نقطة. ويتم اختيار الجرعات مراقبة إيجابية (على أساس التجارب السابقة، لا تظهر البيانات) بحيث لوحظ الردود المناسبة لكل نقطة النهاية في كل 4 ساعات و 24 ساعة. في جرعات معينة تستخدم 1 و 2 لتقييم تأثير في 4 ساعات في حين تستخدم جرعات 2 و 3 لتقييم تأثير على مدار 24 ساعة. يتم تجاهل لوحات إذا لوحظ أي رد لجرعات مراقبة إيجابية. لاحظ أن لكافة نقاط النهاية، إلا إمكانات غشاء الميتوكوندريا والمحتوى GSH، ومن المتوقع زيادة شدة إشارة.

جميع المركبات، باستثناء الفينول، يتسبب في pheno نخرية نوع، استنادا إلى زيادة نفاذية غشاء الخلية (الشكل 7A، و، ح، ل). 1-aminonaphtalene، الكروم (VI)، وقد تم تحديد Crotonaldehyde والفينول بأنها السمية الوراثية استنادا إلى زيادة الفسفرة من H2AX هيستون (الشكل 7E، ي، ن، ص). تم العثور على الفينول و1-aminonaphtalene للحث على ضعف الميتوكوندريا الشديد (الشكل 7B، س) والتي، مع 1-aminonaphtalene، أدى إلى زيادة إطلاق السيتوكروم C (الشكل 7C). توفير الكشف عن زيادة النشاط كاسباس 3/7 أدلة على الحدث أفكارك عند التعرض الكروم. تم الكشف عن الأكسدة الإجهاد الاستقراء (ROS أو GSH) أيضا على العلاج مع 1-aminonaphtalene، Crotonaldehyde والفينول (الشكل 7D، م، ف). وأخيرا، الزرنيخ يؤدي الى التوتر الخلية كما يتضح من زيادة الفسفرة من عامل النسخ cJun (الشكل 7G).

تحميل / 53987 / 53987fig1.jpg "/>
الشكل 1. مجمع توكس-التعريف سير العمل. أ) تخطيطي لسير العمل المتبعة في هذه الدراسة. أولا، تم إجراء تقصي جرعة المدى باستخدام منصة RTCA لتحديد الجرعات المناسبة لاحق HCS لتوصيف ملامح سمية مركب معين. ب) التصميم التجريبي للدراسة. 24 ساعة بعد الغرس، ومداوي الخلايا ومراقبة القيم مقاومة بشكل مستمر على مدى ال 24 ساعة التالية، في حين تم التحقيق HCS النهاية 4 و 24 ساعة بعد الجرعات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. RTCA التعرض لوحة. يتم إنشاء لوحة رئيسية مجمع سكني لأول مرة عن طريق إجراء خمس خطوات 1:10 التخفيف المتسلسل. كل مجمع،بما في ذلك السيطرة على السيارة (جرعة 0) ثم يتم إضافتها في ثلاث نسخ إلى لوحة تعرض جنبا إلى جنب مع المتوسطة وStaurosporine والضوابط. لاحظ أن جرعات يتم الاحتفاظ تسلسل على نقل، أعلى الجرعات في الصف رقم 1 في حين الضوابط السيارة هي في الصف رقم 7. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الممثل RTCA بقاء الخلية نتائج. أ) 1-aminonaphtalene، ب) 2-nitropropane، ج) أسيتاميد، د) الأسيتون، ه) مادة الأكريلاميد، و) الزرنيخ (V)، ز) البنزين، ح) الكروم (VI) ، ي) Crotonaldehyde، ك) ميثيل ايثيل الكيتون، ل) Nickeل (II)، م) نترات البنزين، ن) الفينول، س) الكينولين، ع) التولوين. في 24 ساعة بعد الجرعات، تم حساب المساحة تحت منحنى (AUC) لكل جرعة (بما في ذلك مراقبة إيجابية والمركبات) وتطبيع في نطاق من 0 إلى النشاط -100٪ (المحور الصادي)، حيث 0 يعكس نشاط السيارة و-100 لمراقبة إيجابية. ثم تم رسم القيم وتركيبها باستخدام أربعة المعلمة هيل المعادلة، وعندما يكون ذلك ممكنا، تم حساب LD 50. ويعبر عن التركيزات على نطاق وسجل (محور س). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. مخطط التخفيف لمركبات تحكم إيجابي للHCS فحوصات. أ) إضافة الضوابط الإيجابية وهاءhicle إلى التخفيف المتسلسل لوحة. ب) تخفيف المسلسل من الضوابط الإيجابية. ج) 200X الضوابط الإيجابية جرعات. دي) التخفيف من 200X جرعات الضوابط الإيجابية في (متوسطة 01:40) لتوليد لوحة تحكم إيجابية تحتوي على جرعات 5X. لاحظ أن كل جرعات غير المخفف في يثلث لتعكس التخطيط النهائي في لوحة التعرض). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. HCS التعرض لوحة. يتم إنشاء لوحة رئيسية مجمع سكني لأول مرة عن طريق إجراء تخفيف من خمس خطوات. ثم يتم إضافة كل مركب، بما في ذلك السيطرة على السيارة (جرعة 0) في ثلاث نسخ إلى لوحة تعرض جنبا إلى جنب مع الضوابط الإيجابية. لاحظ أن يتم الحفاظ على النظام الجرعات على نقل،أعلى الجرعات في الصف رقم 1 في حين الضوابط السيارة هي في الصف رقم 7. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. ممثل نيون صور من الأضداد أو صبغ صبغ الخلايا أ) المعلمات النووية - صبغ النووي: صبغة نفاذية الذي يربط الحمض النووي في الخلايا الحية أو الثابتة. وتستخدم هذه وصمة عار لتحديد الخلايا الفردية وصفها المنطقة النووية ب) نخر - غشاء الخلية نفاذية صبغ: الكشف على صبغ من سلامة غشاء الخلية. كاشف غير منفذ في جوهرها إلى غشاء الخلية. خلال نخر، الغشاء يصبح نفاذة وصبغ يدخل الخلية ويربط الحمض النووي إنتاج الفلورسنت قوية ليالي. ignal ج) موت الخلايا المبرمج - السيتوكروم C: الكشف على الأجسام المضادة من الإفراج السيتوكروم C، وهي السمة المميزة معروفة من موت الخلايا المبرمج في وقت مبكر. على استحثاث موت الخلايا المبرمج، يتم تحريرها السيتوكروم من الميتوكوندريا وينشر في نواة د) الحمض النووي الأضرار - pH2AX:. الكشف على الأجسام المضادة من الفسفرة من H2AX هيستون، وهي السمة المميزة المعروفة مزدوجة فواصل حبلا الحمض النووي ه) الإجهاد كيناز - cJun: الكشف على الأجسام المضادة من الفسفرة في سر-73 من cJun، وهي السمة المميزة معروفة من الضغط الخلوي و) الاكسدة - DHE: الكشف على صبغ من هذه الجزيئات. Dihydroethidium نفسها تتفلور الأزرق في السيتوبلازم في حين شكل إيثيديوم أكسدة تتفلور الأحمر على الحمض النووي إقحام ز) GSH - mBcl: الكشف على صبغ جزيئات GSH الحرة. mBcl يتفاعل مع GSH لتوليد منتج الفلورسنت عالية ح) موت الخلايا المبرمج - كاسباس 3/7 تنشيط: الكشف على صبغ من كاسباس 3/7 النشاط. الكاشف غير الفلورسنت مع الببتيد حمض أربعة الأمينية التي تمنع الحمض النووي ملزمة. عند تفعيل كاسباس 3/7، هو المشقوق الببتيد تمكين صبغ لربط الحمض النووي وإنتاج، والاستجابة الفلورة مشرق. لوحات BH تظهر الخلايا المعالجة مراقبة إيجابية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. ممثل HCS نتائج 1-aminonaphtalene (AE)، الزرنيخ (V) (و) و (ز) والكروم (VI) (هونج كونج)، Crotonaldehyde (قانون الجنسية) والفينول (أوك). 4 ساعات (الخط الأزرق) ووحسبت 24 ساعة (الخط البرتقالي) إشارات لكل جرعة وتطبيع النشاط السيارة (0٪). وتظهر القيم التي لم يتم تضمينها في منحنى الحسابية المناسب في الرمادي. ويعبر عن التركيزات على نطاق وسجل (محور س). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فحص نقطة النهاية # نقطة النهاية البيولوجية مقصورة الخلوية الإخراج ميزة
السمية الخلوية 1 كتلة الميتوكوندريا 6 السيتوبلازم متوسط ​​مساحة البقعة
2 الميتوكوندريا الغشاء إمكانية 6 السيتوبلازم بقعة متوسط ​​كثافة
3 الإفراج السيتوكروم C نواة متوسط ​​كثافة
4 نفاذية غشاء الخلية 8 نواة متوسط ​​كثافة
الحمض النووي من التلف 5 الفوسفات-H2AX 9 نواة متوسط ​​كثافة
الإجهاد كيناز 6 الفوسفات-cJun 10 نواة متوسط ​​كثافة
ROS 7 ROS 11 نواة متوسط ​​كثافة
محتوى GSH 8 GSH 12 السيتوبلازم بقعة متوسط ​​كثافة
موت الخلايا المبرمج 9 كاسباس 3 13 السيتوبلازم بقعة متوسط ​​كثافة

الجدول 1. قائمة HCS لssays والنهاية.

<td> 0.17
مركبة جرعات RTCA (ميكرومتر) LD 50 جرعات HCS
الخلية المحددة الجدوى (ميكرومتر) 3R4F (نانومتر)
1-Aminonaphtalene ETOH 20000 2000 200 20 2 0.2 280 ميكرومتر 2000 500 200 150 0.27
2-Nitropropane ETOH 20000 2000 200 20 2 0.2 > 20 ملم
اسيتاميد ETOH 20000 2000 200 20 2 0.2 > 20 ملم
الأسيتون ماء 20000 2000 200 20 2 0.2 > 20 ملم
مادة الأكريلاميد ماء 20000 2000 200 20 2 0.2 > 20 ملم
الزرنيخ (V) ماء 20000 2000 200 20 2 0.2 160 ميكرومتر 200 100 50 25
البنزين ETOH 20000 2000 200 20 2 0.2 > 20 ملم
الكروم (VI) ماء 20000 2000 200 20 2 0.2 20 ميكرومتر 100 50 20 10 0.06
Crotonaldehyde ماء 20000 2000 200 20 2 0.2 200 ميكرومتر 20000 2000 200 20 2000
ميثيل ايثيل كيتون ماء 20000 2000 200 20 2 0.2 >20 ملي
النيكل ماء 20000 2000 200 20 2 0.2 > 20 ملم
نترات البنزين ETOH 20000 2000 200 20 2 0.2 > 20 ملم
الفينول ETOH 20000 2000 200 20 2 0.2 2300 ميكرومتر 5000 2000 1000 500 240
الكينولين ETOH 20000 2000 200 20 2 0.2 > 20 ملم
التولوين ماء 20000 2000 200 20 2 0.2 > 20 ملم

ويسلط الضوء على الجدول 2. قائمة المركبات HPHC اختبار مع LD النسبي 50 في 24 ساعة من العلاج. مركبات المختارة للتحليل HCS في البرتقال وتعطى أيضا الجرعات التي تم اختبارها. الجرعة 3R4F ما يعادل كمية من الوجود الأساسي في الدخان من عصا واحدة من 3R4F إشارة السجائر.

فحص مركب حل الأسهم مذيب جرعة (ق) (ميكرومتر)
بقاء الخلية Staurosporine 10 ملي [دمس] 50
السمية الخلوية Valinomycin 10 ملي [دمس] 50 20 5
الحمض النووي من التلف ترابل 100 ملي [دمس] 500 200 50
الإجهاد كيناز Anisomycin 2 مم [دمس] 10 4 1
ROS روتنون 200 ملي [دمس] 1000 400 100
محتوى GSH حمض الإيثاكرينيك 200 ملي [دمس] 1000 400 100
موت الخلايا المبرمج Staurosporine 40 ملي [دمس] 200 </ td> 50 20

الجدول 3. قائمة الضوابط الإيجابية وتركيزات المستخدمة لكل الفحص.

Discussion

وقد نوقشت احتياجات بدائل التجارب على الحيوانات وأساليب جديدة عالية الإنتاجية اختبار على نطاق واسع خلال السنوات الماضية. وقد أدى ذلك العلماء والسلطات التنظيمية للتحقيق في طرق بديلة لاختبار السمية القياسي، وذلك باستخدام المقايسات الخلوية التي تحاكي بشكل وثيق في علم وظائف الأعضاء من الأنسجة المستهدفة. في هذه الدراسة، لقد أثبتنا مدى انطباق الجمع بين خلية محلل في الوقت الحقيقي (RTCA) مع منصة فحص المحتوى العالي (HCS) لتقييم تأثير التعرض للهيئات المكونة CS واحدة على الخلايا الظهارية رئة الإنسان. هذا الإعداد يمكن تطبيقها بالقياس لتقييم السمية الخلوية الناجمة عن مختلف الملوثات الأخرى المحمولة جوا، والجسيمات المحمولة جوا، والجسيمات النانوية. وعلاوة على ذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها يمكن أن تتطابق مع تلك من transcriptomics كامل الجينوم والطرق الحسابية القائمة على شبكات البيولوجية السببية. كما ذكرت سابقا، فإن هذا النهج سمح لنا لإثبات البيانات على المسار الجزيئياضطراب عند التعرض CS 5 مع نهايات HCS، ومعالجة هذه الاضطرابات الطريق أيضا ظاهريا.

كما فحص مخطط، ويوفر تحليل الخلية في الوقت الحقيقي خلية المعلومات المتعلقة الجدوى في قرار dose- وتعتمد على الوقت، والذي يسمح تحسين عملية صنع القرار التي جرعة ونقطة زمنية التعرض قد تكون مواتية لتحليل المصب 14. مبدأ محلل يعتمد على التغيرات في مقاومة الكهربائية المولدة من الخلايا مثلما نعلق وانتشار على سطح الثقافة جيدا مغطاة مسرى مكروي الذهب. يتم تحويل مقاومة في معلمة أبعاد اسمه خلية المؤشر، والتي يمكن استخدامها لمراقبة التصاق الخلية، ونشر، مورفولوجيا وفي نهاية المطاف الخلية قدرتها على البقاء. على الرغم من هذه التقنية لا توفر معلومات عن آليات السامة للخلايا، حساسيتها تمكن من الكشف عن التغيرات الخلوية المورفولوجية حتى في الجرعات المنخفضة جدا التي وHCS ليس بالمعلومات (لا تظهر البيانات). وبناء على PREVIتجارب الأوس، وقد لاحظنا أن منهجية RTCA غير قادرة على كشف التغيرات الشكلية في الجرعات المنخفضة مقارنة النهاية HCS.

وبعد الفحص الأولي مع الخلية محلل في الوقت الحقيقي، وكان يستخدم منصة HCS للحصول على معلومات أكثر تعمقا على نوع من السمية الخلوية التي تسببها كل HPHC. وHCS لوحة فحص سمح لمحة HPHCs نحو آثارها المحتملة على الأجزاء الخلوية / العضيات وكذلك لتحديد تلك التي تستقطب السمية الوراثية أو الأكسدة الإجهاد. وكشف تحليل الشخصية المتميزة بموجبه HPHCs اختيار لحث على السمية الخلوية في الخلايا NHBE. بشكل عام، فإن جميع المركبات، باستثناء الفينول وجدت، للحث على نخر في جرعات أعلى اختبارها. وانسجاما مع دور محتمل في تطور مرض السرطان 1-aminonaphtalene الفسفرة الناجم من H2AX كعلامة على السمية الجينية، ولكن لوحة HCS أيضا النشاط المكشوف من هذا HPHC في قراءات سمية الميتوكوندريا (زادت كتلة والسيتوكروم C releaحد ذاتها) والاكسدة (GSH نضوب). وبالمثل، كما هو موضح سابقا، تم تحديد الفينول للحث على ضعف الميتوكوندريا، وتسبب التلف في الحمض النووي، فضلا عن استنزاف الجلوتاثيون. الكروم (VI)، واحدة من مركبات تصنف أنا المسرطنة المجموعة، وCrotonaldehyde تم أيضا تحديد كل السمية كما، ولا سيما الكروم (VI) الخلايا التي يسببها أيضا (تفعيل تتالي كاسباس) وCrotonaldehyde تسبب زيادة توليد ROS. أخيرا الزرنيخ (الخامس)، وجدت للحث على cJun الفسفرة الذي هو علامة من تفعيل مسار الضغط كيناز.

في هذه الدراسة، ونحن استخدام الخلايا NHBE كنموذج للخلايا الظهارية الرئة في المختبر. باستخدام هذه الخلايا في إعداد HCS لم يسبق له مثيل، ومكن التحقيق من مجموعة واسعة من النهاية، بما في ذلك السمية الوراثية والاكسدة علامات. وقد وصفت كل من الخلية الحية والنهج خلية تلطيخ ثابتة ضمن بروتوكولات لدينا، مما يدل على مرونة تقنية الشاملة. في والفعل، يمكن تطبيق نفس البروتوكولات لمجموعة واسعة من الأهداف، والتي يمكن أن تعالج عن طريق استخدام أي صبغة الفلورسنت أو الأجسام المضادة. لتنفيذ الناجح لبروتوكولات تلطيخ الحية، فإنه من المهم احترام فترة حضانة، وبعض الأصباغ لديها محدودة نصف العمر وإشارة مضان قد يقلل من قبل الانتهاء من الحصول على الصور. ومن المهم أيضا أن تنظر أنه إذا تم استخدام نوع من الخلايا المختلفة، وجميع الشروط تلطيخ ينبغي إعادة تقييمها، وتركيز الصبغة الأمثل وفترة حضانة قد تكون مختلفة.

في هذه الورقة التي وصفناها سيناريو حيث مركبات خمس فقط حيث فحص مع منهجية HCS. النظر في تخطيط لوحة الموصوفة سابقا، كانوا مداوي أكثر من 2 مجموعات لوحة مختلفة عن ما مجموعه 24 لوحات (6 المقايسات و 2 نقاط الوقت) ويمكن أيضا أن تزيد. وعدد من لوحات، وبالتالي السماح للفحص في وقت واحد من أكثر المركبات أو والتحرياتtigation المزيد من النهاية. قبل القيام بذلك، ومع ذلك، ينبغي للمرء أن تأخذ في الاعتبار أن بعض النقاط الطرفية (GSH وROS) يتطلب اكتساب فوري، ونتيجة لذلك، يجب أن يتم تنفيذ الجرعات من لوحات بطريقة متداخلة للسماح اقتناء لوحة السابقة. من ناحية أخرى، وذلك باستخدام ثابت بروتوكول الخلية تلطيخ يمثل ميزة كما يمكن أن تكون مكدسة لوحات، ووقف على البروتوكول في أي خطوة بعد التثبيت، لاستكمال إجراءات تلطيخ في مرحلة لاحقة. هذا النهج، على سبيل المثال، من شأنه أن يوفر المشغل مع الوقت لاستكمال جميع ألواح الخلايا تلطيخ الحية دون المساس بنوعية البيانات.

لمزيد من تحسين سير العمل من خلال خفض عدد من لوحات، وسيكون أيضا من الممكن أن تعدد نقاط نهاية معا. على سبيل المثال في هذا السياق ضرر الحمض النووي والإجهاد كيناز يمكن أن يتم التحقيق معا ببساطة باستخدام اثنين من الأجسام المضادة الثانوية مع fluorochromes تنبعث منها في ج مختلفةhannels. والتطوير المستمر للمنصة HCS، بما في ذلك البذر مؤتمتة بالكامل الخلية، وتخفيف مركب، الجرعات وتلطيخ، فضلا عن إضافة النهاية الجديدة على توسيع قدرات منصة HCS كأداة التنميط قوية لHPHCs على الظهارية وأنواع الخلايا الأخرى .

Disclosures

كل الكتاب والعاملين في شركة فيليب موريس الدولية. فيليب موريس الدولية هي المصدر الوحيد للتمويل والراعي لهذا المشروع.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر Karsta Luettich وغريغوري Vuillaume لاستعراضها من المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader Thermo N01-0002B
xCelligence RTCA MP ACEA 05331625001
Screener (HCS) Genedata NA
CASY counter TTC Roche 05 651 719 001
e-Plates VIEW 96 ACEA 06 472 451 001
RTCA Frame 96 ACEA 05232392001
RTCA Cardio Temperature Tool ACEA 2801171
Plate sealer breathseal Greiner bio-one 676051
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) Lonza CC-2540 non-smoking 60-year-old Caucasian male donor 
BEGM BulletKit Lonza CC-3170 Warm at 37 °C before use
ReagentPack Subculture Reagents kit Lonza CC-5034 Warm at 37 °C before use
Penicillin/Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
Easy Flask filter cap 75 cm2 Thermo Scientific 12-565-349
96 well assay plate  black  Corning 3603
Hoechst 33342  Fisher Scientific PI-62249
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) Biostatus DR50200
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos Life technologies M-7512
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos Life technologies M-7513
ROS Dye: Dihydroethidium Sigma D7008
ROS Dye: CellROX Life technologies C10422
ROS Dye: MitoSOX Life technologies M36008
GSH Dye: Monochlorobimane Sigma 69899 Toxic
GSH Dye: Monobromobimane Life technologies M-1378 Toxic
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1  Life technologies Y3603 Irritating 
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1  Life technologies T3602 Irritating 
Membrane permeability Dye: TOTO-1  Life technologies T3600 Irritating 
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green Life technologies C10423 Irritating 
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) Thermo MA5-11823
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) Thermo MA5-15889
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) Thermo MA1-2022
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650  Abcam ab96878
10x permeabilization buffer Fisher 8408400
4% Formaldehyde solution Sigma F1635 Toxic
10x blocking buffer Fisher 8408500
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Sigma D8537
Hanks' Balanced Salt solution Sigma H8264
Staurosporine Sigma S4400 Toxic
Valinomycin Sigma V0627 Toxic
Paraquat Sigma 36541 Toxic
Anisomycin Sigma A9789 Toxic
Ethacrynic acid Sigma E4754 Toxic
1-Aminonaphthalene Sigma 34390 Toxic
2-Nitropropane Sigma 130265 Toxic
Acetamide Sigma 695122 Toxic
Acetone Sigma 650501 Toxic
Acrylamide Sigma A9099 Toxic
Arsenic (V) Sigma A6756 Toxic
Benzene Sigma 12540 Toxic
Chromium (VI) Sigma 216623 Toxic
Crotonaldehyde Sigma 262668 Toxic
Methyl ethyl ketone Sigma 34861 Toxic
Nickel  Sigma 203866 Toxic
Nitrobenzene Sigma 48547 Toxic
Phenol Sigma P5566 Toxic
Quinoline Sigma 241571 Toxic
Toluene Sigma 34866 Toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
  3. Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
  4. US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
  5. Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
  6. Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
  7. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
  10. Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
  11. Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
  12. Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
  13. Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
  14. Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 111، وفحص عالية المحتوى، ونظم علم السموم، وخلايا عادية الإنسان الشعبي طلائي، الحمض النووي من التلف، والإجهاد الخليوي، مكونات دخان
عالية تحليل فحص المحتوى لتقييم الآثار السمية للمكونات الضارة والمؤذية يحتمل (HPHC)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marescotti, D., Gonzalez Suarez, I., … More

Marescotti, D., Gonzalez Suarez, I., Acali, S., Johne, S., Laurent, A., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC). J. Vis. Exp. (111), e53987, doi:10.3791/53987 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter